CAPACITE DE HMA1 ET DE PAA1 A LIER LEURS SUBSTRATS

Afin de montrer que HMA1 et PAA1 exprimées en système hétérologue Lactococcus sont capables de lier leurs substrats, deux approches ont été initiées qui consistent 1) à déterminer si HMA1 et PAA1 sont toujours capables de lier l’ATP; et 2) à démontrer que HMA1 et PAA1 peuvent interagir avec le métal qu’elles transportent.

Ces expériences n’avaient pas pour but de mesurer une activité ATPase pour ces deux protéines mais devaient permettre de déterminer leur spécificité ionique et des paramètres cinétiques comme la constante d'affinité pour un métal ou pour l'ATP. Ces données pouvaient ensuite servir à déterminer de nouvelles conditions expérimentales pour effectuer des mesures d'activité ATPase supplémentaires.

Chapitre III : Vers la caractérisation fonctionnelle de HMA1 et PAA1

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A. Protéolyse limitée à la trypsine

Afin de déterminer si HMA1 et PAA1 exprimées par L. lactis sont capables de lier l’ATP, nous avons voulu mettre en évidence les changements de conformations de ces protéines suite à la liaison de l'ATP.

Le cycle catalytique des ATPases de type P est représenté dans la figure 65. Ce cycle est composé de quatre étapes principales. La liaison du cation et de l’ATP à la protéine dans son état E2 (étape 4) permet la formation d'un intermédiaire phosphorylé suite à l'hydrolyse d'ATP (étape 1). Les changements de conformations induits par cette autophosphorylation permettent alors l’ouverture de la protéine de l’autre coté de la membrane et la libération du métal (étape 2). Enfin, l’ATPase est déphosphorylée (étape 3) et retourne à son état initial E2. Un nouveau cycle peut commencer.

Figure 65 : Cycle catalytique des ATPases de type P1B.

E1, E2, E1P et E2P représentent les conformations basiques de l’enzyme au cours de son cycle. Mn+ représente un métal transporté par ces enzymes. N représente la stœchiométrie du transport. Mn+cyt et

Mn+out représentent la localisation cytoplasmique ou

extracellaire/luminale du métal transporté. Schéma tiré de Argüello et al, 2006

Les données cristallographiques obtenues pour l’ATPase SERCA indiquent l'existence de changements de conformations majeurs suite à la liaison de l’ATP sur la protéine (Figure 65, étape 4) (Kubala, 2006).

En changeant de conformation, l’ATPase peut rendre accessible ou inaccessible un site de digestion trypsique. La protéolyse limitée à la trypsine est une technique qui a été utilisée pour mettre en évidence des changements de conformation de différentes ATPase de type P dont SERCA (Danko et al., 2001) et CadA, une ATPase de type P1B de Listeria

monocytogenes (Q60048) transportant du cadmium (Wu et al., 2006). Les auteurs montrent un changement dans le profil de digestion trypsique de CadA selon la présence ou non d’ATP dans le milieu réactionnel attestant de mouvements au sein de la protéine.

Nous avons donc étudié les changements de conformation de HMA1 et de PAA1 en analysant les profils de digestion trypsique obtenus dans un milieu réactionnel en présence ou absence d’ATP. Ces expériences ont été réalisées par Daphné Seigneurin-Berny (LPCV) à partir des protéines recombinantes produites chez L. lactis.

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146 Figure 66 : Protéolyse limitée à la trypsine sur des extraits de protéines membranaires.

Les protéines membranaires provenant de bactéries transformées par un vecteur non recombinant (V Vide), exprimant HMA1 sans sa séquence riche en histidine (HMA1∆His) ou HMA1 mutée au niveau du site catalytique (HMA1-AKT) sont incubées pendant 5 min à 30°C dans un milieu réactionnel contenant du Tris- HCl 20 mM pH 7 ; du KCl 0,1 mM ; et du MgCl2 5 mM. De la trypsine (avec un ratio protéine / trypsine égal à

10 [p/p]) et de l'ATP 5 mM sont ajoutés comme indiqué. Après précipitation à l'acétone, les échantillons sont séparés par SDS-PAGE et analysés par un marquage réalisé à l’aide du conjugué Strep-tactin HRP. La flèche indique la taille attendue pour la protéine HMA1 non protéolysée.

La figure 66 présente les différents profils de digestion obtenus sur des extraits de protéines membranaires provenant de bactéries contrôles (bactéries transformées par un vecteur d'expression non recombinant), ou de bactéries exprimant HMA1∆His et HMA1-AKT. Pour chaque extrait membranaire, trois conditions sont analysées : 1) absence d'ATP et de trypsine, 2) ajout de trypsine, et 3) préincubation pendant 1 min avec de l'ATP avant ajout de trypsine. Lorsque la réaction se déroule dans un milieu dépourvu de trypsine et d’ATP (Figure 66, trois premières pistes de l'autoradiogramme), les protéines ne sont pas protéolysées et migrent à leur taille attendue.

L'ajout de trypsine (Figure 66, trois pistes du milieu) modifie le profil de marquage. En effet, le signal correspondant à HMA1∆His et HMA1-AKT diminue d’intensité et de nouveaux signaux apparaissent. Ces marquages correspondent probablement aux fragments C-terminaux (l’étiquette Strep est localisée en C-terminal) de HMA1 obtenus après digestion par la trypsine. Ces marquages ne sont pas visibles dans l'échantillon HMA1-AKT probablement à cause de la faible expression de la protéine HMA1-AKT. Les produits de dégradation sont probablement présents en trop faible quantité pour être détectés par le conjugué Strep-tactin HRP.

