Optimisation des méthodes de fractionnement en vue de la purification des composés

1. Stratégie

Afin de purifier les molécules observées dans des fractions sucrées (Elution-F9 et

F3), une approche ciblée a été mise en place à l’aide de la LC-FTMS. Pour cela, un criblage a

été mis en œuvre et les masses précises des ions quasi-moléculaires des composés d’intérêt ont été ciblées (Tableau 52) avec une précision de masse de ± 5 ppm.

Tableau 52. Masses précises m/z des ions quasi-moléculaires [M-H]^- des composés d’intérêt (précision à ± 5 ppm).

Composé

d’intérêt ion quasi-moléculaire [M-H]^m/z

-293 293,1229 331 331,0670 347 347,1165 366 366,1195 443 443,1924 521 521,2020

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Ainsi, pour chaque étape de fractionnement, les méthodes ont été adaptées afin d’optimiser la purification des composés d’intérêt en grande quantité. La démarche employée étant une approche ciblée sur des espèces chimiques, aucune dégustation n’a été réalisée au cours des étapes de fractionnement.

2. Optimisation des étapes de fractionnement et de purification

a) Extraction liquide/liquide de l’extrait de pépins

Les composés m/z 293, 331, 347, 366, 443 et 521 sont recherchés dans les extraits pré-purifiés de pépins après extraction L/L afin de vérifier leur présence.

Les composés m/z 293, 331, 347 et 521 sont essentiellement observés dans l’extrait

aqueuse tandis que les composés m/z 366 et 443 sont également détectés dans l’extrait φ-BuOHsat, co-élués avec des flavonoïdes. Contrairement à l’extrait φ-aqueuse pouvant être

traité directement par CPC à la vue de son profil chromatographique, l’extrait φ-BuOHsat nécessite au préalable une pré-purification par SPE. Pour cela, les échantillons sont chargés sur des colonnes SPE équipées d’une phase HLB, et des élutions avec des solutions à différents pourcentages d’ACN sont réalisées. L’analyse des éluats par LC-FTMS montre que les composés d’intérêt sont élués à 15 % d’ACN alors que les dérivés de flavonoïdes sont récupérés à des pourcentages en ACN plus élevés.

Ainsi, l’extrait φ-aqueuse et la fraction éluée à 15 % d’ACN de l’extrait φ-BuOHsat (φ-BuOHsat-15ACN) sont conservés pour des fractionnements ultérieurs.

b) Optimisation du fractionnement par CPC

Des tests de systèmes de CPC sont réalisés sur l’extrait aqueuse et sur la fraction

φ-BuOHsat-15ACN. Les tests sont réalisés avec des systèmes fortement polaires de type

« pont » BuOHsat/ACN/ H2O, BuOHsat/MeOH/H2O, AcOEt/MeOH/H2O, AcOEt/EtOH/H2O et AcOEt/BuOH/H2O en faisant varier les proportions des différents solvants. La stabilité des systèmes est vérifiée. Pour cela, après mélange des solvants et agitation, les deux phases doivent rapidement se séparer. Il est ensuite nécessaire de tester la solubilisation des extraits et des fractions d’intérêt dans ces systèmes. Les meilleurs systèmes sont ensuite sélectionnés en fonction des calculs de KD des composés cibles. Les systèmes choisis sont présentés dans le Tableau 53.

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Tableau 53. Systèmes de CPC sélectionnés pour la purification des composés cibles.

Système de CPC Extrait traité AcOEt/iPrOH/H₂O : 3/1/3 φ-aqueuse BuOHsat/ACN/H₂O : 4/1/4 AcOEt/MeOH/H₂O : 2/1/2 φ-BuOHsat-15ACN AcOEt/iPrOH/H₂O : 5/1/5 AcOEt/EtOH/H₂O : 6/1/6

Les méthodes de CPC sont également optimisées, essentiellement par le choix de la vitesse de rotation du rotor, où une plus forte vitesse de rotation (2500 rpm au lieu de 2000 rpm pour le rotor 100 mL) permet, dans certains cas, une meilleure stabilisation du système dans le rotor. Cette optimisation est appliquée notamment pour les systèmes « pont » BuOHsat/ACN/H2O, plus visqueux que les autres systèmes testés. Ainsi, l’augmentation de la vitesse de rotation, entraîne une meilleure dispersion de la phase mobile dans les cellules du rotor et augmente la surface d’échange des deux phases, permettant ainsi une meilleure séparation chromatographique (Berthod et al., 1992).

