1. Présentation générale
Les ATPases de type P1B sont une sous-famille d’ATP ases de type P impliquées dans le
transport de métaux comme les ions Cu+, Ag+, Cu2+, Cd2+, Zn2+, Pb2+, Co2+. Elles ont un rôle crucial dans l’homéostasie ainsi que la biotolérance de ces métaux.
Les ATPases de type P1B contiennent de 6 à 8 hélices transmembranaires prédites. Elles sont
caractérisées par une séquence signature CPC, CPH, CPS, SPC, TPC dans le 6ème segment transmembranaire (Figure 9). Ces protéines peuvent aussi contenir un ou plusieurs domaines de liaison aux métaux placés en N et C-terminal (N-MBD et C-MBD respectivement). Ces domaines de liaison aux métaux peuvent être composés d’un motif consensus CXXC ou d’une séquence riche en histidines.
Figure 9 : Représentation schématique d’une ATPase de type P1B.
Ces protéines contiennent 6 à 8 hélices transmembranaires prédites (H1-H8), la séquence DKTGT, une signature CPC, CPH, CPS, SPC, TPC spécifique des ATPases de type P1B dans leur 6ème hélice
transmembranaire. Elles peuvent aussi contenir un ou plusieurs domaines de liaison aux métaux en N et C-terminal.
Données bibliographiques
23 Des données expérimentales montrent que les ATPases de type P1B fonctionnent aussi selon le
modèle E1-E2 décrit précédemment (Figure 8), avec un changement de conformation entre les états E1 et E2 (Okkeri et al., 2002; Mandal et al., 2002).
Ces ATPases ont été classées en 6 sous groupes par Argüello (2003). Cette étude se base sur l’analyse de la séquence de 234 ATPases de type P1B et notamment sur les résidus conservés
dans les hélices transmembranaires. Cette classification permet de prédire la sélectivité ionique de ATPases de type P1B à partir des séquences consensus.
2. Caractéristiques structurales des sous-groupes des ATPases de type P1B
a) Le sous-groupe P1B1
Dans ce sous groupe, nous trouvons des ATPases très bien caractérisées comme les protéines ATP7A et ATP7B impliquées dans les maladies de Menkes et de Wilson chez l’homme et l'ATPase CopA d’Archaeoglobus fulgidus.
Des expériences de transport et de tests d’activité enzymatique montrent que ces ATPases transportent du cuivre sous forme 1+. Elles seraient aussi activées par l’ion Ag+. Les protéines de ce sous-groupe sont très diverses en terme de taille (650 à 1500 aa) du fait de la présence d’un nombre variable de N-MBD de type MXCXXC. Toutes ces protéines semblent contenir 8 hélices transmembranaires, la grande boucle se situant entre les hélices transmembranaires H6 et H7. Elles possèdent la séquence CPC(X)6P dans la 6e hélice transmembranaire (Figure 10).
Arabidopsis thaliana possède 4 ATPases de type P1B-1 : HMA5, HMA6/PAA1,
HMA7/RAN1 et HMA8/PAA2.
Figure 10 : Représentation schématique des ATPases de type P1B-1.
La boite noire représente le N-MBD composée d’un motif CXXC.
Les acides aminés des hélices transmembranaires pouvant jouer un rôle dans la sélectivité vis-à-vis de l’ion sont indiqués dans les rectangles blancs.
Image issue de Argüello, 2003.
b) Le sous-groupe P1B2
D’après les résultats expérimentaux obtenus, ces protéines transporteraient du zinc, du cadmium et du plomb. Ces ATPases sont trouvées chez les archaebactéries, les procaryotes et uniquement chez les plantes dans le règne eucaryote. Le génome d’Arabidopsis thaliana code pour 3 ATPases de type P1B-2 : HMA2, HMA3 et HMA4. Les ATPases appartenant au sous-
Données bibliographiques
24 groupe 1B2 contiennent une séquence consensus de type CPC(X)4[S/T]XP dans leur 6ème
hélice transmembranaire. Cette séquence est très similaire aux ATPases du sous-groupe 1B1. Elles possèdent aussi dans l'hélice H8 la séquence consensus NX(7)KX(10,20)DXGX(7)N. L'extrémité N-terminale de ces protéines contient 100 à 150 acides aminés. La plupart de ces enzymes contiennent 1 (et exceptionnellement 2) N-MBD contenant une séquence CXXC. Comme pour les protéines du sous-groupe 1B1, ce N-MBD semble avoir un rôle dans la régulation de l'activité de l'enzyme. Le N-MBD peut aussi être composé d’une séquence de type (HX)n (n=2 ou 3). Des protéines de ce sous groupe peuvent contenir les deux types de N-
MBD (Figure 11).
