HPLC semi-préparative

La dernière étape de purification des composés cibles a été réalisée par HPLC semi-préparative. Elle a nécessité la mise au point de gradients adaptés. Celle-ci a été réalisée à l’aide de la LC-FTMS, en utilisant des colonnes analytiques de phase identique aux colonnes de taille semi-préparative disponibles pour les purifications.

La colonne semi-préparative Atlantis T3 Prep OBD (19 x 250 mm, 5 μm, Waters) a été choisie ici. La phase mobile était constituée d’un mélange H2O + 0,05 % de TFA (phase

A) et d’ACN + 0,05 % de TFA (phase B). Le débit a été fixé à 20 mL/min et deux gradients

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(Gradient I) et ceux de la fraction BuOH (Gradient II). Les conditions chromatographiques utilisées sont détaillées dans le Tableau 15.

Tableau 15. Gradients utilisés en HPLC semi-préparative pour la purification des composés

cibles.

Gradient I ^{Temps (min) 0 5 15 19 30 35 36 48 49 60} % B 17 17 23 23 38 80 100 100 17 17 Gradient II ^{Temps (min) 0 5 30 40 45 46 54 56 60}

% B 15 15 20 30 80 100 100 15 15

Les échantillons ont été préparés dans 500 μL de H₂O/MeOH : 50/50, filtrés à 0,45 µm puis injectés. Une première injection de 5 mg a permis de contrôler l’efficacité de la séparation et de déterminer les temps de rétention des composés. Puis, le reste des échantillons a été injecté par des aliquotes successives de 20 mg. La détection UV a permis de suivre l’élution des composés et de les collecter manuellement à la sortie du système. Une aliquote de 50 µL de chaque tube a été prélevée, diluée 10 fois avec de l’eau ultra-pure, et injectée en LC-FTMS afin de vérifier la pureté des composés. Les tubes de composés purs de chaque injection ont ensuite été regroupés et lyophilisés.

B. Résultats et discussion

La première étape d’évaporation du macérat est indispensable pour éliminer l’éthanol susceptible de perturber la partition des composés dans le système biphasique H2O/AcOEt. Elle réduit également le volume initial de la phase aqueuse, et donc les quantités de solvant nécessaires pour les extractions L/L.

L’extraction L/L permet un premier fractionnement de l’extrait ainsi que l’élimination de composés non recherchés. L’analyse LC-FTMS met en évidence la présence des composés non-glycosylés dans l’extrait AcOEt et des composés glycosylés dans l’extrait BuOH (Figure 11).

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Figure 11. TIC en ionisation négative des extraits AcOEt (à gauche) et BuOH (à droite).

Au vu des profils chromatographiques complexes et des masses conséquentes obtenues pour les extraits pré-purifiés AcOEt et BuOH, la CPC apparait bien adaptée à un second fractionnement. Les tests de partage effectués au préalable permettent de choisir les systèmes de solvants adaptés pour une séparation optimale des molécules, avec une consommation de solvants et une durée de purification minimales. Les systèmes testés sont choisis en fonction de la polarité du type d’extrait à fractionner après l’extraction L/L. Les critères déterminants dans le choix des systèmes sont : la solubilisation de l’échantillon et l’obtention d’un K_D relativement proche de 1 (Maciuk, 2005). Ainsi les systèmes G_1A et « pont » P₁₄ sont choisis pour traiter, respectivement, les extraits AcOEt et BuOH.

Chaque expérience de CPC a permis le fractionnement de la totalité de chaque extrait en 4 heures avec la consommation d’un minimum de solvant en comparaison à d’autres techniques classiques de chromatographie liquide. La détection UV permet de suivre l’évolution de l’absorption à 254 et 280 nm au cours de la séparation. Les fractions enrichies en lignanes sont constituées par rassemblement des tubes de CPC après analyse en LC-FTMS. Ainsi, 2 fractions d’intérêt pour chaque expérimentation de CPC sont obtenues (Tableau 16).

Tableau 16. Fractions d’intérêt après CPC des extraits pré-purifiés AcOEt et BuOH.

Extrait Pré-purifié Fractions de CPC ^Tubes Masses obtenues (mg) ^Composés AcOEt ^{AcOEt-3 41 à 50 144 1, 2} AcOEt-4 51 à 71 812 8 BuOH ^{BuOH-3 72 à 108 574 3, 4, 7, 9} BuOH-4 109 à 151 442 5, 6

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Afin de réduire la masse des fractions BuOH-3 et -4 et d’enrichir les fractions en composés cibles, une étape supplémentaire par SPE est réalisée avant la purification par HPLC semi-préparative.

De cette manière, le Tableau 17 présente les masses des fractions enrichies en composés cible obtenues après SPE. On observe une élimination de plus de 50 % de la masse totale de chaque fraction sans perte significative de composés cibles. Cela met en évidence la grande quantité de molécules non recherchées dans les fractions BuOH-3 et -4 et la pertinence de cette étape. Le rendement global de la SPE correspond au rapport de la somme des masses des fractions obtenues après SPE sur la masse totale de la fraction de CPC de départ.

Tableau 17. Enrichissement des fractions par SPE avant purification.

Fractions CPC Masses Fractions CPC (mg) Rendement SPE (%) Fractions SPE Masses Fractions SPE (mg) Lignanes

BuOH-3 574 85 BuOH-3SPE 202,6 3, 4, 7, 9

BuOH-4 442 90 BuOH-4_SPE 123,8 5, 6

Enfin, la dernière étape de purification par HPLC semi-préparative est réalisée sur une colonne en phase inverse greffée C18. L’acidification des solvants A et B permet d’améliorer la résolution chromatographique à l’échelle semi-préparative et le TFA est facilement éliminé par évaporation.

Les composés de chaque fraction sont bien séparés avec les gradients choisis (Figure

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Figure 12. Chromatogrammes UV à 280 nm des extraits AcOEt-3 et -4 et BuOH-3_SPE et

-4_SPE en HPLC semi-préparative.

La collecte manuelle à la sortie du détecteur UV doit être réalisée avec précaution afin d’assurer la pureté des composés récupérés tout en limitant les pertes. Le niveau de pureté est vérifié en LC-FTMS. Les tubes pour lesquels la pureté est supérieure à 95 % sont regroupés et leur contenu est lyophilisé. Neuf composés sont ainsi obtenus sous forme de poudre blanche amorphe. Les masses obtenues des composés 1 à 9 sont présentés dans le Tableau 18.

Tableau 18. Masses obtenues des composés 1 à 9.

Composé 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Masse obtenue (mg) 6,7 6,5 7,8 7,9 15 2,5 3,2 9 3

Le développement du protocole de purification guidé par LC-FTMS a permis d’isoler 9 composés, d’une pureté chromatographique supérieure à 95 %. Les quantités obtenues sont suffisantes pour leur caractérisation structurale par RMN et l’étude de leurs propriétés sensorielles.

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