Disponible à / Available at permalink :

- - -

- - -

Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Camby, I. (2001). Contribution à l'étude de la pathobiologie des tumeurs astrocytaires humaines : caractérisation de divers facteurs ayant un rôle régulateur de la migration des astrocytes tumoraux (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/211642/1/44015f2d-fa4a-40e1-bb03-9e88d4c03243.txt

(English version below)

Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université ([email protected]).

Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.

DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :

Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;

L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;

Le contenu ne soit pas modifié.

L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.

--- English Version ---

This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University ([email protected]).

If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.

DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.

Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:

The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;

The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;

The content is not changed in any way.

It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.

r

i 1 ^{^ I ^oy\}

mnvmaanntXiiBRE

B

F

M

L

’H

D 0E959

CONTRIBUTION À L’ETUDE DE LA PATHOBIOLOGIE DES TUMEURS

ASTROCYTAIRES HUMAINES.

Caractérisation de divers facteurs ayant un rôle régulateur de la migration des astrocytes

tumoraux.

Volume I

Manuscript présenté en vue de l’obtention du titre d’Agrégé de l’Enseignement Supérieur

Isabelle Camby

Année académique 2000-2001

Université Libre de Bruxelles

iiii iiii. l■lll I V.

F

M

L

’H

CONTRIBUTION A L’ETUDE DE LA PATHOBIOLOGIE DES TUMEURS

ASTROCYTAIRES HUMAINES.

Caractérisation de divers facteurs ayant un rôle régulateur de la migration des astrocytes

tumoraux.

Volume I

Manuscript présenté en vue de l’obtention du titre d’Agrégé de l’Enseignement Supérieur

Isabelle Camby

Année académique 2000-2001

Ce travail n’est bien évidemment pas le résultat d’une recherche en solitaire, de très nombreuses personnes y ont contribué directement ou indirectement. L’occasion m’est ici donnée de les remercier très chaleureusement.

Ce travail est le finit de ma rencontre en 1990 avec Robert Kiss. Merci est un mot bien faible pour lui témoigner toute la gratitude que j’éprouve à son égard. Au risque de lui faire concurrence dans la rédaction d’une phrase kilométrique, je tiens très sincèrement à le remercier pour les impulsions qu’il a données à ce travail, pour sa disponibilité, pour son enthousiasme et sa détermination à développer une équipe de recherches multidisciplinaire dans un cadre de travail exceptionnel ainsi que pour les nombreuses et passionnantes discussions que nous avons partagées et qui m’ont guidée sur les chemins non balisés de la recherche en cancérologie et aussi de la vie. Travailler à ses côtés représente une extraordinaire aventure humaine qui, je l’espère, se prolongera encore de nombreuses années.

J’adresse ma plus vive recoimaissance à Isabelle Salmon qui m’a initiée au monde complexe de la neuropathologie, pour l’intérêt qu’elle a toujours porté à mon travail ainsi que pour ses encouragements et ses conseils éclairés. Grâce à Christine Decaestecker, les méandres des méthodes d’analyses de doimées et de statistiques sont dorénavant moins tortueux. Mais je tiens également, et surtout, à la remercier pour son investissement personnel à l’accomplissement de ce travail, et pour sa bonne humeur inébranlable. Merci également à André Danguy pour l’intérêt constant qu’il a porté à mes recherches ainsi que pour m’avoir communiqué les fhiits de son expérience pédagogique. Au cours de toutes ces années, l’analyse attentive de Francis Darro ainsi que sa gestion rigoureuse du matériel et du temps furent d’un bénéfice non négligeable à l’accomplissement de ce travail.

De nombreux membres du Laboratoire d’Histopathologie ont contribué à l’aboutissement de ce travail : les « vieux de la vieille » Robert De Decker, Thierry Gras et Jean Werry qui m’ont appris tant de choses et ont toujours été d’une aide inestimable et d’une efficacité redoutable, mais aussi les « nouveaux » arrivés Nathalie Belot, Yves Bronckaert, Carole Chaboteaux, Isabelle Doyen, Christine François, Sophie Farinelle, Jean-François Gossin, Daphné Hoyaux, Florence Lefranc, Sibel Micik, Stanislas Tenant et Christelle Rochart, furent d’une aide quotidienne incontestable tant par leur gentillesse et leur enthousiasme que par leurs compétences respectives. L’efficacité de Paulette Miroir, en particulier pour s’y retrouver dans les arcanes administratives fut souvent salutaire. Merci aussi à Roland Pochet qui m’a introduite au monde complexe du calcium et des protéines

la même !

Plusieurs membres du service d’anatomopathologie de l’hôpital Erasme ont contribué d’une manière ou d’une autre à l’accomplissement de ce travail. Je tiens à remercier tout particulièrement Katja Rombaut, Myriam Remmelink et Nathalie Nagy.

J’adresse aussi mes vifs remerciements à Jean-Lambert Pasteels pour l’accueil qu’il m’a réservé au sein du Laboratoire d’Histologie et l’intérêt qu’il a porté à mon travail.

La volonté de Phillippe Van Ham à comprendre et à modéliser le comportement biologique des cellules fut un enrichissement hebdomadaire pour l’accomplissement de ce travail et fut surtout l’engrais nécessaire au développement d’un système de vidéomicroscopie essentiel à notre recherche. Un tout grand merci à Christophe De Hauwer pour avoir consacré sa thèse de Doctorat à la mise au point de ce système et ces temps libres à la poursuite de son développement. Sans la disponibilité et les explications d’Olivier Debeir, Photoshop ferait, pour moi, encore partie des logiciels difficiles à dompter.

