Effet d’un stress salin sur des plantes exprimant différentiellement HMA

Les stress salins sont très répandus et limitent les rendements agricoles (Pour revue, lire Ward et al., 2003). Ces stress provoquent une perturbation de la balance des ions, des niveaux toxiques de sodium au sein du cytoplasme pouvant résulter en un stress hydrique, osmotique et oxydant (Luo et al., 2009).

Le travail de Maathuis indique que le niveau de transcription de HMA1 est augmenté dans les racines suite à un stress salin (Maathuis, 2006). Ce travail est la seule référence trouvée dans la littérature sur le rôle potentiel de HMA1 dans la réponse à ce type de stress. HMA1 est transcrite principalement au niveau des parties aériennes mais aussi au niveau de racines (Seigneurin-Berny et al., 2006). L’expression de HMA1 fusionnée à la GFP sous le contrôle de son promoteur indique que la protéine est aussi exprimée au niveau des racines (Kim et al., 2009). Un stress salin induisant un stress oxydant et une perturbation de la balance des ions, HMA1 pourrait être essentielle pour fournir en cuivre CSD2, impliquée dans la détoxification des radicaux libres issus de l’oxygène ainsi que pour maintenir une concentration optimale de cuivre au sein de ces plastes.

Chapitre I : Etude des rôles respectifs de HMA1 et de PAA1 in planta

71 Nous avons cherché à savoir quel était l’effet d’un tel stress sur des plantes surexprimant HMA1 ou sur les mutants hma1.

Figure 26 : Effet d’un stress salin sur la croissance de différentes lignées d’A. thaliana (WT, surexpresseur HMA1 ou mutants hma1 ACT7 et DRC42).

Pour chaque condition de culture analysée, 25 graines issues de plantes WT, surexprimant HMA1 sous le contrôle du promoteur 35S (35S HMA1) et mutants hma1 (ACT7 et DRC42) sont déposées sur milieu MS contenant du saccharose 0,5 % (p/v) et dans lequel différentes concentrations de NaCl sont présentes (NaCl 0, 150 et 180 mM). Les plantes sont cultivées pendant 21 jours sous une intensité lumineuse de 150 µmoles de photons / sec / m2.

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72 Figure 27 : Effet d’un stress salin et de l'ajout de cuivre sur la croissance de différentes lignées d’A.

thaliana (WT, surexpresseur HMA1 ou mutants hma1 ACT7 et DRC42).

Pour chaque condition de culture analysée, 25 graines provenant de plantes WT, surexprimant HMA1 sous le contrôle du promoteur 35S (Sx) et mutants hma1 (ACT7 et DRC42) sont déposées sur milieu MS contenant du saccharose 0,5 % (p/v) et supplémenté avec du CuSO4 5 µM et différentes concentrations de NaCl (0, 150 et

180 mM NaCl). Les plantes sont cultivées pendant 21 jours sous une intensité lumineuse de 150 µmoles de photons / sec / m2.

La figure 26 montre que, sur milieu MS, les quatre lignées de plantes analysées (plantes WT, surexpresseur HMA1 et les deux mutants hma1 indépendants) présentent une croissance similaire. Lorsque les plantes sont cultivées dans un milieu de culture contenant du NaCl 150 mM, toutes les lignées présentent un fort retard de croissance (Figure 26, NaCl 150 mM), phénotype validé par les duplicatas effectués (non montrés). Ce retard de croissance est

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73 amplifié lorsque la concentration en NaCl augmente dans le milieu (Figure 26, NaCl 180 mM). Cependant, il semble que les deux lignées KO hma1 présentent un problème de germination lié à la concentration saline dans le milieu de culture. HMA1 étant impliquée dans le transport du cuivre, nous cherché à savoir si un ajout de cuivre dans le milieu permettait de supprimer le phénotype observé. Pour cela, nous avons effectué la même expérience sur des milieux contenant du cuivre 5 µM.

Comme le montre la figure 27, l’ajout de cuivre dans le milieu de culture ne permet pas de supprimer le phénotype de retard de croissance observé sur milieu MS observé dans la figure 26. En effet, plus la concentration en NaCl est élevée, plus le retard de croissance est prononcé. Enfin, les mutants hma1 DRC42 et ACT7 semblent toujours présenter des défauts de germination lorsqu’ils sont cultivés sur un milieu contenant de fortes concentrations en NaCl, et ceci indépendamment de la quantité de cuivre présente dans le milieu de culture. L’ajout de cuivre dans le milieu ne semble donc pas supprimer le défaut de germination observé pour les mutants hma1. Lorsque nous comparons la croissance des plantes cultivées en présence ou absence de cuivre (Figures 26 et 27), il semble que l’ajout de ce métal améliore très légèrement la croissance des quatre lignées étudiées en particulier dans les conditions où du NaCl 150 et 180 mM a été ajouté.

