HMA1 (AT4G37270, Q9M3H5) a été identifiée dans l’enveloppe des chloroplastes suite à une approche protéomique ciblée sur l’enveloppe et développée au laboratoire PCV (Ferro et al., 2003). Cette protéine de 84 kDa (forme mature) appartient au sous-groupe 1B4 d’après la classification établie en 2003 par Argüello. HMA1 a des caractéristiques qui lui sont propres : (a) elle possède 6 ou 7 hélices transmembranaires prédites, (b) son extrémité N- terminale contient un N-MBD riche en histidines et (c) son domaine de translocation des métaux est composé d’un motif SPC (Figure 16 et annexe 1).
Figure 16 : Représentation schématique de HMA1.
Voir annexe 1.
Les données décrites ci-dessous ont été obtenues au laboratoire avant mon arrivée (Seigneurin-Berny et al., 2006).
La localisation plastidiale de HMA1 a été validée par expression transitoire dans des feuilles d’A. thaliana de la protéine fusionnée à la GFP et sa localisation dans l'enveloppe des chloroplastes a été démontrée par immunodétection sur des fractions subplastidiales purifiées. La caractérisation fonctionnelle de HMA1 a été ensuite initiée par une approche en système hétérologue levure (en collaboration avec Antoine Gravot, Pascaline Leroy, Alain Vavasseur et Pierre Richaud du laboratoire LEMS au CEA Cadarache) et par une approche in planta.
1. Analyse fonctionnelle de l'ATPase HMA1, approche par expression en levure
L'expression de la forme mature de HMA1 dans une souche WT de levure affecte la croissance des levures et entraîne une accumulation intracellulaire du cuivre et du zinc. Ce phénotype n'est pas observé lorsque les levures expriment une forme inactive de HMA1
Données bibliographiques
31 (mutation AKTG au niveau du site catalytique DKTG). Ces résultats suggèrent que HMA1, en système hétérologue levure, serait impliquée dans le transport du zinc et du cuivre. Afin d’analyser le rôle de différents résidus conservés de HMA1, différentes formes mutées de HMA1 ont été exprimées en levure. L’expression de HMA1 dépourvue de son domaine riche en histidines n’affecte pas la croissance cellulaire sur milieu standard, suggérant ainsi que le transport du métal est affecté par cette délétion. En revanche, les cellules qui expriment cette construction sont sensibles à de fortes concentrations de cuivre et de zinc. Ceci suggère l’existence d’une activité de transport résiduelle, qui pourrait participer à l’intoxication cellulaire en présence de fortes concentrations de métaux. Ainsi, le domaine riche en histidines ne semble pas être impliqué directement dans le transport des métaux mais plutôt dans la régulation de ce transport. Les levures qui expriment des formes de HMA1 portant des mutations ponctuelles (CPC et DEGG) au niveau des motifs conservés SPC et HEGG (dans les hélices transmembranaires potentielles 4 et 6) présentent une croissance normale et ne montrent pas d’hypersensibilité aux métaux. Il semble donc qu'il n'y ait pas d'activité de transport des métaux dans ces cellules. Ces résidus seraient ainsi impliqués dans la transduction du métal plutôt que dans la régulation du transport.
2. Analyse fonctionnelle de l'ATPase HMA1, approche in planta
Cette approche a été réalisée au laboratoire sur différentes lignées : des plantes WT, des plantes qui surexpriment HMA1 sous le contrôle d'un promoteur fort constitutif 35S (3 lignées indépendantes), et deux lignées indépendantes d'insertion pour le gène HMA1 (ACT7 et DRC42, lignées issues de la banque de mutants d'insertion de l'INRA de Versailles).
Dans des conditions de croissance standard, les mutants d'insertion hma1 et les surexpresseurs ne présentent pas de phénotype morphologique apparent par rapport à des plantes WT. Cependant, les dosages de métaux effectués à partir de feuilles et de chloroplastes, issus de ces différentes lignées, montrent une diminution de 50 % du contenu en cuivre dans les chloroplastes des mutants hma1. Aucune variation significative n’a été trouvée pour les autres ions métalliques analysés. La surexpression de HMA1 dans un fond génétique sauvage Ws n’induit pas d'accumulation de métaux ni dans la feuille, ni dans les chloroplastes.