Les collaborations scientifiques que nous entretenons avec les équipes de recherches de Jean Martinez (Faculté de Pharmacie de Montpellier), de Hans Joachim Gabius (Faculté Vétérinaire de Munich) et Marc Marcel (Université de Gand) ont permis d'étayer bon nombre des travaux décrits dans le présent manuscrit ; qu'ils trouvent ici l'expression de ma très sincère gratitude.

Ce travail n’aurait pu voir le jour sans la confiance et le soutien financier que m’ont accordé le Télévie, le Fonds National pour la Recherche Scientifique (FNRS), la Fondation Yvonne Boël, la Fondation Rose et Jean Hoguet et l’Association Sportive Contre le Cancer.

J’adresse aussi toute ma gratitude à Aurore pour les sourires qu’elle m’a toujours gardés en réserve malgré toutes ces longues heures que j’ai passées loin d’elle. Merci à l’ensemble du staff des baby-sitters !

Merci à André pour avoir accepté et soutenu mes choix de vie pas toujours très conventionnels.

TABLE DES MATIÈRES.

but--- ' INTRODUCTION --- ^

I. ORIGINE DES TUMEURS GLIALES.--- 3

A- Compositiondelaglie.--- 3

1- Lamicroglie.--- 3

2- Lamacroglie.--- 4

a. Lesastrocytes.--- 4

b. Lesépendymocytes. —--- 5

c. Lesoligodendrocytes.--- 6

B- Lestumeursgliales.--- 7

1- Originedestumeursgliales.--- 8

2- Lestumeursépendymaires.--- 8

a. Classificationhistopathologique.--- 8

b. Epidémiologieet Traitements.--- 9

c. Caractéristiquesbiologiques.--- 9

3- Lestumeursoligodendrogliales.--- 10

a. Classificationhistopathologique.--- 10

b. Epidémiologie ET Traitements.--- 10

c. Caractéristiquesbiologiques.--- 11

4- Lestumeursastrocytaires.--- 11

a. Classification Histopathologique.--- 11

b. Epidémiologie ET Traitements.--- 12

c. Evaluationdelamalignitédestumeursastrocytairesdiffuses.--- 14

5- Lestumeursmixtesoligoastrocytaires.--- 15

IL CROISSANCE DES TUMEURS GLIALES.--- 16

A- Notion DE CROISSANCE TUMORALE.--- 16

B- Facteursinfluençantlacinétiquedecroissancecellulairedesgliomes.--- 17

1- Les Neuropeptides.--- 18

2- Lespeptidesdelafamilledelagastrineetdelacholécystokinine.--- 19

a. Généralités.--- 19

b. Influencedespeptidesdelafamilledelagastrinesurlacroissancedes 21 TUMEURS ASTROCYTAIRES.--- --- --- III. MIGRATION DES CELLULES TUMORALES D'ORIGINE GLIALE.--- 23

1- Lesdifférentesclassesdeprotéases.--- 24

- Les aspartyl-protéases et leurs inhibiteurs.--- 24

- Les cystéines-protéases et leurs inhibiteurs.--- 24

- Les sérines-protéases et leurs inhibiteurs.--- 25

Les métalloprotéases et leurs inhibiteurs.--- 26

2. Lacascadeprotéolytique.--- 26

B- MOTILITE CELLULAIRE.--- 27

1- La Matriceextracellulaire.--- 27

a. Lescollagènes.--- 28

b. Lesglycoprotéines.--- 28

Les fibronectines.--- 28

Les laminines.--- 28

Les ténascines.--- 29

la thrombospondine-1.--- 29

La protéine sparc.--- 30

L’ostéospontine.--- 30

La vitronectine.--- 30

c. Lesprotéoglycansetlesglycosaminoglycans.--- 31

2- Les Complexesd'adhésion.--- 32

a. Lesintégrines.--- 33

b. Lesprotéoglycanstransmembranaires.--- 35

c. Lesgalectines.--- 35

3- Les « Cytosquelettes ».--- 36

a. Lesystèmemicrotubulaire.--- 37

b. Lesfilamentsintermédiaires.--- 38

c. Lesmicrofilamentsd'actine.--- 39

d. Importancedu Calciumetdesprotéinesliantlecalcium.--- 40

Les différentes classes de protéines liant le calcium.--- 41

Les protéines SI00 : structure et fonctions.--- 41

MATERIEL ET METHODES--- ^3

I. LES MODELES EXPERIMENTAUX IN VITRO ET IN VIVO ET LEUR UTILISATION.--- 44

A- Lesmodèlesexpérimentauxinvitro : Leslignéescellulairesetleurs 44 CONDITIONS DE CULTURE.--- 1- Leslignéesnéoplasiques.--- 44

2- LescellulesendothélialesdetypeHUVEC.--- 45

B- LES MODELES EXPERIMENTAUX IN VIVO.--- 46

1- Lemodèledeglioblastomemurindetype C6.--- 46

2- Lesxénogreffeshumainessursourisathymioues.--- 48

C- Les BIOPSIES HUMAINES.--- 19

IL CARACTÉRISATION DE L’EXPRESSION DE GÈNES PAR LES 50 ASTROCYTES TUMORAUX.--- III. CARACTÉRISATION DE L’EXPRESSION DE PROTÉINES.--- 52

A- Lestechniques Cyto- ethistochimiques.--- 52

1- L’immunohistochimie.--- 52

a. Protocole expérimental.--- 53

b. Evaluation quantitative des marquages immunocyto- ou histochimiques.--- 54

c. Remarques relatives à la quantification des marquages histochimiques.--- 56

2- Laglycohistochimie.--- 57

B- Lestechniquesbiochimiques (Western Blot).--- 58

IV. CARACTÉRISATION DU POTENTIEL MIGRATOIRE DES CELLULES 61 TUMORALES.--- A- CaractérisationDE LA MOTILITÉ CELLULAIRE.--- 61

