Etude de l'expression des gènes impliqués dans l'homéostasie du cuivre dans les mutants paa1 exprimant HMA1 et HMA1 ∆HIS

Afin d’analyser l’impact de la surexpression de HMA1 dans le mutant paa1 au niveau de l’expression des gènes liés à l’homéostasie du cuivre, nous avons effectué des expériences de RT-PCR à partir d'ARNs extraits de feuilles provenant des différentes lignées étudiées. De cette manière, nous souhaitions mettre en évidence des variations de transcrits permettant de confirmer que la surexpression de HMA1 induisait une augmentation de la quantité de cuivre chloroplastique. Abdel-Ghany et collaborateurs ont observé une diminution du niveau d'expression des SOD CSD2 et CSD1 dans le mutant paa1 (en comparaison avec une plante sauvage), lorsque les plantes sont cultivées en présence de 5 µM de cuivre (Abdel-Ghany et al., 2005). Notre hypothèse était la suivante : si la surexpression de HMA1 induit une

Chapitre I : Etude des rôles respectifs de HMA1 et de PAA1 in planta

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augmentation du contenu en cuivre chloroplastique dans le mutant paa1, l'expression de la SOD CSD2 devrait aussi être augmentée. Nous avons donc cultivé les différentes lignées

dans les mêmes conditions que celles décrites par Abdel-Ghany et collaborateurs, c'est à dire sur un milieu MS contenant du saccharose 1 % (p/v) et 5 µM de cuivre, sous une intensité lumineuse de 100 µmoles de photons / sec / m2 (Abdel-Ghany et al., 2005). Dans ces conditions, la croissance de toutes les lignées de plantes était similaire (non montré).

Figure 39 : Analyse de l'expression de gènes liés à l’homéostasie du cuivre par RT-PCR.

Les PCR sont réalisées sur les ADNc provenant de feuilles de différentes lignées.

1 : WT ;

2 : mutant paa1 ;

3 : KO paa1 x 35S HMA1 lignée 1023-4 ; 4 : KO paa1 x 35S HMA1 lignée 1032-4 ; 5 : KO paa1 x 35S HMA1∆HIS lignée 1042-5 ; 6 : KO paa1 x 35S HMA1∆HIS lignée 1043-7.

Les plantes ont été cultivées sur milieu MS contenant du saccharose 1 % (p/v) supplémenté avec du cuivre (5µM), et sous une intensité lumineuses de 50 µmoles de photons / sec / m2. L’ADNc codant l’actine 2 sert de contrôle de charge. Ces amplifications ont été réalisées en triplicata.

Les résultats présentés dans la figure 36 indiquent que l’accumulation de la protéine HMA1 dans les lignées 1023-4, 1042-5 et 1043-7 (Figures 39 3, 5 et 6 respectivement) est

effectivement corrélé à une forte augmentation du transcrit HMA1.

Aucune variation d'expression des transcrits PAA1, CSD1, CSD2, CCS et FSD2 n’est observée dans les différentes lignées. Contrairement aux observations faites par Abdel-

Ghany et collaborateurs, l'expression de CSD1 et de CSD2 est similaire dans les mutants

paa1 et les plantes sauvages. Nos conditions de culture étant similaires, ces différences sont

inexpliquées pour l'instant. L'impact de la surexpression de HMA1 sur le contenu en

cuivre ne peut donc pas être visualisé en étudiant les variations d'expression de ces SOD dans nos expériences.

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98 Une légère diminution du niveau de transcrits FSD1 (une des SOD à fer chloroplastiques) est observée dans toutes les lignées dépourvues de PAA1 (lignées 2 à 6). Ce résultat est surprenant car l'expression de FSD1 est régulée négativement pas le cuivre.

La figure 39 montre aussi que l'expression de PAA2 est légèrement plus faible dans la lignée KO paa1 x 35SHMA1 1032-4 et les lignées KO paa1 x 35SHMA1∆HIS 1042-5 et 1043-7 (Figure 39, 4, 5 et 6). Cette diminution n’est pas corrélée avec le niveau de surexpression de HMA1 et ne peut être expliquée avec les données dont nous disposons actuellement.

Il existe deux isoformes de plastocyanine codées par les gènes PETE1 et PETE2. La figure 39 montre aussi une faible diminution de l'expression de PETE1 et inversement une faible augmentation de l'expression de PETE2 dans toutes les lignées par rapport à l'expression de ces isoformes dans la plante sauvage. Ces résultats ne sont pas en accord avec des données récentes qui montrent que PETE2 est accumulée en présence de cuivre et que PETE1 n'est pas affecté par la concentration en cuivre (Abdel-Ghany et al., 2009).

Une diminution des transcrits ATX1, CutA et PCaP1 est observée dans les plantes dépourvues de PAA1, indépendamment du niveau da transcription de HMA1. ATX1 est une métallochaperonne à cuivre cytoplasmique interagissant probablement avec HMA5 et RAN1 (ou HMA7), deux ATPases à cuivre de la membrane plasmique et du réticulum endoplasmique. La diminution d'expression d’ATX1, si elle est corrélée à une diminution de la quantité de protéine, pourrait permettre de diriger les flux de cuivre vers le chloroplaste plutôt que vers l’extérieur de la cellule ou le réticulum endoplasmique afin de remédier à la carence en cuivre induite par la perte de fonction de PAA1.

