Mesure d’activité ATPase à l’aide d’un système couplé

La première technique utilisée pour mesurer l’activité d’hydrolyse d’ATP d’un échantillon est basée sur un système couplé d’oxydation du NADH dépendant de l’ADP. Lorsque qu’une molécule d’ATP est hydrolysée, sa régénération à partir d’ADP et de phosphoenolpyruvate nécessite la consommation d’une molécule de NADH dont la disparition peut être suivie à l’aide d’un spectrophotomètre (voir matériel et méthodes). Ce système, décrit par Blumwald et Poole a permis de mesurer l’activité d’hydrolyse d’ATP de protéines (Blumwald & Poole, 1985) et en particulier de SERCA1, une ATPase de type P transportant du calcium (Falson et al., 1997). Ce système a aussi été utilisé pour mesurer l’activité de HMA1 à partir de préparations d’enveloppe de chloroplastes purifiées (Seigneurin-Berny et al., 2006). Ce système de régénération d’ATP permet de suivre une activité ATPasique en temps réel et permet l’ajout successif de molécules d’intérêts.

1. Mesure d’activité ATPase sur des extraits de protéines membranaires issus de souches de L. lactis après expression de HMA1

Afin de révéler l’activité ATPase due à HMA1 dans des extraits membranaires bruts après expression de la protéine d’intérêt, les mesures sont effectuées sur des membranes issues de bactéries transformées avec un plasmide contenant l'ADNc codant HMA1 et ces activités sont comparées à celles obtenues sur des membranes issues de bactéries transformées avec un plasmide non recombinant.

Chapitre III : Vers la caractérisation fonctionnelle de HMA1 et PAA1 134 0 10 20 30 40 50 60 70 pH 6,6 pH 7 Activité ATPasique (µ mol AT P / h / mg de prot éi ne t o ta le s) Membranes ne contenant pas HMA1 Membranes contenant HMA1

Figure 57 : Comparaison des activités ATPases totales de protéines membranaires issues de bactéries transformées par un plasmide non recombinant et de bactéries exprimant HMA1.

Les protéines membranaires (20 µg/µl) sont ajoutées au mélange réactionnel contenant du Tris/MES 30 mM pH 6,6 ou pH 7 ; du KCl 50 mM ; du MgSO4 3 mM ; du PEP 3 mM ; du NADH

0,150 mM ; de la pyruvate kinase 3 U/mL ; de la lactate déshydrogénase 3 U/mL; du DTT 2,5 mM et du CuSO4 10 µM. La réaction est initiée par

l’ajout d'ATP 0,6 mM. La réaction se déroule pendant 4 min. Les valeurs représentent les moyennes obtenues pour 3 expériences indépendantes.

Comme le montre la figure 57, aucune différence significative d’activité n’est observée entre les différentes membranes lorsque les mesures sont effectuées en présence de 10 µM CuSO4

et 2,5 mM DTT, à pH 6,6 ou pH 7. L'ajout de DTT dans le milieu permet d'être en condition réductrice et de travailler en présence de cuivre sous forme 1+. D’autres conditions expérimentales ont été testées, incluant des concentrations variables en cuivre et en DTT ainsi que différents pH. Cependant, aucune de ces conditions n'a permis de détecter une différence significative d’activité ATPase entre les deux types de membranes (non montré). L’ajout d’autres métaux comme le zinc et le calcium a aussi été testé mais sans succès. Le tampon Tris-HCl pouvant agir comme un chélateur de métaux, nous avons renouvelé ces tests en présence d'un tampon Hepes, mais cela n'a pas eu d'impact sur les activités mesurées.

La figure 57 montre que les ATPases endogènes présentes dans les membranes de L. lactis ont une activité de base d’environ 50 µmoles d’ATP consommé / h / mg de protéines totales. Cette activité résulte de la présence, dans la membrane plasmique de Lactococcus, de nombreux de transporteurs nécessitant de l’ATP pour leur activité comme les ATPases de type P, mais aussi les ATPases à proton et les transporteurs ABC (Pour revue, lire Van Veen et al., 1999 ; van den Berg van Saparoea et al., 2005). L’utilisation d’inhibiteurs comme le DCCD (dicyclohexylcarbodiimide) permettant d'inhiber l’activité des ATP synthases ne nous a pas permis de diminuer l’activité endogène mesurée. L'ajout de vanadate, un inhibiteur des ATPases de type P et des transporteurs ABC, ne permet pas non plus de diminuer l'activité ATPase endogène.