B- Caractérisationdeladynamiquedepolymérisationetdedépolymérisation 64 DU CYTOSQUELETTE D’ACTINE.--- 1- Descriptiondela méthodologiechoisie.--- 64

2- Protocoledecoloration.--- 65

3- Quantificationdel’actinefibrillaireetglomérulaireàl’aidedela 65 microscopieàfluorescenceassistéeparordinateur.--- a. Brèveintroductionàlamicroscopieàfluorescence.--- 65

b. Quantificationdesmarquagesfluorescents.--- 66

V. CARACTÉRISATION DU POTENTIEL INVASIF DES CELLULES 68 TUMORALES.--- VI. CARACTÉRISATION DE PARAMÈTRES DE CINÉTIQUES DE CROISSANCE D’UNE POPULATION CELLULAIRE.--- 68

VIL TESTS PHARMACOLOGIQUES UTILISÉS POUR LA MISE EN ÉVIDENCE DU NOUVEAU SITE DE LIAISON DE LA GASTRINE.--- 69

A- Originedesagonistesetantagonistesdelagastrine.--- 69

B- Testdelaliaisond’agonistesoud’antagonistesdelagastrineavecles MEMBRANES D’ASTROCYTES TUMORAUX.--- 70

C- Effetdel’interactiondupeptide G-7 avecsonsitedeliaisonsurla PRODUCTION INTRACELLULAIRE DE SECOND MESSAGER.--- 71 1- Mesuredelaproductionde 3’.5’Adénosinemonophosphatecyclique

2- Mesuredelaproductiondephosphoinositolparlesastrocytestumoraux

STIMULÉS PAR DE LA G-7.--- 72

VIII. ANALYSES STATISTIQUES.--- 73

A- Lesanalysesunivariées.--- --- 73

1- Lesanalysesparamétriques (l’analysedelavariance).--- 73

2- Lesanalysesnonparamétriques.--- 74

a. Les tests de Mann-Withney et Kruskall-Wallis.--- 74

b. Les tests de corrélation.--- 74

B- L’analysefactorielle: lesanalysesencomposantesprincipaleset discriminantes (analysesmultivariées).--- 75

1- L’analyseencomposantesprincipales (ACP).--- 75

a. Utilisations.--- 75

b. Difficultés.--- 76

2- L’analysediscriminante.--- 76

C- Analysedesurvie (Méthode de Kaplan-Meier).--- 78

RESULTATS--- CARACTÉRISATION DU TAUX D’EXPRESSION DES PROTEINES SlOO DANS LES TUMEURS ASTROCYTAIRES.--- CARACTÉRISATION DU RÔLE DE RÉSIDUS OLIGOSACCHARI­ DIQUES DE LA MATRICE EXTRACELLULAIRE DANS LE COMPORTEMENT BIOLOGIQUE DES TUMEURS GLIALES.--- 87

I. CARACTÉRISATION DES SITES DE LIAISONS POUR DIVERS RÉSIDUS OLIGOSACCHARIDIQUES EXPRIMÉS DANS LES TUMEURS ASTROCYTAIRES.--- 87

IL CARACTÉRISATION DE L'INFLUENCE DES GALECTINES SUR LE COMPORTEMENT BIOLOGIQUE DES TUMEURS GLIALES.--- 90

A- Caractérisationdel'expressiondesgalectinesdetypes 1, 3 et 8 dansles TUMEURS GLIALES HUMAINES ET LEURS VAISSEAUX SANGUINS.--- 91

1- Expressiondelagalectinedetype 1 danslestumeursglialeshumaineset DANS LES PAROIS DES VAISSEAUX SANGUINS IRRIGUANT CES TUMEURS.--- 91 2- Expressiondelagalectinedetype 3 danslescellulestumorales

ASTROCYTAIRES HUMAINES ET DANS LES PAROIS DES VAISSEAUX SANGUINS

IRRIGUANT CES TUMEURS. 93 3- Expressiondelagalectinedetype 8 danslescellulestumorales

ASTROCYTAIRES HUMAINES ET DANS LES PAROIS DES VAISSEAUX SANGUINS

IRRIGUANT CES TUMEURS.---

4- Conclusionquantàl'expressiondesdifférentesgalectinesdansles

TUMEURS ASTROCYTAIRES HUMAINES.--- B- Caractérisationdel'expressiondesgalectinesdanslesmodèles

EXPÉRIMENTAUX DE TUMEURS ASTROCYTAIRES HUMAINES.---

1- Expressiondesgalectinesdansleslignéesastrocytairestumorales CROISSANT IN VITRO.--- a. Caractérisation de l'expression des gènes des galectines.--- b. Caractérisation de l'expression protéique des galectines.--- 2- Expressiondesgalectinesdansdesxénogreffesintracrâniennesdelignées

ASTROCYTAIRES TUMORALES HUMAINES.--- C- Influencedesgalectinesdetype1,3 et8 surlamotilitédesastrocytes

