Effet de l’intensité lumineuse et de la concentration en cuivre dans le milieu de culture sur l’expression de gènes liés à l’homéostasie du cuivre

Les expériences de RT-PCR présentées précédemment ont été poursuivies afin de valider ces résultats et afin d’analyser l'expression de gènes codant pour des protéines liées à l’homéostasie du cuivre afin d’étayer les hypothèses exposées ci-dessus. Nous avons cherché à visualiser les réponses transcriptionnelles induites par l’ajout de cuivre dans le milieu de culture en fonction de l’intensité lumineuse. Pour cela, nous avons cultivé des plantes WT sur un milieu supplémenté ou non en cuivre et en présence d'intensités lumineuses différentes.

Chapitre I : Etude des rôles respectifs de HMA1 et de PAA1 in planta

66 Figure 24 : Analyse, par RT-PCR, de l'impact du cuivre et de la lumière sur l'expression des gènes liés à l’homéostasie du cuivre. Les PCR sont réalisées sur les ADNc obtenus après

transcription inverse sur des ARNs extraits de feuilles de plantes WT cultivées sur milieu MS contenant du saccharose 0,5 % (p/v) et deux concentrations de CuSO4 (0,1 µM ou 10 µM CuSO4). Les

plantes sont cultivées sous des intensités lumineuses variables (100, 170 et 270 µE [µmoles de photons / sec / m2]). L’ADNc codant l’actine 2 sert de contrôle de charge. Ces analyses ont été reproduites à partir de trois extractions d'ARNs indépendantes.

L’analyse présentée figure 24 indique que nous n’avons pas réussi à reproduire les résultats obtenus précédemment. En effet, le niveau de transcription de HMA1 et de PAA2 ne varie pas quelles que soient les conditions de croissance des plantes. Nous n'observons pas d'augmentation du niveau des transcrits HMA1 et PAA2 lorsque les plantes sont cultivées sur un milieu contenant du CuSO4 10 µM et sous une intensité lumineuse de 270 µmoles de

photons / sec / m2. Les premières expériences présentées dans la figure 23 avaient été réalisées à partir de plantes cultivées sous une intensité lumineuse de 280 µmoles de photons / sec / m2. Il est possible qu’il y ait un seuil d’intensité lumineuse au-delà duquel l'expression de HMA1 et de PAA2 est augmentée. Cette hypothèse est en accord avec le fait que le phénotype de sensibilité à la lumière de plantes dépourvues de HMA1 n'apparaît qu'au-delà d'une intensité lumineuse seuil, supérieure à 280 µmoles de photons / sec / m2 (Seigneurin- Berny et al., 2006).

Tout comme HMA1 et PAA2, le niveau des transcrits de PAA1, FSD2 (SOD Fe chloroplastique), PETE1 et PETE2 (les deux isoformes de plastocyanine) ne varie pas dans les conditions expérimentales analysées (Figure 24).

En revanche l'expression de CSD2 (la SOD Cu/Zn chloroplastique), de CCS (chaperonne à cuivre) et de FSD1 (SOD Fe chloroplastique) varie très fortement en présence de fortes concentrations en cuivre dans le milieu de culture. En effet, nous observons une augmentation du niveau des transcrits codant pour CCS et CSD2 et une diminution des transcrits codant pour FSD1 suite à l’ajout de cuivre dans le milieu. Ces résultats sont en accord avec les travaux de Abdel-Ghany et collaborateurs (Abdel-Ghany et al., 2005).

Nous pouvons observer que seule la concentration en cuivre dans le milieu entraîne des variations des niveaux de transcrits pour certains des gènes étudiés. Les variations d’intensité lumineuses (de 100 à 270 µmoles de photons / sec / m2), pour une concentration de cuivre constante de 10 µM dans le milieu, ne semblent pas avoir d’impact sur l’expression de ces gènes (Figure 24).

Chapitre I : Etude des rôles respectifs de HMA1 et de PAA1 in planta

67 Les résultats présentés dans la figure 24 semblent indiquer qu’il n’y a pas de réponse graduelle de la transcription de HMA1 et PAA2 en fonction de la quantité de lumière mais qu’un seuil d’intensité lumineuse est probablement requis pour induire l’augmentation de l'expression de ces deux gènes comme cela avait été observé précédemment (Figure 23). Ces nouvelles expériences ne valident donc pas le modèle préétabli. Il est aussi possible que les conditions expérimentales utilisées dans ces expériences indépendantes ne soient pas exactement identiques. L'intensité lumineuse utilisée de la première expérience était légèrement supérieure à celle utilisée dans la seconde expérience. D'autres paramètres non parfaitement contrôlés peuvent aussi interférer comme la longueur d’onde de la lumière émise par les néons qui peut varier dans le temps à cause de leur vieillissement.

Une autre explication sur la non reproductibilité de ces résultats peut être avancée : HMA1 et PAA2 transportant du cuivre pour des protéines liées à l’activité photosynthétique, il est possible que le niveau de transcription de HMA1 et de PAA2 puisse être contrôlé par le rythme circadien. Cette hypothèse est cohérente avec une des conclusions du travail de Higuchi et collaborateurs indiquant que le cycle water-water serait important lorsque la réaction photosynthétique se met en place, c'est-à-dire lorsque les plantes passent de l’obscurité à la lumière (Higuchi et al., 2009). Dans ces conditions l’activité de la SOD Cu/Zn est essentielle et peut générer une demande en cuivre prise en charge par une augmentation de la quantité de HMA1. Le même raisonnement peut être suivi pour PAA2, prenant en charge une demande accrue en cuivre de la plastocyanine. En conclusion, il est possible que le chloroplaste nécessite plus de cuivre lors de la transition obscurité / lumière. Afin d’augmenter les flux de ce métal vers le chloroplaste, le niveau de transcription de HMA1 et de PAA2, s’il est corrélé avec une augmentation de la quantité de polypeptide, permettrait de fournir plus de cuivre aux cibles qui en ont besoin. Lorsque la chaine de transfert d’électrons photosynthétique est fonctionnelle, c'est-à-dire lorsque la SOD Cu/Zn et les plastocyanines ont été suffisamment alimentées en cuivre, la demande en cuivre du chloroplaste peut diminuer autorisant une diminution de la quantité des protéines HMA1 et PAA2. Si cette hypothèse est exacte, l’heure à laquelle les plantes sont récoltées peut avoir un impact sur le niveau de transcription observé pour HMA1 et PAA2.

B. Effet de l’intensité lumineuse et de la concentration en zinc sur l’expression des