Ces diverses plantes ont une croissance identique en condition normale de culture. En revanche, les mutants d'insertion hma1 présentent une photosensibilité pour des intensités lumineuses supérieures à 180 µmoles de photon / sec / m2, photosensibilité se traduisant par à un blanchissement total ou partiel ("variegated phenotype") des feuilles. Ce phénotype de photosensibilité du KO hma1 n'est pas supprimé par addition de cuivre dans le milieu de culture.
Les plantes surexprimant HMA1 ne sont pas sensibles à de fortes concentrations en cuivre, ce qui est en accord avec le fait que les chloroplastes des surexpresseurs HMA1 n'accumulent pas plus de cuivre que les chloroplastes sauvages (Seigneurin-Berny et al., 2006). Ceci suggère l'existence d’un système de régulation de l'homéostasie du cuivre dans le chloroplaste
Données bibliographiques
32 impliquant soit une/des métallochaperonnes, un système d’efflux de ce métal ou encore un contrôle de l'activité des ATPases HMA1 et PAA1.
Dans le chloroplaste, le cuivre est utilisé par deux protéines : la SOD Cu/Zn (CSD2) qui intervient dans la détoxification des espèces activées de l’oxygène, et la plastocyanine qui intervient dans la chaîne de transfert d’électrons photosynthétiques. L’expression de ces deux protéines a donc été analysée dans les mutants hma1 et les surexpresseurs HMA1. Les mutants hma1 ont une activité SOD chloroplastique totale (SOD Cu/Zn et SOD Fe) réduite de moitié par rapport à l’activité mesurée dans les plantes sauvages et les surexpresseurs. Ces mutants présentent aussi une diminution de transcrits de CSD2. En revanche, aucune variation du pool de plastocyanine n’a été mesurée (collaboration Giovanni Finazzi et Fabrice Rappaport, IBPC, Paris). Il est probable qu’en condition de stress lumineux, l’activité SOD chloroplastique des mutants hma1 devienne limitante. Il en résulte ainsi une plus faible détoxication des radicaux libres produits par l’activité photosynthétique, ce qui se traduit par un blanchiment total ou partiel des feuilles.
Des mesures d'activité ATPase réalisées sur les membranes d'enveloppe de chloroplastes des différentes lignées (WT, mutant d'insertion et surexpresseurs) montrent que l'activité ATPase associée à HMA1 est spécifiquement augmentée en présence de cuivre. Ces mesures montrent que les ions cobalt, zinc, argent, manganèse ou fer n’ont pas d’impact sur l’activité de HMA1. De plus, ces mesures montrent que l'activité mesurée dans l'enveloppe de chloroplastes des mutants hma1 est toujours (avec ou sans ajout d’ions métalliques) plus faible que celle mesurée dans l'enveloppe de chloroplastes issus de plantes WT. Ceci suggère que l'activité de PAA1 ne compense pas la perte de HMA1.
La caractérisation des mutants d'insertion hma1 et les analyses biochimiques (mesure de l'activité ATPase) montrent donc que HMA1 (comme PAA1) est impliquée dans le transport du cuivre au sein du chloroplaste.
3. Rôles respectifs de HMA1 et PAA1 dans l'enveloppe des chloroplastes ?
Ainsi, la membrane interne de l’enveloppe du chloroplaste contient deux ATPases de type P1B, HMA1 et PAA1, qui sont impliquées dans l'import du cuivre dans le chloroplaste. Les
phénotype des mutants affectés dans l’expression de ces deux protéines présentent des similarités importantes : les chloroplastes des mutants d’insertion hma1 (Seigneurin-Berny et al., 2006) comme les chloroplastes des mutants paa1 (Shikanai et al, 2003) contiennent moins de cuivre et une activité SOD réduite. En conséquence, les mutants d’insertion hma1 comme les mutants paa1 sont photosensibles.