TUMORAUX.--- D- Influencedelagalectinedetype 1 auniveaudesinteractionsdetype

ASTROCYTES TUMORAUX - CELLULES ENDOTHÉLIALES.---

94

95

96

96 96 96

97

98

101

CARACTERISATION DE L’INFLUENCE DE LA GASTRINE SUR LE COMPORTEMENT DES ASTROCYTES TUMORAUX---

I. LA GASTRINE MODIFIE LE COMPORTEMENT DES ASTROCYTES TUMORAUX IN VITRO ET IN VIVO.--- A- Influencedelagastrinesurlamigrationdesastrocytestumoraux.--- 1- Influencedelagastrinesurlamotilitédesastrocytestumoraux.--- 2- Influencedelagastrinesurlecytosqueletteactinique--- a. Influence de la gastrine sur la dynamique de polymérisation / dépolymérisation du

cytosquelette actinique des cellules U87 et U373 croissant in vitro.--- b. Influence de la gastrine sur l’expression du cytosquelette actinique dans les tumeurs

gliales C6 greffées par stéréotaxie dans le cerveau de rats.--- 3- Influencedelagastrinesurl’expressiondegènespotentiellement

impliquésdanslecontrôledelamigrationcellulaire.--- B- Influencedelagastrinesurlepotentielinvasifdestumeursastrocytaires.- C- Influencedelagastrinesurlasurviederatsgreffésintracranialement

AVEC DES CELLULES TUMORALES ASTROCYTAIRES DE TYPE C6.---

103 104 104 105

105

106

107 107

108

LE CONTRÔLE DE LA MOTILITÉ DES ASTROCYTES TUMORAUX.

MISE EN ÉVIDENCE D'UN NOUVEAU SITE DE LIAISON DE LA

GASTRINE.--- 109 A- RecherchedesARN ^{messagersdesrécepteursdetypes}CCKA ^etCCïCB ^dans

LES LIGNEES TUMORALES ASTROCYTAIRES HUMAINES.--- 109 B- Etudepharmacologiquedelaliaisondelagastrineetdesesanalogues

. . , . ¹¹⁰

C- Caractérisationdu nouveausitede liaisonspécifiquedela gastrine-7 :

PREMIERE APPROCHE.--- 111

1- InteractiondusitedeliaisonàlaG-7 aveclesprotéinesG.--- 111 2- EffetdelaliaisondelaG-7 avecsonsitedeliaisonsurlaproduction

INTRACELLULAIRE DE SECONDS MESSAGERS.--- 111 D- La G-7 EST-IL LE PEPTIDE BIOLOGIQUEMENT ACTIF DANS LE CAS DES TUMEURS

, O 112

D ORIGINE GLIALE ?---

1- Dégradationdela G-17 en G-7 enprésencedecellulestumoralesd’origine GLIALE.--- 112

2- Effetdela G-7 surletauxdemigrationdescellulestumoralesgliales. — 112 3- Effetdela G-7 surlasurviederatsgreffésintracrânialementavecla

TUMEUR GLIALE C6.--- 113

DISCUSSION---

I. CARACTÉRISATION DU RÔLE POTENTIEL DE LA GASTRINE SUR LE COMPORTEMENT BIOLOGIQUE DES TUMEURS ASTROCYTAIRES

HUMAINES.--- 117 IL CARACTÉRISATION DU RÔLE POTENTIEL DES RÉSIDUS

GLYCOSYLÉS ET DES MOLÉCULES QUI LES RECONNAISSENT SUR LE COMPORTEMENT BIOLOGIQUE DES TUMEURS ASTROCYTAIRES

HUMAINES.--- 127 III. CONCLUSIONS GÉNÉRALES ET PERSPECTIVES.--- 136

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ¹³⁸

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ANA : astrocytome anaplasique AS : average speed (pm/h) AST : astrocytome ATYP : atypique

CAM : cell adhesion molécule CCK : cholécystokinine CDK : cyclin-dependant kinase CH : coefficient d’hétérogénéité

CRD : carbohydrate récognition domain CSPG : chondroitine sulfate protéoglycan ECM : matrice extracellulaire

EGF : epidermal growth factor EPE : épendymome

FGF : fibroblast growth factor G-17 : gastrine de 17 acides aminés G-7 ; heptapeptide de la gastrine GAG : glycosaminoglycan GBM : glioblastome

GF AP : glial fibrillary acidic protein HA : acide hyaluronique

IGF ; insulin like growth factor

LCR : liquide céphalo-rachidien LI : Labeling Index

MAP : mitogen-associatedprotein MMP : métalloprotéase

MOD : mean optical density

MRDO : maximal relative distance to the origine OLIG : oligodendrogliome

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

PAI-I et PAI-2 : plasminogen activator inhibitors de type 1 (PAI-1) et 2 (PAI-2)

PDGF : platelet derived growth factor PIL : astrocytome pilocytique

PK : protéine kinase

RMN : résoimance magnétique nucléaire SNC : système nerveux central

TIMP : inhibiteur des métalloprotéases tPA : tissue plasminogen activator TYP : typique

uPA : urokinase plasminogen activator VEGF : vascular epidermal growth factor VIP : vasoactive intestinal peptide

BUT DU TRAVAIL

Dans les pays industrialisés, les tumeurs astrocytaires représentent environ 5% des cancers humains. Le pronostic extrêmement péjoratif associé à ces tumeurs est principalement lié à deux caractéristiques biologiques majeures. La première correspond à l’importante hétérogénéité rencontrée tant au niveau de leurs propriétés biologiques qu’au niveau de leur aspect histopathologique. La seconde, probablement la plus importante, correspond à la propension des astrocytes tumoraux à migrer dans le parenchyme cérébral et d’envahir ainsi de larges zones du cortex cérébral, empêchant dès lors toutes possibilités de résection chirurgicale complète de la tumeur.

