Purification par Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) semi-

Au vu des chromatogrammes des fractions F3, F4, F8 et F9 (Figure 42), ainsi que des quantités obtenues pour chacune d’elles (Tableau 48), la HPLC semi-préparative est choisie pour la purification de leurs composés majoritaires (Figure 39).

1. Matériel et méthodes

Chaque fraction a été traitée séparément par HPLC semi-préparative équipée d’une colonne Kinetex XB-C18 (21,2 x 250 mm, 5 μm, Phenomenex). La phase mobile était constituée d’un mélange H₂O + 0,1 % d’acide formique (phase A) et d’ACN + 0,1 % d’acide formique (phase B). Le débit était fixé à 20 mL/min et les gradients ont été optimisés afin de séparer au mieux les composés des fractions F3 et F4 (Gradient III) et ceux des fractions F8 et F9 (Gradient IV). Les conditions chromatographiques utilisées sont détaillées dans le

163

Tableau 49. Gradients utilisés pour la purification par HPLC semi-préparative des composés

présents dans les fractions F3, F4, F8 et F9.

Gradient III F3 et F4 ^{Temps (min) 0 3,3 15 29,5 37 53 60 61 70} % B 5 5 13 21 30 100 100 5 5 Gradient IV F8 et F9 ^{Temps (min) 0 3,3 29,5 40 47,5 53 60 61 70}

% B 5 5 13 21 30 100 100 5 5

Les échantillons ont été préparés dans 500 μL de H₂O/MeOH : 80/20 et filtrés à 0,45 µm avant injection. Une première injection de 5 mg a permis de contrôler l’efficacité de la séparation et de déterminer les temps de rétention des composés. Le solde des échantillons a été traité par des injections successives de 20 mg. Les détecteurs UV et DEDL ont permis de suivre l’élution des composés et de les collecter manuellement à la sortie du système. Pour chaque tube, une aliquote de 50 µL a été prélevée, diluée par 10 avec de l’eau ultra-pure, et injectée en LC-FTMS afin d’étudier sa composition. Pour chaque injection, des tubes dont le contenu présentait un seul pic chromatographique (composé pur) ont été obtenus. Les tubes des différentes injections contenant les mêmes composés purs ont ensuite été regroupés et lyophilisés en vue d’être dégustés.

2. Résultats

a) Résultats des purifications

Plusieurs composés majoritaires et familles de composés sont observables dans les quatre fractions d’intérêt. Dans la suite de ce travail, ces composés seront désignés, pour des raisons de simplification, par la masse nominale m/z de leur ion déprotoné [M-H]^-.

Les fractions traitées par HPLC semi-préparative possédaient une saveur sucrée, mais la nature des composés sapides était inconnue. Par conséquent, l’objectif était de collecter les molécules correspondant aux pics majoritaires (notés « pics 1, 2... »), mais également de récupérer la phase mobile éluée entre ces pics (notée « élution »). En effet, des composés non détectables, car présents à faible concentration, pourraient contribuer significativement au goût de la fraction. Le détecteur UV à 280 nm a été utilisé, mais il a été complété pour cette application, par un détecteur DEDL, présentant un caractère universel. Ainsi le Tableau 50, récapitule les composés qui ont pu être isolés ainsi que les élutions collectées entre les pics.

164

Tableau 50. Purifications des fractions F3, F4, F8 et F9 par HPLC semi-préparative.

Fraction

traitée ^{Pic/Elution m/z observé Masse (mg)}

F3 ^{Pic 1 331 1,3}

Elution 523 ; Flav.* 57,3

F4

Pic 1 331 « grains de poudre »

Pic 2 366 « grains de poudre »

Elution 331 ; 366 ; Flav.* 7,9

F8

Pic 1 443 « grains de poudre »

Pic 2 366 « grains de poudre »

Pic 3 521 « grains de poudre »

Elution 293 ; 366 ; 347 ; 443 ; 521 ; Flav.* 5,5

F9

Pic 1 293 « grains de poudre »

Pic 2 443 « grains de poudre »

Elution 293 ; 347 ; 443 ; 521 ; Flav.* 4,8 * Flav. : composés de la famille des flavonoïdes (dérivés et oligomères).

Les composés correspondant aux pics collectés dans les fractions d’intérêt sont purifiés en très faible quantité, non mesurable (« grains de poudre »). Les analyses LC-FTMS montrent que ces composés sont encore présents dans les restes des élutions en tant que composés plus ou moins majoritaires. Des flavonoïdes semblent être répartis sur toutes les fractions. Cela s’explique en partie par les états de polymérisation, de glycosylation et galloylation des composés, modifiant leur polarité (Escribano-Bailon et al., 1992 ; Yanagida

et al., 2000 ; Yanagida et al., 2003).

b) Résultats de la dégustation

Malgré les faibles quantités obtenues lors des purifications, la dégustation des différentes fractions d’élution et composés purifiés est tout de même réalisée en solution hydro-alcoolique. Les composés purs, m/z 293, 366, 443 et 521, sont dégustés sans connaître leur concentration (inférieure à 2 mg/L), puisque seuls quelques grains de poudre sont recueillis. Le composé m/z 331 est dégusté à 10 mg/L. Les fractions « élutions » sont dégustées à 20 mg/L. Les résultats sont regroupés dans le Tableau 51.

165

Tableau 51. Résultats de la dégustation après purification par HPLC semi-préparative.

Composé pur (m/z) « Elution »

293* 331 366* 443* 521* Elution-F3 Elution-F4 Elution-F8 Elution-F9

Goût Sucré Sucré - Sucré - - - ^Amer

Astringent ^Sucré Intensité

de la douceur

3/7 3/7 - 4/7 - - - - 5/7

* Concentrations des composés inconnues.

- : Fractions ne présentant aucun goût en comparaison avec le verre témoin.

La dégustation des composés purs donnent dès lors quelques indications sur leur goût. Les composés m/z 293, 331 et 443 présentent une saveur sucrée en comparaison au verre témoin. De plus, la douceur la plus intense reportée est celle de la fraction Elution-F9 avec une intensité de 5 sur 7.

3. Discussion

La purification des composés majoritaires des fractions d’intérêt n’a pas atteint son objectif puisque les composés n’ont pas été obtenus en quantité suffisante pour permettre leurs caractérisations structurale et gustative. Cependant, leur dégustation, ainsi que celle des fractions « élution » mettent en évidence quelques résultats sensoriels intéressants. En particulier, les composés m/z 293, 331 et 443 semblent être des composés d’intérêt dans la recherche de composés à saveur douce. La fraction Elution-F9 présente la plus forte intensité de douceur (5/7) de cette dégustation. L’étude de son profil chromatographique en LC-FTMS permet d’observer les composés suivant : m/z 293, 347, 366, 443 et 521, comme l’illustre le chromatogramme des ions totaux de la Figure 43.

166

Figure 43. TIC en ionisation négative de la fraction Elution-F9 après purification par HPLC

semi-préparative (gradient LC : B).

La suite de ce travail a donc consisté à purifier les composés présents dans la fraction

Elution-F9 en quantité suffisante pour permettre leur caractérisation structurale et gustative.

Le composé m/z 331 a également été ciblé en raison de son goût potentiellement intéressant. Une optimisation des méthodes de fractionnement de l’extrait de pépins a été nécessaire pour isoler ces composés d’intérêt.

E. Optimisation des méthodes de fractionnement en vue de la purification des