Identification par spectrométrie de masse de protéines potentiellement induites par l'expression de HMA1 chez L lactis

L’analyse par SDS-PAGE des extraits de protéines membranaires bruts issus des souches de L. lactis exprimant les différentes protéines montre qu'une protéine s'accumule dans les membranes issues de souches exprimant HMA1 (Figure 56). Cette protéine, d'environ 90 Kda, ne semble pas être présente dans les autres extraits et pourrait donc être induite en

Chapitre III : Vers la caractérisation fonctionnelle de HMA1 et PAA1

130 réponse à l'expression de HMA1. L'identité de cette protéine pouvant nous donner des informations sur l’impact de HMA1 lorsqu'elle est surexprimée dans les bactéries L. lactis, nous avons cherché à l’identifier.

Figure 56 : L’expression de HMA1 chez L. lactis induit la surexpression d’une autre protéine.

Les protéines membranaires issues des différentes souches de L. lactis sont analysées par électrophorèse SDS-PAGE (15 µg de protéines par puits) et coloration au bleu de Coomassie. Les protéines analysées sont issues des bactéries transformées par un plasmide non recombinant (vecteur vide) ou un plasmide contenant l’ADNc codant pour ceQORH, HMA4, HMA1-AKT ou HMA1. Toutes les expressions ont été effectuées pendant 4 h sauf pour l’échantillon HMA1-1h30 pour lequel l’expression a duré 1h30. L’astérisque correspond à HMA1 et la flèche correspond à la protéine qui apparaît suite à l’expression de HMA1.

Nous avons obtenu les informations de séquences correspondant aux protéines se trouvant dans une bande voisine de 90 kDa pour chacun des extraits de protéines membranaires. Ces expériences ont été réalisées en collaboration avec le laboratoire d’Etudes de la Dynamique des Protéomes (iRTSV/EDyP, CEA Grenoble).

Dans cette expérience, les contrôles négatifs utilisés sont les extraits de protéines membranaires issus de bactéries transformées par un vecteur non recombinant ou par un vecteur contenant l'ADNc codant pour la protéine ceQORH (Miras et al., 2007). Cette protéine d’Arabidopsis n’a pas de rôle dans l’homéostasie du cuivre. Suite aux résultats obtenus sur la croissance des bactéries en présence de cuivre (paragraphe I, A.), nous avons aussi analysé les protéines membranaires issues de bactéries exprimant HMA4 et HMA1- AKT (forme inactive de HMA1). Ces différents extraits de protéines membranaires ont été obtenus après une induction de l'expression des protéines recombinantes pendant 4h. Afin de suivre l'apparition de la protéine détectée dans les protéines membranaires issus des bactéries exprimant HMA1, nous avons aussi analysé un extrait obtenu après seulement 1h30 d'induction.

Le tableau contenant les protéines identifiées est présenté en annexe 3. Cette étude n'a pas permis d’identifier une protéine présente uniquement dans les extraits membranaires issus de bactéries surexprimant HMA1 comme cela était espéré après l'analyse des profils protéiques par SDS-PAGE (Figure 56). Cependant, deux ATPases impliquées dans le transport de cations (par similarité) semblent s’accumuler dans les extraits issus des bactéries exprimant HMA4, HMA1 et HMA1-AKT. Le nombre de peptides détectés pour ces deux protéines étant assez faible, il est difficile de déterminer si ces variations sont significatives. Ces deux protéines étant impliquées dans le transport de cations, elles pourraient être impliquées dans le

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131 phénotype de sensibilité au cuivre observé pour les bactéries exprimant HMA4, HMA1 et les formes mutées de HMA1.

E. Conclusion

Les résultats présentés dans cette partie ne nous permettent pas de mettre en évidence une activité de transport d’ions liée à la protéine HMA1. Nous avons bien observé un impact de la présence de la protéine HMA1 sur la croissance des souches de L. lactis ou sur l’accumulation du cuivre dans ces bactéries comparativement aux souches contrôles contenant un vecteur non recombinant. Toutefois, il semble que la forme de HMA1 mutée au niveau de son site

DKTGT induise systématiquement les mêmes effets que ceux observés pour la protéine

HMA1 mature (voir figures 53 et 54). Ce résultat est d’autant plus surprenant que cette mutation, qui empêche la phosphorylation de l’enzyme lors de son cycle catalytique, inactive la protéine.

L’expression des ATPases HMA1, PAA1 et HMA4 induit une sensibilité des souches de L. lactis vis à vis du cuivre. Ce résultat est surprenant pour deux raisons :

- L’expression d’ATPases de type P1B en systèmes hétérologues induit généralement une

résistance aux métaux (Liu et al., 2007, Lewinson et al., 2009) en permettant aux organismes d'exporter ces métaux. Toutefois, HMA1 et PAA1 sont des ATPases associées à l'enveloppe des chloroplastes et sont impliquées dans l'import de métaux dans cet organite subcellulaire. Il est donc possible que ces ATPases soient intégrées dans la membrane plasmique des bactéries dans une orientation qui est compatible avec l'import des métaux.

- De plus, nous observons que l’expression de HMA4 confère une sensibilité au cuivre alors que cette protéine n’est pas connue pour transporter du cuivre (Mills et al., 2003).