L’amélioration de la prise en charge clinique des tumeurs astrocytaires nécessite une meilleure compréhension des événements biologiques responsables de leur morbidité. Dans ce contexte, l’objet du présent travail concerne la caractérisation de facteurs susceptibles de moduler leurs propriétés migratoires. Deux approches auxquelles nous avons donné une importance égale furent abordées.

Concernant la première approche, nous avons mis en évidence la capacité de neuropeptides de la famille de la gastrine à améliorer la survie de rats porteurs de tumeurs astrocytaires intracérébrales. Nous avons consacré la première partie de ce travail à la compréhension et à l’explication de ce résultat. Nous avons ainsi mis en exergue la propriété de cette famille de neuropeptides à inhiber le taux de migration des astrocytes tumoraux. Ceci nous a amené à orienter notre thématique de recherche vers la caractérisation des événements biologiques potentiellement responsables de cette inhibition.

L’objet de la deuxième approche abordée dans le présent travail concerne la caractérisation d’éléments de la matrice extracellulaire susceptibles de moduler le taux de migration des astrocytes tumoraux. Dans ce contexte, nous avons essentiellement porté notre intérêt vers l’importance potentielle de certains types de glycosylations et des protéines capables de les reconnaître de manière spécifique. Pour les raisons justifiées dans la suite de notre manuscrit, nous nous sommes essentiellement intéressés à l’implication et aux rôles des protéines de la famille des galectines.

Introduction 2

INTRODUCTION

I. ORIGINE DES TUMEURS GLIALES.

A- Compositiondelaglie.

C'est en 1846 que Rudolph Virchow décrit pour la première fois les cellules gliales, c'est-à-dire les cellules non neuronales du cerveau. Grâce aux techniques de coloration qu'il mit au point vers 1870, Santiago Ramon y Cajal, pionnier de la neuroanatomie, décrivit deux types de cellules gliales, celles de la microglie et celles de la macroglie.

La macroglie est composée de trois types cellulaires: les astrocytes, les oligodendrocytes et les cellules épendymales. La fonction attribuée à cette époque aux cellules gliales est principalement un rôle de charpente soutenant les neurones et leur permettant de se disposer correctement les uns par rapport aux autres. Ce n'est que depuis une vingtaine d'années que l'on sait que ces cellules, et les astrocytes en particulier, jouent un rôle dynamique primordial dans l'activité neuronale et dans le maintien de l'homéostasie cérébrale. Les cellules gliales constituent en fait 90% des cellules d'un cerveau humain (Pfrieger et Barres, 1995).

1. Lamicroglie.

Les cellules de la microglie représentent environ 10 % des cellules gliales. Leur origine embryologique n'est pas complètement clarifiée. Il semblerait qu'elles sont issues du mésoderme embryonnaire, qu'elles se développent au sein de la moelle osseuse pour ensuite coloniser le système nerveux dès le début de sa vascularisation (Hickey et al., 1988; Pery et al, 1988). Deux formes de microglies ont été décrites: la forme ramifiée composée de cellules microgliales à l'état de quiescence et la forme amiboïde, semblable à des macrophages et considérée comme la forme active de la microglie. Les cellules de la microglie sont généralement considérées comme un tissu macrophagique quiescent capable de s'activer en réponse à toute rupture de l'homéostasie du système nerveux central (SNC) et jouent un rôle essentiel dans les réactions immunitaires y siégeant (Aloisi 1999, Gremo et al, 1997). Outre son rôle de surveillance immunitaire du SNC, divers travaux ont également suggéré l'implication des cellules microgliales dans l'histogenèse du cerveau (Gremo et al, 1997).

Embryonic stem cell

Multipotent stem celt

Neuron

Astrocyte precursor cell

\ Ofigodendrocyte I precursor ceV ''

Astrocyte Oligoderxlrocyte

Figure 1: Schéma général illustrant les voies de différenciation des cellules gliales et neuronales à partir des cellules précurseurs du neuroectoderme embryoïmaire.

Jusque très récemment, ces voies étaient considérées comme étant à sens unique (vers l'aval). Les travaux de Kondo et Raff (2000) suggèrent que certaines étapes de cette voie de différenciation sont réversibles (flèches vers l'amont) (d'après Vogel, 2000).

2. Lamacroglie.

Trois types cellulaires composent la macroglie: les astrocytes, les épendymocytes et les oligodendrocytes. D'un point de vue embryologique ces trois types cellulaires sont originaires du neuroectoderme. Si le schéma général de différenciation des cellules précurseurs du neuroectoderme en cellules gliales et neuronales matures illustré dans la figure 1 est généralement admis, les mécanismes moléculaires contrôlant cette différenciation sont à l'heure actuelle encore l'objet de nombreuses controverses (Vogel 2000). Récemment, Kondo et Raff (2000) ont montré que certaines cellules progénitrices déjà engagées dans les processus de différenciation étaient susceptibles de retourner à un état moins différencié, ouvrant ainsi la porte à de nouvelles possibilités thérapeutiques pour certains traumatismes cérébraux ou certaines maladies neurodégénératives.

a. Lesastrocytes.

Les astrocytes constituent la majorité des cellules de la macroglie. La microscopie électronique a permis de montrer que les astrocytes sont organisés en un syncytium. Ils sont connectés à leurs voisins par des jonctions de type gap (Dermietzel, 1993). Ces jonctions jouent un rôle essentiel dans la physiologie des astrocytes, notamment en permettant la propagation de vagues de calcium d'une cellule à l'autre sur parfois plusieurs centaines de microns (Finkbeiner, 1993). Des jonctions de type gap existent également entre astrocytes et neurones et entre astrocytes et oligodendrocytes, assurant ainsi des connexions directes entre les différents types cellulaires du SNC (Nedergaard, 1994).