Toutefois, l’interruption des gènes codant ces deux ATPases HMA1 et PAA1 a aussi des conséquences différentes suggérant que, si l’activité de ces deux protéines est similaire, leurs rôles respectifs sont différents in planta. En effet, contrairement aux mutants hma1, les mutants paa1 ont un pool de plastocyanine réduit et leur phénotype peut être supprimé par ajout de cuivre dans le milieu de culture (Abdel-Ghany et al., 2005). Au contraire, les mutants
Données bibliographiques
33 hma1 ne sont pas affectés dans leur pool de plastocyanine et l’ajout de cuivre dans le milieu de culture ne restaure pas le développement des mutants hma1 cultivés sous une forte intensité lumineuse. Ceci suggère que l’ATPase PAA1 ne peut compenser la perte de HMA1, même lorsque les plantes sont cultivées en présence de concentrations plus importantes de cuivre. Ces observations sont en accord avec les mesures d’activité ATPase réalisées sur les fractions d’enveloppe purifiée, qui démontrent qu’en présence de cuivre, l’activité ATPase totale mesurée sur l’enveloppe des chloroplastes des mutants hma1 n’atteint pas la valeur mesurée sur l’enveloppe des plastes issue des plantes WT. Ces résultats suggèrent aussi que les plantes n’ont pas la possibilité de surexprimer PAA1 en réponse à la carence de HMA1.
L'ensemble de ces données suggère que ces deux ATPases jouent un rôle différent dans
l’homéostasie et l’import du cuivre dans le chloroplaste. Ainsi, PAA1 représenterait la
voie principale d’import du cuivre dans le chloroplaste pour alimenter la photosynthèse (la plastocyanine) alors que HMA1 constituerait une voie additionnelle d’import du cuivre, voie essentielle à la plante pour répondre à un stress oxydatif généré notamment lors de fortes intensités lumineuses (Figure 17). La sélectivité des deux voies pourrait avoir plusieurs origines. Il a été proposé que PAA1 fournirait du cuivre à une métallochaperonne (CCS) qui interagirait avec la SOD chloroplastique Cu/Zn et à PAA2 via une métallochaperonne encore non identifiée (Pilon et al., 2006). HMA1 pourrait transférer le cuivre à CCS ou une autre métallochaperonne (X dans le modèle) qui interagirait principalement avec la SOD puisque seule l'activité SOD est affectée chez les mutants hma1. Une différence entre ces deux ATPases pourrait aussi provenir de la charge (cuivre 2+ pour HMA1, cuivre 1+ pour PAA1) du cuivre transporté.
Figure 17 : Modèle présentant les rôles potentiels de HMA1 et PAA1 dans l'import du cuivre chloroplastique.
PTP : transporteur de phosphate/trioses-phosphate ; BC : cycle de Benson & Calvin ; PC : plastocyanine ; CCS : métallochaperonne à cuivre. Cytosol Cu ATP HMA1 ATP ADP NADP Cycle BC Pi PTP O2 H2O Stroma PAA1 ATP ADP Cu/Zn SOD PC PC PC PC Free - PAA2 Cu ATP ADP NADPH HMA1 ADP + Pi HMA1HMA1 ATP ADP NADP Cycle BC Pi PTPPTP O2 H2O PAA1 PAA1 ATP ADP + Pi Cu Cu X X CCSCu ? Cu/Zn SOD SOD Cu/Zn PC PC PCPC PC PC PC PC Free - PAA2 PAA2 Cu ATP ADP + Pi CCS CCSCCS Cu ? NADPH CO2 Y e- Cu ?
Données bibliographiques
34 Quel que soit le modèle envisagé, ces données obtenues sur les protéines HMA1, PAA1 et PAA2 suggèrent que les plastes ont besoin de plusieurs systèmes de transport du cuivre et
d’une régulation fine de ces voies d'import afin de fournir le cuivre nécessaire à la photosynthèse et afin de répondre aux stress oxydatifs générés lors de fortes intensités
lumineuses.
V. OBJECTIFS DU TRAVAIL
Les objectifs du travail de thèse reposaient sur le constat suivant : la membrane interne de l’enveloppe contient deux ATPases permettant l’import du cuivre dans le chloroplaste. Nous avons donc souhaité identifier la raison de cette apparente redondance fonctionnelle. Afin d’obtenir de nouvelles informations sur HMA1 et PAA1, nous avons développé en parallèle deux stratégies complémentaires :
- La première stratégie était basée sur l’étude des rôles respectifs de HMA1 et de PAA1
in planta et reposait en particulier sur la disponibilité des deux mutants d’insertion hma1
(disponible au laboratoire) et paa1 (collaboration avec Marinus Pilon, USA).
- La seconde stratégie visait à caractériser in vitro ces deux ATPases afin de
déterminer leurs spécificités ioniques. Cette stratégie reposait sur un pré requis essentiel :
réussir à produire les protéines HMA1 et PAA1 dans un système hétérologue adapté aux protéines membranaires.