Après la réalisation des CPC, certaines fractions présentant des masses totales trop importantes pour être traitées par HPLC semi-préparative ont été pré-purifiées par SPE. Dans le cadre de l’utilisation de cette pré-purification par SPE, un compromis doit être trouvé entre l’enrichissement des fractions en composés cibles et les pertes occasionnées par adsorption irréversible sur la colonne.

A la fin de ces expériences de CPC et de SPE, les diverses fractions contenant les composés cibles sont conservées pour la dernière étape de purification par HPLC semi-préparative.

c) Optimisation de la purification par HPLC semi-préparative

L’optimisation de cette étape de purification consiste à choisir le type de colonne chromatographique, les solvants et les gradients d’élution Pour chaque fraction obtenue précédemment, des tests d’optimisation de méthodes sont réalisés en LC-FTMS à l’aide de colonnes analytiques, de phase similaire aux colonnes de taille semi-préparative. Ainsi, différentes associations de colonnes, de solvants et de gradients sont testées afin d’optimiser la séparation chromatographique et purifier les composés ciblés en un minimum de temps et de solvants.

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Les tests sur colonne analytique ont mis en évidence des variations de temps de rétention pour certains composés cibles en fonction du type d’acide utilisé (acide formique ou TFA) dans les solvants d’élution. Pour les fractions analysées, la meilleure séparation des composés cibles et une bonne reproductibilité sont observées en présence d’acide formique 0,1 % dans les deux phases A et B.

Les spécificités des colonnes utilisées sont résumées dans le Tableau 54. Ce sont des colonnes de type C18, présentant quelques différences de greffage. Cela leur offre certaines spécificités, comme une plus grande capacité de charge, une forte résistance au pH ou encore une meilleure rétention des composés polaires.

Tableau 54. Spécificité des colonnes à disposition au laboratoire pour l’optimisation des

méthodes en HPLC semi-préparative.

Nom de la colonne Fournisseur

Taille de particules (µm) Taille de la colonne (mm x mm) Spécificité

Atlantis T3 Prep Waters 5 19 x 250 ^{Bonne rétention de composés} polaires

Sunfire Waters 5 19 x 250 Grande capacité de charge XBridge PrepC18 Waters 5 19 x 250 ^{Utilisable dans une large}

gamme de pH (1-12) Kinetex XB-C18 Phenomenex 5 19 x 250 Résolutive

HypersilGold ^ThermoFisher

Scientific ^{5 19 x 250}

Résolutive Grande reproductibilité Utilisable dans une large gamme de pH (1-11)

Après optimisation des méthodes, les purifications sont menées par HPLC semi-préparative sur toutes les fractions obtenues lors des fractionnements antérieures. Ainsi, excepté pour le composé m/z 293, les composés d’intérêt sont purifiés en quantités supérieures à 2 mg (Tableau 55) permettant ainsi, parallèlement, leur caractérisation gustative et leur détermination structurale. En effet, Le composé m/z 293 s’est avéré être présent sous forme de deux isomères 293-1 et 293-2, ces derniers ont été purifiés en petite quantité permettant uniquement leur caractérisation structurale. En outre, ces isomères sont fortement polaires, puisqu’ils sont élués aux alentours de 7 % d’ACN avec le gradient utilisé en LC-FTMS. Leur purification, difficile avec les colonnes de type C18 dont le laboratoire dispose, pourrait être réalisée différemment à l’aide de colonnes à polarité de phase normale.

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Cependant ce type de colonne est fragile, nécessite un conditionnement long et complexe, et doit être utilisé avec des solvants différents, peu compatibles avec la dégustation ultérieure.

Tableau 55. Masses totales des composés purifiés.

Composé d’intérêt

m/z ^{293* 293-1 293-2 331 347 366 443 521} Masse totale (mg) 2 1,7 0,3 18 4 8,5 12,1 2 * mélange des deux isomères m/z 293-1 et m/z 293-2.

III. Caractérisation structurale et sensorielle des composés purifiés