Les astrocytes sécrètent de très nombreuses molécules biologiquement actives et jouent un rôle incontournable dans la différenciation et la survie des neurones ainsi que dans le maintien d'un environnement favorable à l'activité neuronale. Ces différents points sont largement détaillés dans les publications de Deschepper (1998) et Murphy (1993).

Retenons brièvement que les astrocytes expriment les récepteurs pour tous les neurotransmetteurs identifiés à ce jour, à l'exception des récepteurs pour l'acétylcholine nicotinique (Deschepper 1998). Ils expriment aussi des récepteurs pour divers hormones et facteurs de croissance comme le Jîbroblast growth factor (FGF), l'epidermal growth factor (EGF), l'insulin-like growth factor (IGF), ou le platelet-derived growth factor (PDGF) ainsi que pour certaines cytokines proinflammatoires comme le transforming

Introduction 5 nerve growth factor a (TNFa), l'interleukine 1P ou l'interféron y. Par contre, parmi les centaines de neuropeptides connus à ce jour, seuls les membres de quatre familles sont décrits comme pouvant être sécrétés par les astrocytes normaux, à savoir ceux de la famille des angiotensinogènes, des endothélines, des proencéphalines et de la somatostatine. Les neuropeptides de la famille des cholécystokinines, du vasoactive intestinal peptide (VIP) ou de la substance P n'ont jamais été détectés dans les astrocytes normaux malgré diverses tentatives de mise en évidence (Schwartz dans Murphy 1993). Outre les facteurs de croissance et les neuropeptides, les astrocytes synthétisent également de nombreuses autres molécules biologiquement actives qui assureront le bon fonctionnement du SNC et des neurones en particulier. Citons à titre d'exemples, les ténascines et les protéoglycans qui sont des composants majeurs de la matrice extracellulaire du SNC (Margolis 1997, Faissner 1997). De plus, ils contrôlent la composition de cette matrice extracellulaire en assurant le recyclage de nombreux neurotransmetteurs libérés au niveau des zones synaptiques, permettant ainsi des transmissions neuronales efficaces. La présence de divers canaux ioniques (K^, Cf, Ca^^, Na^) dans la membrane plasmique des astrocytes leur permet également de maintenir les neurones dans un environnement dont la composition ionique est favorable à la propagation des signaux électriques (Murphy, 1993).

En outre, les astrocytes (en relation avec les capillaires sanguins et le neuropile) sont la voie principale de transfert des métabolites de la circulation sanguine vers les neurones.

Ainsi, ils assurent le passage du glucose de la circulation sanguine vers le système nerveux ainsi que son stockage sous forme de glycogène. Afin de favoriser une activité neuronale optimale, ils ne fournissent pas le glucose tel quel aux neurones : ils le métabolisent d'abord en lactate plus rapidement métabolisable par les neurones (Murphy, 1993).

Ils guident et balisent la migration des axones lors du développement du cerveau et sont essentiels à la mise en place des dendrites (Murphy, 1993).

Ils participent avec la microglie à la surveillance immunitaire du cerveau (Murphy, 1993).

b. Les ÉPENDYMOCYTES.

Chez l'adulte, les épendymocytes sont disposés en un épithélium cubique monostratifié cilié bordant les ventricules du système nerveux central ainsi que le canal

épendymaire de la moelle épinière (Sternberg, 1996). On trouve éparpillées dans cet épithélium une forme spécialisée d'épendymocytes, les tanycytes dont les prolongements cytoplasmiques s'étendent dans le néuropile. Les fonctions des épendymocytes et des tanycytes restent encore à ce jour largement spéculatives (Bruni et al, 1985; Bmni, 1998). Si une fonction endocrine est suspectée pour ces cellules (Bruni, 1998), il semblerait toutefois que leur fonction majeure soit de former une barrière filtrante et protectrice entre le cerveau et le liquide céphalo-rachidien (LCR).

Cette barrière aurait pour fonction de réguler le transport des ions, de l'eau et des petites molécules entre le LCR et le neuropile (Bruni, 1998). Elle protégerait également le tissu nerveux des substances potentiellement dangereuses que pourrait contenir le LCR (Bruni et ai, 1985; Bruni, 1998). L'imperméabilité de cette barrière est assurée par des jonctions étroites, riches en glycoprotéines mannosylées (Kuchler et al., 1994). Comme les astrocytes, les épendymocytes sont interconnectés entre eux par des jonctions de iypQgap (Jarvis et Andrew, 1988 ; Yamamoto étal., 1991).

Les plexus choroïdes, responsables de la production du LCR, représentent une forme spécialisée particulière des épendymocytes (Sternberg, 1996).

c. Lesoligodendrocytes.

Les oligodendroc5des sont les cellules responsables de la formation et de la maintenance des gaines de myéline entourant les axones dans le système nerveux central. Les gaines de myéline correspondent à l'enroulement autour des axones des extensions cytoplasmiques des oligodendrocytes. Bien qu'en continuité avec la membrane plasmique des oligodendrocytes, la gaine de myéline possédé une composition biochimique propre, riche en lipides (dont les plus répandus sont les galactocérébrosides) et en protéines spécifiques dont les principales sont la 80 Kda proteolipidprotein (PLP), les différentes isoformes de la myelin basic protéin (MBP), la 2'-3'-cyclic nucleotid 3'-phosphotidase (CNP), ainsi que la myelin-associated glycoprotein (MAG), et la myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) présentes toutes deux en faible quantité mais jouant un rôle majeur en tant que molécule d'adhésion (Ludwin, 1997). D'autres protéines sont également présentes dans ces membranes afin d'assurer l'adhésion des oligodendrocytes aux axones et/ou aux astrocytes. Elles correspondent à la neuron cell adhesion molécule (NCAM) et à sa forme polysialilée PSA-NCAM (Ludwin, 1997), à la lectine CSL spécifique des résidus mannoses (Kuchler et al. 1988), ainsi qu'à certaines intégrines (Shaw et al, 1996). En outre, il