En présence d’ATP et de trypsine, nous pouvons observer que les profils de digestion trypsique sont de nouveau différents et proches des profils observés sans ajout de trypsine. En

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147 effet, les marquages issus des fragments protéolysés de HMA1 observés précédemment ne sont plus visibles (ou très peu) et le marquage correspondant à une forme non digérée de HMA1 est beaucoup plus fort (Figure 66, trois dernières pistes).

Ces résultats montrent que l’ATP a un impact sur le profil de digestion de HMA1 par la trypsine, en induisant probablement des changements de conformation qui rendent inaccessible les sites de digestion trypsique. Ces résultats suggèrent donc que HMA1 exprimée par L. lactis est capable de lier de l’ATP et de changer de conformation.

Il est normal que la forme mutée de HMA1 change de conformation suite à l’ajout d’ATP dans le milieu. En effet, même si cette protéine ne peut plus être phosphorylée, elle est encore capable de lier l’ATP.

Afin de valider l’expérience présentée dans la figure 66, les extraits membranaires bruts ont été remplacés par de la sérum-albumine bovine (SAB), une protéine non connue pour lier l’ATP ni pour avoir une quelconque interaction avec ce nucléotide.

Figure 67 : L’ATP a un effet sur l’activité protéolytique de la trypsine.

La SAB (2 µg) est incubée pendant 5 min à 30°C dans un milieu réactionnel contenant du Tris-HCl 20 mM pH 7 ; du KCl 0,1 mM ; et du MgCl2 5 mM. Les expériences sont

effectuées avec ou sans trypsine (avec un ratio protéine / trypsine égal à 10 [p/p]). Trois concentrations en ATP sont utilisées : 5 mM, 1 mM et 100 µM. Les échantillons sont ensuite précipités à l'acétone et analysés par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie.

La figure 67 montre que la SAB est totalement digérée en présence de trypsine. En revanche, l'ajout d’ATP 5 mM inhibe la digestion de la SAB qui est de nouveau détectée à une taille légèrement supérieure. Cette protéine n’étant pas connue pour lier l’ATP, ni changer de conformation lorsqu’elle est en présence d’ATP, nous avons soupçonné que l’ATP puisse inhiber l’activité protéolytique de la trypsine. L'utilisation d’une concentration plus faible en ATP (1 mM et 100 µM) permet de restaurer l'activité protéolytique de la trypsine. Cette expérience a été reproduite avec la protéine ceQORH, une quinone oxydo-réductase associée à l’enveloppe des chloroplastes (Miras et al., 2002) qui n’est pas connue pour lier l’ATP et a conduit à des résultats identiques (non montré). Ainsi, les résultats obtenus suite à la première expérience réalisée sur les extraits de protéines membranaires ne peuvent être pris en compte. Nous avons donc reproduit cette expérience en utilisant des concentrations d'ATP inférieures à 5 mM.

Chapitre III : Vers la caractérisation fonctionnelle de HMA1 et PAA1

148 Figure 68 : Protéolyse limitée à la trypsine sur des fractions purifiées de HMA1 et de PAA1.

Des extraits purifiés de HMA1 et de PAA1 sont incubées pendant 20 sec à 30°C dans un milieu réactionnel contenant du Tris-HCl 20 mM pH 7 ; du KCl 0,1 mM ; et du MgCl2 5 mM. Les expériences

sont effectuées en présence ou absence de trypsine (avec un ratio protéine / trypsine égal à 10 [p/p]). Deux concentrations en ATP ont été utilisées : 500 µM et 100 µM. Les protéines sont ensuite précipitées à l'acétone, séparées par SDS-PAGE et analysées par un marquage avec le conjugué Strep-tactin HRP. L’étoile indique la taille attendue pour la protéine HMA1 non protéolysée et le triangle indique la taille attendue pour la protéine PAA1 non protéolysée.

La figure 68 présente les résultats de protéolyse limitée effectuée à partir des fractions enrichies en protéines HMA1 et PAA1. Lorsque la trypsine est ajoutée dans le milieu réactionnel, le marquage correspondant à PAA1 disparaît indiquant que la protéine est protéolysée. Quand à HMA1, elle présente un signal de marquage moins fort que celui observé dans la condition contrôle (sans trypsine, ni ATP) mais contrairement à PAA1, le marquage ne disparaît pas totalement. Cette différence peut être expliquée par une accessibilité différente des sites de digestion trypsique entre les deux ATPases.

Lorsque l’expérience est réalisée en présence de trypsine et d’ATP 500 µM, nous pouvons voir que le profil de digestion de HMA1 et de PAA1 est différent de celui qui est obtenu lorsque seule la trypsine est présente dans le milieu réactionnel (apparition de signaux supplémentaires). Il en est de même lorsque la réaction a lieu en présence de trypsine et d’ATP 100 µM. Cependant, avec cette concentration d’ATP, il semble que les marquages sont moins intenses que ceux qui sont observés lorsque la réaction a lieu en présence d’ATP 500 µM. Cette différence suggère qu'une concentration en ATP de 100 µM est limitante pour une liaison optimale aux protéines HMA1 et PAA1.

D’après ces expériences, l’ajout d'ATP (à des concentrations qui n’inhibent pas la trypsine) modifie le profil de protéolyse de HMA1 et de PAA1. Ces résultats préliminaires indiquent que les protéines HMA1 et PAA1 partiellement purifiées sont encore capables de lier de l’ATP et de changer de conformation. Ces expériences vont être poursuivies en analysant une gamme plus importante de concentration en ATP. De cette manière, nous espérons pourvoir calculer une affinité apparente de HMA1 et de PAA1 pour l'ATP.