Effet de l’intensité lumineuse et de la concentration en zinc sur l’expression des gènes liés à l’homéostasie du cuivre

Les travaux récents de Kim et collaborateurs indiquent que HMA1 pourrait être impliquée dans l’homéostasie du zinc chloroplastique et que cette ATPase permettrait de détoxifier le chloroplaste lorsque ce métal est en excès (Kim et al 2009).

Si HMA1 est impliquée dans l’homéostasie du zinc, il est possible que son niveau de transcription soit modifié en fonction de la quantité de zinc présent dans le milieu de culture.

Chapitre I : Etude des rôles respectifs de HMA1 et de PAA1 in planta

68 Figure 25 : Analyse, par RT-PCR, de l'impact du zinc et de la lumière sur l'expression des gènes liés à l’homéostasie du cuivre.

Les PCR sont réalisées sur les ADNc obtenus après transcription inverse sur des ARNs extraits de feuilles de plantes WT cultivées sur milieu MS (contenant du zinc 30 µM) ou MS + Zn (contenant du zinc 90 µM), et sous différentes intensités lumineuses (100, 170 et 270 µE [µmoles de photons / sec / m2]). L’ADNc codant l’actine 2 sert de contrôle de charge. Ces expériences ont été reproduites à partir de trois extractions d'ADNc indépendantes.

Les résultats présentés dans la figure 25 indiquent que le niveau de transcription de HMA1 ne varie pas lorsque du zinc est ajouté dans le milieu de culture et ce quelle que soit l'intensité lumineuse. L'expression des gènes PAA2, PETE1 et PETE2 ne varie pas non plus dans les conditions analysées. En revanche, une hausse du niveau de transcrits codant pour PAA1, CSD2, CCS et FSD2 est observée lorsque les plantes sont cultivées sur un milieu riche en zinc. De façon similaire à l'impact d'un ajout de cuivre, cette augmentation est corrélée avec une diminution de l'expression de FSD1. L'augmentation du niveau de transcrits (de PAA1, CSD2, CCS et FSD2) est surtout visible lorsque l’intensité lumineuse augmente. En effet, les quantités de transcrits sont un peu plus élevées lorsque les plantes sont cultivées sous des intensités lumineuses de 170 et 270 µmoles de photons / sec / m2.

L’excès de zinc affecte la biosynthèse de la chlorophylle (Sargadoy et al., 2008). Les photosystèmes étant altérés, la chaine de transfert d’électrons peut devenir limitante. L’énergie accumulée lors de la photosynthèse doit donc être dissipée par le transfert cyclique des électrons et le cycle water-water (Sargadoy et al., 2008). Le cycle water-water étant probablement davantage sollicité, il est cohérent que la quantité de transcrits de CSD2 et de la chaperonne (CCS), probablement associée à CSD2, augmente. Dans ce cas, la demande en cuivre de CSD2 pourrait être prise en charge par PAA1 dont le niveau de transcrits augmente aussi. La chaîne de transfert d’électrons fonctionnant au ralenti, les plastocyanines ne nécessitent pas davantage de cuivre pour leur activité, le cuivre transporté par PAA1 est donc principalement dirigé vers la SOD Cu/Zn.

Les résultats de Kim et collaborateurs (2009), suggérant que HMA1 est impliquée dans la détoxification du zinc chloroplastique, auraient peut-être pu être confirmés par une augmentation du niveau de transcription de HMA1 lorsque la plante est cultivée sur un milieu

Chapitre I : Etude des rôles respectifs de HMA1 et de PAA1 in planta

69 riche en zinc. Or, nos résultats indiquent que l'expression de HMA1 ne varie pas après ajout de zinc dans le milieu. Ces résultats ne remettent pas en cause les conclusions de Kim et collaborateurs (2009) car la réponse transcriptionnelle n’est qu’un des nombreux moyens à disposition d’un organisme vivant pour faire face à un stress. Ces résultats ne permettent pas non plus de confirmer leurs conclusions.