L'expression des formes mutées de HMA1 (HMA1-AKT, HMA1∆His et HMA1 60-465) entraînant aussi une sensibilité au cuivre, nous avons dosé le cuivre contenu dans les culots bactériens récoltés après 6h d'expression. L'objectif était de pouvoir déterminer si la toxicité observée était liée à une accumulation de cuivre dans la cellule ou à une augmentation de la concentration en cuivre au niveau de la membrane plasmique entraînant un stress oxydatif. Les dosages de métaux réalisés par ICP-MS montrent que l'expression de HMA1, HMA4, PAA1 et des formes mutées de HMA1 induit une accumulation de cuivre dans le cytoplasme des bactéries. Deux hypothèses peuvent expliquer ce résultat :

- HMA4 et HMA1-AKT ne pouvant théoriquement pas transporter de cuivre, il est possible qu'en présence d'une forte concentration en cuivre et après plusieurs heures d'exposition au métal, ces protéines se comportent comme des porines induisant alors 1) un transport du cuivre sans utilisation d'ATP pour HMA1-AKT, et 2) une perte de la sélectivité ionique pour HMA4. Cette hypothèse pourrait être facilement vérifiée en effectuant les dosages après des

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132 cinétiques d'expression beaucoup plus courtes pour essayer de distinguer une constante catalytique et une constante diffusionnelle dans l’accumulation des métaux.

- La deuxième hypothèse est que l’expression de ces ATPases chez L. lactis induit la surexpression de protéines liées à l’homéostasie du cuivre. Les ATPases de type P1B CopA et

CopB sont impliquées dans le transport du cuivre. Des homologues de ces protéines sont présents chez Lactococcus et il a été montré que leur niveau d'expression augmente en réponse à un excès de cuivre dans le milieu environnant les bactéries (Magnani et al., 2008). Nous avons analysé par RT-PCR le niveau d'expression de CopA et CopB dans les bactéries exprimant les diverses protéines recombinantes en comparaison avec des bactéries transformées avec un vecteur non recombinant. Ces expériences n’ont pas permis de mettre en évidence une augmentation du niveau de transcription de CopA et de CopB dans des bactéries exprimant HMA1 ou PAA1. En revanche, une augmentation de l'expression de CopA et CopB est observée pour les bactéries exprimant HMA4. HMA4 étant impliquée dans l'homéostasie du zinc, cette augmentation est probablement un effet indirect qui reste inexpliqué pour l'instant. L'expression de CopA et de CopB étant induite par le cuivre, elle peut être directement liée à l'expression des protéines HMA1 et PAA1 si ces dernières sont actives dans les membranes de Lactococcus. Au contraire, cette réponse peut être indirectement reliée à l'expression des protéines HMA1 et PAA1 si ces deux ATPases sont inactives mais induisent un import de cuivre via les transporteurs de type CopT. Aucune variation des niveaux des transcrits CopA et CopB n'a été détectée dans les bactéries exprimant HMA1 et PAA1 lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu non supplémenté en cuivre. Il est donc possible que les concentrations en cuivre dans le milieu de culture soient trop faibles pour observer un import de cuivre. En effet, les dosages de métaux par ICP-MS n’indiquent pas de hausse significative de la concentration en cuivre dans les échantillons de L. lactis exprimant ces protéines dans un milieu non supplémenté en cuivre. Nous avions choisi ces conditions de culture car nous voulions observer des variations de transcription de CopA et CopB induites par l'expression de HMA1, PAA1 ou HMA4 et ne résultant pas des concentrations importantes de cuivre dans le milieu. Il serait intéressant de reproduire ces expériences dans des conditions de concentrations en cuivre permettant à la fois une faible induction de l'expression de CopA et CopB dans des bactéries sauvages mais permettant une accumulation suffisante de cuivre dans les bactéries exprimant HMA1, PAA1 pour voir l'impact de ce transport sur l'expression de CopA et CopB. Enfin, l'expression des transcrits peut être découplée de la quantité de protéine produite. La quantification des protéines CopA et CopB présentes dans les bactéries exprimant HMA1, PAA1 et HMA4, pourrait être effectuée par immunomarquage ou par spectrométrie de masse.

Au final, l'ensemble des expériences réalisées dans cette partie ne nous a pas permis de démontrer de façon définitive que la protéine HMA1 exprimée chez Lactococcus était active. Nous avons donc cherché à mesurer directement l’activité des protéines HMA1 et de PAA1

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133 dans des extraits de protéines membranaires issus de bactéries surexprimant ces protéines et sur les protéines recombinantes HMA1 et PAA1 purifiées.

II. MESURE DE L’ACTIVITE ATPASIQUE DE HMA1 ET DE PAA1

Les ATPases de type P sont caractérisées par leur capacité à hydrolyser une molécule d’ATP lors de leur cycle catalytique. Cette hydrolyse d’ATP permet de fournir l’énergie nécessaire au transport du métal de part et d’autre d’une membrane biologique. Une méthode permettant de suivre l’activité de transport d’une ATPase de type P repose donc sur la mesure de cette activité d’hydrolyse d’ATP corrélée avec la translocation du métal de part et d’autre d’une membrane (voir introduction, Figure 8).