CutA et PCaP1 sont deux métallochaperonnes à cuivre potentielles. CutA est localisée dans l’espace intermembranaire de l’enveloppe (Burkhead et al., 2003). Sa fonction et ses partenaires sont encore inconnus. Si la diminution du transcrit CutA est corrélée à une diminution de l'expression de la protéine, on peut imaginer que CutA serait la métallochaperone interagissant avec PAA1 pour fournir le cuivre à PAA2. PCaP1 est une protéine associée à la membrane plasmique pouvant lier du cuivre et est très fortement transcrite lorsque du cuivre est ajouté dans le milieu de culture (Ide et al, 2007). Des données récentes de protéomique obtenues au laboratoire (Ferro et al., soumis) montrent que PCaP1 a été aussi identifiée dans l'enveloppe des chloroplastes. Si la présence de cette protéine dans l’enveloppe ne résulte pas d’une contamination croisée des fractions d’enveloppe purifiée par la membrane plasmique, cette protéine PCaP1 pourrait être une métallochaperonne qui fournit de cuivre à PAA1 et/ou HMA1.

Ces analyses n'ont pas révélé de corrélation entre la surexpression de HMA1 (au niveau transcrit et protéique) et la variation d'expression de gènes liés à l'homéostasie du cuivre. La surexpression de HMA1 dans un fond génétique mutant paa1 entraîne une toxicité en présence de fortes intensités lumineuses. Ainsi, il serait intéressant de reproduire ces

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99 expériences à partir d'ADNc extraits à partir de plantes cultivées dans les conditions induisant ce phénotype de photosensibilité.

E. Conclusion

La surexpression de HMA1 ou de HMA1∆HIS dans le mutant paa1-1 ne permet pas de supprimer son phénotype de retard de croissance et de photosensibilité dans un milieu pauvre en cuivre. Tout comme le mutant paa1, l'ajout de cuivre dans le milieu de culture permet de complémenter le phénotype de ces lignées, en présence de faible intensité lumineuse (Figure 37). Cependant, lorsque ces mutants paa1-1 exprimant fortement HMA1 sont cultivés sous une intensité lumineuse élevée, ils montrent un phénotype très prononcé de photosensibilité

lié au niveau d’expression de HMA1.

Les mutants paa1 ont un contenu en cuivre chloroplastique réduit, et la surexpression de

HMA1 dans ces lignées permet de retrouver des quantités de cuivre comparables à celles obtenues dans les chloroplastes de plantes sauvages. Ces plantes étant toujours

photosensibles, cela signifie que le cuivre importé par HMA1 n'est pas utilisé pour

alimenter la plastocyanine via PAA2. Si HMA1 est impliquée dans la délivrance du cuivre

spécifiquement à CSD2, il est possible que la protéine CSD2 ne soit pas présente en quantité suffisante pour garantir la chélation de l’ensemble du pool de cuivre importé et que cet excès devient toxique. Nous observons aussi une augmentation de fer chloroplastique dans cette

lignée. Elle pourrait résulter d'une activation des SOD à fer pour répondre au stress oxydatif généré pas l'excès de cuivre dans le chloroplaste. Cette activation se ferait au

niveau protéique car nous n'avons pas observé de variation des transcrits FSD1 et FSD2 (cependant nous n'avons pas analysé l'expression de FSD3).

La surexpression de HMA1∆HIS dans le mutant paa1 n’induit pas d’augmentation de la

concentration en cuivre et fer chloroplastiques (culture en terre pour extraire les

chloroplastes) alors qu’elle entraîne un phénotype de photosensibilité très prononcé (cultures sur boites). Il est possible que les conditions de culture in vitro ou en terre aient un impact sur ces différences de résultats. En effet, les expériences réalisées en système hétérologue levure avaient montré que la délétion du domaine riche en histidine n'inactive pas la protéine mais diminue fortement son affinité apparente pour le cuivre. Les dosages de métaux ayant été réalisés à partir de plantes cultivées en terre, il est possible que dans ces conditions la concentration en cuivre disponible dans le milieu soit trop faible pour permettre le fonctionnement de la protéine HMA1∆HIS.

La surexpression de HMA1 et HMA1∆HIS dans les KO paa1 n'a pas d'impact sur la

transcription des gènes impliqués dans l'homéostasie du cuivre dans nos conditions

expérimentales. Ceci est étonnant dans le cas de la lignée 1023-4 qui surexprime HMA1 et

dont le contenu en cuivre chloroplastique est identique à celui d'une plante sauvage. La

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100 PCaP1 et CutA suggérant que ces gènes ne sont pas régulés par la concentration en cuivre chloroplastique.

Au bilan, ces résultats suggèrent que les mécanismes d’adressage du cuivre chloroplastique sont extrêmement contrôlés et que HMA1 ne présente pas de redondance fonctionnelle

avec PAA1 car le cuivre qu’elle transporte ne peut être adressé à PAA2. Ces deux

ATPases ont donc des fonctions bien distinctes qui justifient la présence de ces deux protéines au sein de l’enveloppe du chloroplaste.

V. CONCLUSION - DISCUSSION