C. Conclusion

Les expériences effectuées pour identifier des conditions de culture des plantes permettant d'induire une variation du niveau de transcription de HMA1 se sont avérées infructueuses. Une hypothèse peut être avancée pour expliquer la difficulté à reproduire les résultats précédemment obtenus concernant l’expression de HMA1 et PAA2 : des conditions expérimentales difficiles à reproduire à l’identique et l’impact éventuel du rythme circadien. En revanche, les résultats obtenus sur la réponse transcriptionnelle des autres gènes dont l’expression a été analysée (figure 24) sont en parfait accord avec la littérature. En effet, il a déjà été observé que le niveau de transcription de FSD1, de CCS et de CSD2 est dépendant de la quantité de cuivre disponible dans le milieu de culture (Abdel-Ghany et al., 2005). Ces résultats valident donc les conditions expérimentales utilisées au cours de ce travail.

L’ajout de zinc dans le milieu de culture semble mimer l’effet du cuivre car nous observons une augmentation de l'expression de CCS et CSD2 et une diminution de l'expression de FSD1 (Figure 25). Ces résultats semblent être liés à une réponse à un stress oxydant car la variation de niveau de transcription observée est aussi dépendante de la lumière. De façon surprenante, nous observons une augmentation de la transcription de PAA1. Ceci peut être expliqué par une plus forte demande du chloroplaste en cuivre en particulier pour la SOD Cu/Zn nécessaire pour dissiper un excès d’énergie non pris en charge par la chaîne de transfert d’électrons devenue limitante du fait du stress oxydant. Le cuivre transporté par PAA1 servant à alimenter CSD2 et la plastocyanine, il est probable que la plante réponde à ce stress en fournissant plus de cuivre à ces protéines et en particulier à la SOD. Les données disponibles d'analyses transcriptomiques réalisées avec des puces à ADN (Genevestigator) ne nous permettent pas de valider ces résultats de RT-PCR car la variation du niveau de transcrits est très faible, variation non significative dans ces approches.

La variation de transcrits CCS, CSD2 et FSD1 en fonction de l’intensité lumineuse n’est pas observée pour des plantes cultivées sur un milieu riche en cuivre alors que cette réponse est observée sur un milieu riche en zinc. Cette différence de réponse transcriptionnelle peut être expliquée par le fait que les variations d'expression de CCS, CSD2 et FSD1 sont tellement importantes suite à l’ajout de cuivre dans le milieu qu'elles masquent des éventuelles réponses à des variations d'intensités lumineuses ou que les réponses suite à un stress cuivre ou lumineux ne sont pas additionnelles.

Des différences entre le niveau de transcription de HMA1 et celui de PAA1 ont été observées dans certaines conditions de culture (Figures 23 et 25). Le niveau de transcription de HMA1

Chapitre I : Etude des rôles respectifs de HMA1 et de PAA1 in planta

70 augmente lorsque les plantes sont placées dans un milieu riche en cuivre et sous forte intensité lumineuse tandis que le niveau de transcription de PAA1 augmente en fonction de l’intensité lumineuse lorsque les plantes sont cultivées sur un milieu riche en zinc. Ces observations sont tout à fait en accord avec le modèle proposé sur les rôles de HMA1 et de PAA1. PAA1 est la voie principale de l’import du cuivre dans le chloroplaste et le cuivre qu’elle transporte est utilisé pour alimenter la plastocyanine et la SOD CSD2 et ainsi permettre un fonctionnement optimal de la photosynthèse. Lorsqu’un excès de zinc est présent dans le milieu de culture, la photosynthèse est moins efficace car le zinc inhibe la biosynthèse de la chlorophylle et par conséquent altère le fonctionnement de la chaîne de transferts d’électrons. HMA1 quand à elle serait impliquée essentiellement dans la détoxification des radicaux libres issus de l’oxygène suite à un stress lumineux et lorsque la photosynthèse est pleinement fonctionnelle. HMA1 agirait donc en complément de PAA1.

II. RECHERCHE DE NOUVELLES FONCTIONS DE HMA1 IN PLANTA

Des travaux antérieurs effectués au laboratoire ont montré que le mutant hma1 présente une sensibilité aux fortes intensités lumineuses par rapport à des plantes sauvages, photosensibilité non liée à la quantité de cuivre présente dans le milieu. Ce phénotype a permis d’orienter les recherches portant sur les fonctions de HMA1 et de déduire que HMA1 est essentielle en conditions de stress lumineux (Seigneurin-Berny et al., 2006). Afin de mieux comprendre la fonction de HMA1 in planta, nous avons cherché d'autres conditions de culture permettant de révéler des phénotypes liés à la perte de fonction ou la surexpression de HMA1.