Ces analyses phénotypiques suggèrent que les deux mutants hma1 indépendants présentent un défaut de germination sur milieu enrichi en NaCl. Afin de déterminer si ce défaut est statistiquement significatif, nous avons calculé le taux de germination.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 WS 35S HMA1 KO hma1 DRC 42 KO hma1 ACT7 T a ux d e ge rm ina tion ( % ) MS MS NaCl 150 mM + Cu 5 µM MS NaCl 150 mM MS NaCl 180 mM + Cu 5 µM MS NaCl 180 mM

Figure 28 : Taux de germination de plantes de type WT (WS), surexprimant HMA1 (Sx) et des mutants

hma1 (ACT7 et DRC42) cultivées sur milieu salin.

Les taux de germination indiqués sont les moyennes du nombre de graines ayant germé (n=25) sur les deux expériences indépendantes présentées dans les figures 26 et 27. Les * indiquent une différence du taux de germination significative (Test du Khi 2, p < 0,001).

** * * * * KO hma1 DRC42 KO hma1 ACT7

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74 D’après la figure 28, le taux de germination des plantes WT est identique quel que soit le milieu de culture utilisé. La germination de la lignée surexprimant HMA1 n’est pas affectée non plus dans les conditions analysées. La baisse du taux de germination observée pour cette lignée sur milieu MS supplémenté avec du NaCl 180 mM n’est pas statistiquement significative.

Alors que les deux mutants indépendants de hma1 (DRC42 et ACT7) ne présentent pas de défaut de germination lorsqu’ils sont placés sur un milieu MS classique, nous pouvons observer une baisse du taux de germination lorsque les graines sont semées sur un milieu contenant du NaCl 150 mM (Figure 28). Le taux de germination est de l’ordre de 40 % pour les mutants hma1 issus de la lignée DRC42 et de 70 % pour les mutants hma1 issus de la lignée ACT7. Cette diminution de la germination est statistiquement significative pour la lignée DRC42. Ces problèmes de germination sont indépendants de la quantité de cuivre présent dans le milieu de culture.

Lorsque les graines des mutants hma1 DRC42 et ACT7 sont placés sur un milieu contenant une concentration plus élevée en sel (180 mM), le taux de germination est encore diminué et ce, de manière statistiquement significative pour les deux lignées (le taux de germination est de l’ordre de 20 % pour les mutants hma1 issus de la lignée DRC42 et de 30 % pour les mutants hma1 issus de la lignée ACT7). Le cuivre ajouté dans le milieu ne modifie pas ces taux de germination.

D’après la littérature, les stress salins induisent des défauts de germination sur les graines d’A. thaliana. Ce défaut de germination n’est pas lié à la mort de la graine mais à une inhibition des mécanismes permettant la levée de la dormance (Saleki et al., 1993). Des expériences complémentaires peuvent être envisagées afin de mieux comprendre le défaut de germination observé pour les mutants hma1 : tout d’abord, il sera nécessaire de déterminer si les graines des deux mutants hma1 sont tuées par le stress salin ou si ce stress induit seulement une inhibition de la germination. Pour cela, les graines de ces lignées seront semées dans un milieu contenant une concentration importante de NaCl. Après une semaine de culture sur ce milieu, les graines seront transférées sur un milieu ne contenant pas une forte concentration NaCl permettant ainsi la germination et le développement des graines encore viables (Saleki et al., 1993).

En parallèle, l'observation au microscope des graines des mutants hma1 semées sur le milieu riche en NaCl, permettrait de déterminer si les graines ont commencé à germer. Si c’est le cas, il est possible que le stress salin ait induit un stress oxydant. En effet, Tsugane et collaborateurs ont montré qu’un stress salin induisait une augmentation de l’activité SOD sur de jeunes plantules d’A. thaliana et indiquent que l’activité SOD chloroplastique est essentielle pour conserver un PSII fonctionnel dans ces conditions (Tsugane et al., 1999). D’après les travaux de Zhang et collaborateurs, CSD2 est active dans les racines d’Elsholtzia

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75 haichowensis soutenant l’hypothèse que HMA1 puisse être impliquée dans la délivrance du cuivre à CSD2 au niveau des plastes des racines (Zhang et al., 2008).

Il est intéressant de noter que l'ajout de cuivre dans le milieu ne restaure pas le taux de germination des mutants hma1 lors d'un stress salin. Ces données suggèrent une fonction spécifique pour HMA1 qui ne peut pas être complémentée par un autre transporteur de cuivre présent dans l'enveloppe des plastes comme PAA1.