Figure 11 : Représentation schématique des ATPases de type P1B-2.
La boite noire représente le N-MBD composée d’un motif CXXC. La boite hachurée représente le N-MBD riche en histidines.
Les acides aminés des hélices transmembranaires pouvant jouer un rôle dans la sélectivité vis-à-vis de l’ion sont indiqués dans les rectangles blancs.
Image issue de Argüello, 2003.
c) Le sous-groupe P1B3
Le groupe 1B3 regroupe les protéines contenant un motif CPH dans l'hélice transmembranaire H6, des séquences uniques dans les hélices H7 et H8, ainsi qu'un N-MBD riche en histidines. Ce sous-groupe ne contient pas de protéines eucaryotes. L'ATPase CopB d'Enterococcus Hirae a été la première caractérisée dans ce groupe. Elle transporterait du cuivre sous forme 1+ et de l’argent (Solioz & Odermatt, 1995). D'autres études réalisées sur l'homologue CopB d'Archaeoglobus fulgidus suggèrent que cette ATPase transporterait aussi du cuivre sous forme 2+ (Mana-Capelli et al., 2003).
La séquence NX(5)GYNX(4)PX(10,20)PX(6)MSXSTX(5)N est la signature de ces ATPases.
Figure 12 : Représentation schématique des ATPases de type P1B-3.
La boite hachurée représente le N-MMBD riche en histidines.
Les acides aminés des hélices transmembranaires pouvant jouer un rôle dans la sélectivité vis-à-vis de l’ion sont indiqués dans les rectangles blancs.
Données bibliographiques
25 d) Le sous-groupe P1B4
Comme pour les ATPases de type P1B-2, seules les plantes parmi les eucaryotes contiennent
des ATPases de ce sous-groupe. Ces ATPases sont plus petites que celles des autres sous groupes, elles ne contiennent que 6 à 7 hélices transmembranaires prédites. Excepté deux ATPases (dont HMA1), elles ne contiennent pas de N-MBD. Le domaine de coordination dans l'hélice H6 est formé d’un motif SPC. L'hélice H8 contient une séquence signature HEG[GS]T(X)5[NS][GSA] (Figure 13).
Seulement deux ATPases de ce groupe ont été étudiées. L'ATPase CoaT de Synechocystis serait impliquée dans le transport du cobalt (Rutherford et al., 1999). L'ATPase d'Arabidopsis,
HMA1, pourrait transporter du cuivre du zinc, du cadmium, du cobalt et du calcium
(Seigneurin-Berny et al., 2006, Moreno et al., 2008). La spécificité ionique des ATPases de ce groupe n'est donc pas totalement définie, elles pourraient être impliquées dans le transport d'ions divalents.
Figure 13 : Représentation schématique des ATPases de type P1B-4.
Les acides aminés des hélices transmembranaires pouvant jouer un rôle dans la sélectivité vis-à-vis de l’ion sont indiqués dans les rectangles blancs.
Image issue de Argüello, 2003.
e) Le sous-groupe P1B5
Ce sous-groupe ne contient pour l'instant que 5 ATPases d'origine procaryote. Elles contiennent la séquence consensus TPCP(X)5P au niveau de l'hélice H6 et 6 hélices transmembranaires prédites (Figure 14). A ce jour aucune étude n’a porté sur des ATPases de ce sous-groupe et leur spécificité ionique est encore inconnue.
Figure 14 : Représentation schématique des ATPases de type P1B-5.