Figure 2: Illustration d'un astrocytome diffus de grade II apparaissant comme (A) une lésion frontale gauche hypodense visualisée par imagerie tomodensitométrique (CT-SCAN) avec injection de produit de contraste, (B) une lésion hyposignal visualisée par imagerie de résonance magnétique nucléaire (IRM) en présence de gadolinium, ou hypersignal (C) en séquence pondérée T2. (Kleihues et Cavenee, 2000).______

faut savoir que les oligodendrocytes matures possèdent un cytosquelette très riche en microtubules et en microfilaments d'actine mais sont dépourvus de filaments intermédiaires (Ludwin 1997). Enfin, il apparaît de plus en plus clairement dans la littérature que les processus de myélinisation ne seraient pas les seules fonctions biologiques des oligodendrocytes dans le système nerveux central. Toutefois leurs rôles potentiels dans la régulation du microenvironnement périneuronal reste encore largement à préciser (Ludwin, 1997).

Dans le système nerveux périphérique, la myélinisation des axones est assurée par les cellules de Schwann.

B- Lestumeursgliales.

Les tumeurs cérébrales et les tumeurs gliales en particulier sont généralement détectées par diverses techniques d'imagerie médicale réalisées suite à une symptomatologie telle que l'apparition de migraines, des pertes d'équilibre, des crises d'épilepsie, des vomissements, ... Grâce aux technologies modernes de Timagerie médicale, le diagnostic des tumeurs cérébrales est devenu relativement aisé. En effet, les différentes méthodes actuelles permettent d’obtenir des informations précises sur la localisation, la taille et même le type des tumeurs. Parmi ces techniques d'imagerie, les plus récentes sont la résonance magnétique nucléaire (RMN, Figure 2) et la tomographie à positrons (PET-SCAN). Elles permettent aussi le prélèvement de fragments tumoraux par une méthode relativement peu invasive: la stéréotaxie. Celle-ci consiste à prélever des biopsies par un trou de trépan à l'aide d'ime aiguille placée dans la tumeur grâce au contrôle radiologique. Les fragments ainsi prélevés pourront être examinés et permettront un examen anatomopathologique complet. Un diagnostic précis des tumeurs gliales peut donc être obtenu sans ouverture large de la boîte crânienne (Salmon et al, 1995 ; Ostertag et al, 1987).

La somme des informations obtenues d'une part grâce à l'imagerie médicale et d'autre part grâce à l'expertise des neuropathologistes orientent le neurochirurgien dans l'attitude à adopter: intervention palliative ou chirurgie radicale qui consistera alors à pratiquer une exérèse maximale de la tumeur en minimisant les séquelles neurologiques.

V *

t.

'* v3!Ç:<v5>.' i »A';^i. ■','i:&t)i!*aJ..1 <»-' 4É. «*■ * rf T 11 ^ ■ ^i

■;'4

.; ■. -\,l -■••V'- *v -i

■'■'■.■■'''fH' :'■’ -V', ■ '^

T <^ ‘ é'-

A ,f

irv

»#* m • •

; 'Æi H».

Figure 3: Les principales caractéristiques histologiques des épendymomes de grade II sont : la formation de pseudorosettes périvasculaires (A), l'expression immunohistochimique de différents filaments intermédiaires tels que la vimentine, la GFAP (B), la nestine et parfois des cytokératines. L'expression de GF AP est généralement observée dans les épendymocytes tumoraux périvasculaires (B). De manière caractéristique, les épendymocytes tumoraux s’organisent souvent en canaux (C) mimant le canal épendjmiaire et en rosettes (D). D'après Kleihues et Cavenee, 2000).

Figure 4: Les principales caractéristiques histologiques des épendymomes anaplasiques (grade 111) sont : la présence de cellules d'aspects peu différenciés (A), une activité proliférative importante qui se traduit par la présence de figures de mitoses (flèches. A) ou un immunomarquage important pour l'antigène Ki- 67 révélé par l'anticorps MIB-1 (D), et de larges foyers de nécrose (B). La figure C illustre la partie invasive d'un épendymome anaplasique infiltrant le parenchyme cérébral. Les épendymocytes tumoraux sont révélés en brun par un immunomarquage à l'aide d'un anticorps anti-GFAP. D'après Kleihues et Cavenee, 2000.___________________________________________________ ________________

1. Originedestumeursgliales.

Comme nous le verrons ci-après, les tumeurs^ cérébrales sont étiquetées comme oligodendrogliales, astrocytaires ou épendymaires sur base de leur aspect morphologique. Les cellules composant ces tumeurs ayant une morphologie plus ou moins similaire à celle d'un oligodendrocyte, un astrocyte ou un épendymocyte normal.

