Phénotype des surexpresseurs HMA1 et HMA1 ∆HIS dans paa

Afin de déterminer si les surexpressions de HMA1 ou de HMA1∆HIS permettent de compenser le phénotype lié à la perte de fonction de PAA1, nous avons analysé le phénotype de ces lignées dans différentes conditions de culture.

Comme cela a déjà été observé précédemment, le phénotype de retard de croissance du mutant paa1 par rapport à des plantes sauvage est supprimé après ajout de cuivre dans le milieu de culture (Figure 37, A. et B.).

La surexpression de HMA1 ou de HMA1∆HIS dans le mutant paa1 ne permet pas de supprimer le phénotype induit par la perte de fonction de PAA1, lorsque les plantes sont cultivées dans un milieu MS standard et en faible intensité lumineuse (Figure 37, A.). En effet, les plantes qui surexpriment les deux formes de HMA1 présentent la même morphologie et la même croissance que le mutant paa1. Aucune différence n'est visible entre ces lignées lorsque du cuivre est ajouté dans le milieu de culture, sous une intensité lumineuse de 50 µmoles de photons / sec / m2. Comme observé pour le mutant paa1, le cuivre supprime le retard de croissance des lignées KO paa1 x 35S HMA1 et KO paa1 x 35S HMA1∆HIS (Figure 37, B.).

Lorsque ces plantes sont cultivées sous une intensité lumineuse plus forte et sur un milieu contenant du cuivre 2 µM (Figure 37, C.), des différences importantes sont observées entre les différentes lignées. En effet, les plantes sauvages, le mutant paa1 ainsi qu’une des deux lignées mutantes paa1 exprimant la forme complète de HMA1 (Figure 37, C. #4) se développent de la même manière. En revanche, les trois autres lignées présentent un phénotype de photosensibilité très prononcé (Figure 37, C.).

La différence de phénotype entre les deux lignées KO paa1 x 35 HMA1 étant inattendue, nous avons vérifié le niveau d'expression de HMA1 dans ces plantes par immunomarquage.

Chapitre I : Etude des rôles respectifs de HMA1 et de PAA1 in planta

93 Comme attendu, les lignées sauvages et le mutant paa1 expriment peu HMA1. De façon surprenante, la lignée KO paa1 x 35S HMA1 (Figure 37, D. #4 ; lignée 1032-4) présente aussi un signal d’immunomarquage faible indiquant que HMA1 est très peu surexprimée. Ce résultat est surprenant car cette lignée homozygote est issue d'une plante hétérozygote qui surexprime fortement HMA1 (Figure 37). Il est possible que dans la lignée homozygote, la surexpression de HMA1 ait induit une réponse de la plante par ARN interférent (Mourrain et al., 2000). Les trois autres lignées (Figure 37, D. #3, #6, #7 correspondant respectivement aux lignées 1023-4, 1042-5 et 1043-7) expriment fortement HMA1 et plus particulièrement les lignées surexprimant HMA1∆HIS. La protéine LHCP (Light Harvesting Chlorophyll Protein) a été utilisée comme contrôle de charge. L’immunomarquage indique qu’une quantité équivalente de LHCP est présente dans les différentes fractions analysées. Nous pouvons donc conclure que le phénotype de photosensibilité observé est lié au niveau de surexpression de HMA1.

Ces résultats sont inattendus car nous supposions que la surexpression de HMA1 dans des mutants paa1 permettrait de supprimer le phénotype induit par la perte de fonction de PAA1 or nous observons le contraire : la surexpression de HMA1 amplifie la photosensibilité du mutant paa1. La surexpression de HMA1 dépourvue de son domaine riche en histidines dans le fond génétique mutant paa1 induit le même phénotype que la surexpression de la forme entière de HMA1. Ceci indique que la protéine HMA1∆HIS se comporte de la même manière que HMA1, et donc que le domaine riche en histidines n’est pas essentiel pour l’activité de la protéine.

Le phénotype de photosensibilité des différentes lignées mutantes paa1 surexprimant HMA1 est en accord avec le phénotype du mutant hma1 décrit lors de travaux précédents effectués dans l’équipe (Seigneurin-Berny et al., 2006). Ce résultat est en accord avec l'existence d'un lien entre l’activité de HMA1 et l’intensité lumineuse. Nous avons aussi remarqué que plus la concentration en cuivre dans le milieu est forte, plus le phénotype de photosensibilité est prononcé (non montré) indiquant que ce phénotype est aussi lié au cuivre.

Les résultats obtenus indiquent qu’il n’y a pas de redondance fonctionnelle entre HMA1 et PAA1 car plutôt que de compenser la perte de fonction de PAA1, la surexpression de HMA1 amplifie le phénotype de photosensibilité du mutant paa1. Cette photosensibilité accrue n’est mise en évidence que sur un milieu riche en cuivre, condition permettant de supprimer le phénotype de paa1. Des études précédentes suggèrent que HMA1 fournirait du cuivre à une métallochaperone qui n'interagirait qu'avec la SOD CSD2 (Seigneurin-Berny et al., 2006). Ainsi, le phénotype observé pourrait être provoqué par un excès de cuivre dans le chloroplaste, cuivre qui ne serait adressé qu'à la SOD CSD2. Cette SOD pourrait constituer une réserve de cuivre dans le chloroplaste (Cohu & Pilon, 2006) mais il est possible que cette protéine ne soit pas suffisante pour prendre en charge l’excès de cuivre chloroplastique induit par la surexpression de HMA1.

Chapitre I : Etude des rôles respectifs de HMA1 et de PAA1 in planta

94 Figure 37 : Impact du cuivre et de la lumière sur la croissance les mutants paa1 surexprimant HMA1 et HMA1∆His.

Les graines issues de différentes lignées sont semées sur milieu MS (A) ou MS + cuivre 2 µM (B et C). Le milieu de culture contient aussi du saccharose 0,5 % (p/v). Les plantules sont cultivées sous une intensité lumineuse de 50 µmoles de photons / sec / m2 (A et B) ou 200 µmoles de photons / sec / m2 (C) pendant 21 jours. 1 : WT (Col) ; 2 : KO paa1.1 ; 3 : KO paa1 x 35S HMA1 lignée 1023-4 ; 4 : KO paa1 x 35S HMA1 lignée 1032-4 ; 5 : KO paa1 x 35S HMA1∆HIS lignée 1042-5 ; 6 : KO paa1 x 35S HMA1∆HIS lignée 1043-7. Afin de vérifier le niveau d'expression de HMA1 dans les lignées de plantes utilisées pour ce test phénotypique, les protéines membranaires extraites à partir de feuilles de ces différentes lignées sont séparées (15 µg) par SDS-PAGE et transfert sur membrane de nitrocellulose. La présence de HMA1 est révélée par un immunomarquage réalisé avec l’anticorps dirigé contre HMA1 (D). La détection de la protéine LHCP est utilisée comme contrôle de charge.

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C. Dosages de métaux dans les chloroplastes des mutants paa1-1 surexprimant