Les acides aminés des hélices transmembranaires pouvant jouer un rôle dans la sélectivité vis-à-vis de l’ion sont indiqués dans les rectangles blancs.
Données bibliographiques
26 f) Le sous-groupe P1B6
Ce sous-groupe contient toutes les ATPases qui ne sont pas contenues dans les 5 autres sous- groupes. Ces protéines contiennent les caractéristiques structurales des ATPases de type P1B :
Un site de phosphorylation cytoplasmique DKTGT, une séquence APC, CPC ou CPS en H6. Cependant, elles présentent des séquences distinctes en H7 et H8. A ce jour, aucune étude portant sur ces ATPases n’a été réalisée, ne permettant donc pas de déterminer la sélectivité ionique de ces enzymes. Elles présentent 30 à 40 % d'homologies avec les autres ATPases de type P1B.
3. Les ATPases de type P1B d'Arabidopsis thaliana
Chez Arabidopsis, huit ATPases de type P1B ont été identifiées et caractérisées (Tableau 3).
Les ATPases HMA5, 6, 7 et 8 appartiennent au groupe P1B-1 et sont impliquées dans le
transport du cuivre au niveau de la membrane plasmique, du réticulum endoplasmique et des membranes du chloroplaste (Andrés-Colás et al., 2006; Woeste & Kieber, 2000; Abdel- Ghany et al, 2005). HMA7 est impliquée dans la voie de signalisation de l'éthylène. En effet, cette ATPase permettrait le transport du cuivre dans un compartiment post-Golgi où le cuivre est ensuite incorporé dans la forme apoprotéine du récepteur à l'éthylène. HMA7 serait aussi impliquée dans l'élongation cellulaire (Woegel & Kieber, 2000). L'expression de HMA5 est fortement induite par le cuivre et les mutants d'insertion hma5 sont hypersensibles au cuivre. Ces données suggèrent que HMA5 aurait un rôle dans la détoxification de la cellule (Andrés- Colás et al., 2006). HMA6 et HMA8 sont localisées respectivement dans l'enveloppe et les thylacoïdes des chloroplastes (voir ci-dessous pour leur description).
Les ATPases HMA2, 3 et 4 appartiennent au groupe P1B-4. HMA3 est localisée dans la
vacuole et contribue à la détoxification des métaux en séquestrant le zinc, le cadmium et le plomb dans cet organite (Gravot et al., 2004). HMA2 et 4 sont associées à la membrane plasmique et sont impliquées dans le transport à longue distance du zinc pour alimenter les parties aérienne de la plante (Hussain et al., 2004). HMA4 a aussi un rôle important dans la détoxification des métaux (Mills et al., 2005).
Sous-groupe Spécificité Nom de l’ATPase Localisation sub-cellulaire
1B1 Cu+, Ag+ HMA5 PAA1 / HMA6 RAN1 / HMA7 PAA2 / HMA8 Membrane plasmique Chloroplaste Réticulum endoplasmique Thylacoïdes 1B2 Zn2+, Cd2+, Pb2+ HMA2 HMA3 HMA4 Membrane plasmique Vacuole Membrane plasmique
1B4 Cu, Zn2+, Co2+, Ca2+, Cd2+ HMA1 Chloroplaste
Données bibliographiques
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HMA1 appartient au groupe P1B-4 et est associée à l'enveloppe des chloroplastes. Sa
spécificité ionique est encore très controversée (voir chapitres I et III). Le paragraphe suivant décrit en détail cette ATPase ainsi que les 2 autres ATPases chloroplastiques HMA6/PAA1 (enveloppe) et HMA8/PAA2 (thylacoïdes).
IV. LES ATPASES DE TYPES P1B ASSOCIEES AU CHLOROPLASTE
Les chloroplastes d'Arabidopsis contiennent trois ATPases de type P1B récemment
caractérisées. Ce paragraphe décrit les données qui étaient disponibles au début de ce travail de thèse concernant la fonction de ces protéines dans l'homéostasie des métaux chloroplastiques et plus particulièrement du cuivre.
A. PAA1/HMA6, une ATPase de l'enveloppe des chloroplastes impliquée dans