Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC)

a) Principe

La CPC est une méthode de chromatographie liquide/liquide sans support solide, mise au point par Nunogaki (Murayama et al., 1982). Elle est basée sur les différences de partage de divers solutés entre deux phases liquides non miscibles, préparées par mélange d’au moins deux solvants. L’appareil consiste en une colonne (rotor), constituée par la superposition de disques contenant de nombreuses cellules interconnectées. Cette colonne est mise en rotation autour d’un axe fixe, ce qui génère un champ de force centrifuge constant (Figure 3). Pour mettre en œuvre une expérience de CPC, les cellules sont d’abord remplies avec une première phase liquide (dite stationnaire). Puis la seconde phase liquide (mobile) est pompée avec un débit constant. Elle traverse la phase stationnaire de chaque cellule jusqu’à ce qu’un équilibre stable soit atteint entre les deux phases, sous l’effet du champ de force centrifuge. Les volumes totaux de phase stationnaire Vstat et de phase mobile Vmob restent constants dans la colonne au cours de l’expérience. L’échantillon est alors injecté et les solutés sont distribués entre les deux phases en fonction de leur affinité pour chacune d’entre elles. La différence de partage entre les divers solutés est à l’origine de leur séparation (Foucault et al., 1998).

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Figure 3. Description de l’appareil de Chromatographie de Partage Centrifuge et

schématisation de son fonctionnement (d’après Kromaton, Annonay, France et Armen Instrument, Saint Avé, France).

Le rotor de la CPC peut être utilisé en deux modes : le mode est dit ascendant, lorsque la phase mobile est introduite dans la cellule en sens inverse de la force centrifuge, ou descendant dans le cas opposé (Figure 4).

Figure 4. Schématisation des deux modes d’introduction des solvants dans la colonne

(d’après Toribio, 2007).

Afin d’optimiser le contact entre les deux phases et ainsi la séparation des solutés, le fractionnement débute en mode ascendant lorsque la phase stationnaire est plus dense que la phase mobile ou en mode descendant lorsque la phase stationnaire est la moins dense.

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Le choix du système de solvants est un facteur déterminant de la qualité de la séparation en CPC. La polarité, la proticité et la permittivité des phases influencent notablement la distribution des molécules et leur répartition entre les phases. Chaque soluté X du mélange possède en effet sa propre constante de partage, notée KDX. Elle se calcule selon l’équation suivante :

DX ^stat mob

où [X]stat et [X]mob désignent les concentrations de X respectivement dans la phase stationnaire et la phase mobile.

Par ailleurs, le système choisi doit être stable, solubiliser correctement l’échantillon injecté et ne doit pas former d’émulsion au contact de ce dernier, car l’injection entraînerait alors une déstabilisation du système nuisible à la séparation. Parmi l’infinité de systèmes de CPC pouvant être formés par mélange de solvants, ceux qui ont été utilisés dans ce travail appartiennent à deux grandes catégories.

Les systèmes « ponts » sont formés de deux solvants non miscibles tandis que le troisième est miscible avec les deux autres : il se répartit dans les deux phases et assure le transfert des molécules de l’une vers l’autre. Le système acétate d’éthyle/isopropanol/eau en est un exemple.

Les systèmes de la gamme Arizona (Renault et al., 2002 ; Maciuk, 2005) sont formés par 4 solvants (H2O, MeOH, AcOEt, Hept). Les proportions relatives de ces solvants définissent différents systèmes biphasiques stables au sein de cette gamme et déterminent la polarité des deux phases. Des systèmes dérivés peuvent être obtenus par substitution partielle du MeOH par l’ACN (Bisson, 2012) ou bien encore du MeOH par l’EtOH (Wu et al., 2012).

Les deux phases peuvent être préparées dans une ampoule à décanter avant le fractionnement : le mélange des solvants conduit à un état d’équilibre thermodynamique, chaque phase étant saturée l’une en l’autre.

b) Avantages et limites de la technique

La CPC présente de nombreux avantages par rapport aux autres techniques chromatographiques préparatives, et notamment la HPLC. En effet, la capacité de charge est élevée, jusqu’à 10 g d’échantillon pouvant être injectés dans le rotor de 1 L. En outre, l’absence de support solide permet de récupérer intégralement l’échantillon injecté, en évitant les phénomènes d’adsorption irréversible rencontrés en HPLC. Le temps de manipulation est également assez réduit : une séparation par CPC dure généralement de 1 à 3 heures. La

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quantité de solvant ramenée à la masse d’échantillon injectée est ainsi 5 à 10 fois plus faible qu’en HPLC (Maciuk, 2005), ce qui constitue des enjeux économiques et environnementaux non négligeables. Un nombre quasi infini de systèmes de solvants peuvent être générés : on dispose ainsi d’une variabilité de la phase stationnaire largement supérieure à celle disponible en HPLC. Bien que reposant sur des phénomènes d’interactions moléculaires, le principe de la CPC est différent de la HPLC et conduit à une séparation différente des solutés. Il s’agit d’une technique complémentaire à la HPLC et les deux peuvent donc être utilisées successivement dans un protocole de purification.

Cependant, l’utilisation de la CPC nécessite une optimisation importante, au niveau notamment du choix des solvants, afin d’obtenir une séparation maximale des solutés. Par ailleurs, la résolution chromatographique est généralement plus basse qu’en HPLC. L’utilisation de la CPC est donc à privilégier en amont des cascades de purification.

c) Appareillage

Le laboratoire est équipé d’un système Spot prep II LC connecté à un module SCPC-100+1000 (Armen Instrument, Saint-Avé, France). Ainsi le fractionnement peut être réalisé sur un rotor de 100 mL (11 disques, 90 cellules « twin cells » de 0,101 mL par disque) ou un rotor de 1 L (21 disques, 72 cellules « twin cells » de 0,555 mL). Les phases liquides sont pompées dans la colonne par une pompe 4 voies haute pression. L’injection est manuelle et les échantillons sont introduits dans la colonne par l’intermédiaire d’une valve automatique haute pression. Toutes les expérimentations sont conduites à température ambiante, avec une détection UV à 2 longueurs d’onde. La sortie du détecteur est connectée au collecteur de fractions du Spot prep II LC. Le système est entièrement contrôlé par le logiciel Glider Prep V5.0 (Armen Instrument, Saint-Avé, France).