D'après nos quantifications, HMA1 représente 3 % des protéines membranaires totales lorsqu’elle est produite chez L. lactis. Il y a donc environ 30 µg de protéine HMA1 dans 1 mg de protéines membranaires issues de L. lactis. D'autre part, les mesures d’activité ATPase effectuées sur l’enveloppe du chloroplaste, suggèrent que HMA1 aurait une activité spécifique de 260 µmoles d’ATP hydrolysé / h / mg de protéine (Seigneurin-Berny et al., 2006). Une telle activité représenterait 7,8 µmoles d’ATP consommé / h / mg de protéines membranaires totales soit seulement 16 % de l’activité endogène mesurée dans les

Chapitre III : Vers la caractérisation fonctionnelle de HMA1 et PAA1

135 membranes de L. lactis. De plus, cette valeur d’activité spécifique de HMA1 a été obtenue avec une protéine insérée dans sa membrane native (la membrane interne de l’enveloppe du chloroplaste). Or, l’environnement lipidique peut influer sur l’activité mesurée pour une ATPase de type P1B. En effet, les travaux de Chintalapati et collaborateurs sur CtrA2 et

CtrA3, deux ATPases à cuivre de Aquifex aeolicus, démontrent l’importance des lipides sur l’activité de ces protéines (Chintalapati et al., 2008). L’environnement lipidique de la membrane de L. lactis étant différent de celui de la membrane interne de l’enveloppe du chloroplaste, nous pouvons penser que cela peut avoir un impact négatif sur l’activité de HMA1. Au bilan, si l'activité spécifique de HMA1 est encore plus faible dans les membranes de Lactococcus, elle n'est plus significative par rapport aux activités ATPases endogènes et ne peut donc pas être détectée avec ce système de mesure. L'ATPase à cuivre CopA de Archaeoglobus fulgidus a une activité spécifique de 6 µmoles d’ATP hydrolysé / mg de protéine / h lorsqu'elle est exprimée chez E. coli. Si HMA1 avait la même activité spécifique que CopA, l’activité estimée pour HMA1 dans 1 mg de protéines membranaires de L. lactis serait de 0,18 µmol d’ATP consommé / h soit 0,4 % de l’activité totale mesurée. Une telle variation de différence d’activité ne peut être détectée avec ce système de mesure d'activité ATPase.

2. Mesure d’activité ATPase sur des extraits fortement enrichis en HMA1 et en PAA1 Afin d’éliminer le bruit de fond généré par les ATPases endogènes présentes dans les membranes de L. lactis, les mesures d'activité ATPase ont été effectuées sur des fractions fortement enrichies en HMA1. Ces fractions ont été obtenues après solubilisation et purification de HMA1 et de PAA1 par affinité. Dans ces fractions, HMA1 et PAA1 représente environ 80 % des protéines (voir chapitre II).

0,6 0,65 0,7 0,75 0,8 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Temps (secondes) Abs o rbance à 340 nm

Figure 58 : Dosage de l'oxydation du NADH (corrélé à l'hydrolyse d'ATP) sur des fractions de protéine purifiée.

La protéine HMA1 purifiée (2 µg) est mélangée avec 100 µg de PC (phosphatidylcholine, préalablement portée à ébullition) pendant 20 minutes à 37°C. Ce mélange est ensuite incubé dans 1 mL du milieu réactionnel suivant : Hepes 20 mM pH 7,5 ; KCl 100 mM ; MgSO4 3 mM ;

PEP 3 mM ; NADH 0,150 mM ; pyruvate kinase 3 U/mL ; lactate déshydrogénase 3 U/mL; TCEP 0,5 mM ; CuSO4 10 µM, DDM 0,02 % (p/v). A t =

200 sec, la réaction est initiée par ajout d'ATP 0,6 mM.

La disparition du NADH (converti en NAD) est suivie par la mesure de l’absorbance à 340 nm.

La figure 58 montre une courbe représentative des mesures d'activité effectuées sur les fractions purifiées contenant HMA1 (ou PAA1) avec le système de couplage. On peut noter

Chapitre III : Vers la caractérisation fonctionnelle de HMA1 et PAA1

136 que ce système de mesure n'est pas adapté à ce matériel biologique. En effet, on observe une consommation de NADH (matérialisée par une diminution de l’absorbance à 340 nm) avant même que de l’ATP ne soit ajouté au milieu réactionnel. La consommation de NADH ne devant avoir lieu que pour régénérer l’ATP consommé, le système de couplage ne devrait pas fonctionner tant que l’ATP n’est pas présent dans le milieu réactionnel et hydrolysé par l’activité de HMA1 ou de PAA1. Ce résultat indique donc que ce type de mesure n’est pas adapté aux conditions expérimentales utilisées. De plus nous n’observons pas d’augmentation de la consommation de NADH, après ajout de l’ATP pouvant mettre en évidence une activité d’hydrolyse de ce composé.

La consommation spontanée de NADH peut être expliquée par la présence de grandes quantités d'agent réducteur (TCEP ou DTT) pouvant interférer avec la réaction d’oxydation du NADH. De plus, la présence de détergent dans les fractions enrichies en HMA1 et PAA1 peut avoir un impact sur les enzymes utilisées dans le système de couplage.

Le système enzymatique utilisé pour mesurer l’activité de HMA1 et de PAA1 n’étant pas adapté que ce soit sur des extraits membranaires bruts ou sur des extraits purifiés, l’activité ATPase a été mesurée par une autre méthode.