Toutefois, cette nomenclature ne prend pas du tout en compte l'histogenèse de ces tumeurs. A l'heure actuelle, l'origine des tumeurs gliales fait l'objet de nombreuses spéculations (Noble et al, 1995). En effet, aucun travail n'a pu jusqu'à présent démontrer que les tumeurs gliales étaient issues d'astrocytes ou d'oligodendrocytes matures ou de leurs cellules progénitrices. Toutefois, l'existence de tumeurs mixtes oligoastrocytaires dont des études cytogénétiques ont montré la monoclonalité (Kraus et al, 1995), le fait que certains astrocytomes sont chimiosensibles (caractéristique propre des oligodendrogliomes) (Black, 1991a et 1991b) ou l'expression de filaments intermédiaires dans certains oligodendrogliomes (alors que les oligodendrocytes matures en sont dépourvus) (Kashima et al, 1995) suggèrent que les tumeurs gliales se développeraient plutôt à partir des cellules progénitrices que des cellules matures.

2. Lestumeursépendymaires.

a. Classificationhistopathologique.

L'organisation Mondiale de la Santé (O.M.S.) reconnaît 4 types de tumeurs épendymaires. Le néoplasme d'origine épendymaire le plus fréquent est l'épendymome de grade II qui est généralement localisé dans les ventricules cérébraux et dont les symptômes cliniques sont généralement liés à la perturbation du passage du liquide céphalo-rachidien. Ses caractéristiques cytologiques et histologiques sont illustrées dans la table 1 et dans la figure 3. L'épendymome anaplasique est défini par l'OMS comme une tumeur maligne de grade III. Ses caractéristiques cytologiques et histologiques sont illustrées dans la table 1 et dans la figure 4. Son évolution clinique est plus péjorative que celle de l'épendymome de grade IL II existe également deux formes relativement indolentes de tumeurs épendymaires (grade I de malignité selon l'OMS), à savoir les épendymomes myxopapillaires et les subépendymomes. Ces tumeurs peu fréquentes sont généralement asymptomatiques et détectées de manière fortuite. Tout comme les épendymocytes normaux, les épendymocytes tumoraux sont pourvus de différentes classes de filaments intermédiaires, à savoir la vimentine et la glial acidic fibrillary protein (GFAP) (Kleihues et Cavenee, 2000)

Table 1: Critères histologiques et cytologiques pour la détermination du grade de malignité des tumeurs gliales de l'adulte. Les critères en italique ne sont pas indispensables au diagnostic (d'après Kleihues et Cavenee, 2000).

Grade CRITERES Astrocytome Ependymome Oligodendrogliome

CYTOLOGIQUES

• Atypies nucléaires • Présentes I _{• Mitoses}

HISTOLOGIQUES

• Rares

• Cellularité • Faible

• Prolifération vasculaire • Présente

• Autres critères • Microkystes, fibres de Rosenthal, Nécrose

CYTOLOGIQUES

• Atypies nucléaires • Rares et peu marquées • Peu nombreuses • Noyaux réguliers

11 • Mitoses

HISTOLOGIQUES

• _rares • _Rares • _Rares

• Cellularité • faible à modérée • _Modérée • _Modérée

• Prolifération vasculaire • _Absente • Absente • Fins capillaires bifurqués

• Autres critères • Pseudo-rosettes, rosettes épendymaires, nécrose • calcifications

CYTOLOGIQUES

• Atypies nucléaires • Nombreux foyers • nombreuses • Nombreuses

III _{• Mitoses}

HISTOLOGIQUES

• Nombreuses • nombreuses • Nombreuses

• Cellularité • modérée à élevée • Elevée • Elevée

• Prolifération vasculaire • présente • Présente • Présente

• Autres critères • nécrose

CYTOLOGIQUES

• Atypies nucléaires • Nombreuses et marquées IV _{• Mitoses}

HISTOLOGIQUES

• Nombreuses

• Cellularité • Importante

• Prolifération vasculaire • Importante

• Autres critères Nécrose, Pseudopallissadisme cellulaire

b. Epidémiologieet Traitements.

Les tumeurs épendymaires sont des tumeurs à croissance lente se développant principalement chez l'enfant et le jeune adulte. Selon les séries publiées dans la littérature, elles représentent 6 à 12 % de toutes les tumeurs intracrâniennes chez l'enfant. Elles sont relativement rares chez l'adulte (Kleihues et Cavenee, 2000). Ce sont des lésions généralement bien circonscrites qui se développent dans la lumière du système ventriculaire ou du canal spinal (Kleihues et Cavenee, 2000). Elles peuvent occasionnellement envahir le parenchyme cérébral adjacent ou se disséminer dans le système nerveux via le liquide céphalo-rachidien. Elles métastasient parfois, principalement dans les poumons.

Le mauvais pronostic associé à ces tumeurs est encore plus péjoratif si ces tumeurs sont intracrâniennes plutôt qu'intramédullaires (Schiffer 1997; Levin, 1996b). Malgré les progrès réalisés en neurochirurgie permettant une résection totale ou partielle de la plupart des tumem-s quelle que soit leur localisation, moins de 20% des patients survivent plus de 5 ans à leur tumeur. Des traitements adjuvants de radiothérapie sont donc généralement préconisés et permettent une amélioration significative du taux de survie des patients. Selon les séries et le niveau de malignité de la timieur d'origine, le taux de survie après 5 ans des patients ayant bénéficié d'un traitement radiothérapeutique est de 33 à^80% (Levin, 1996b). En cas d’échec des deux approches thérapeutiques décrites ci-dessus, xme approche chimiothérapeutique à l'aide de différents agents a parfois été tentée sans qu'un bénéfice clair en terme de survie des patients n'ait pu néanmoins être démontré (Levin, 1996b).

c. Caractéristiquesbiologiques.

En comparaison avec d'autres tumeurs cérébrales comme les tumeurs astrocytaires décrites ci-dessus, l'étude de la pathobiologie des épendymomes fait l'objet de relativement peu de travaux de recherches. A titre d'exemple, en 1997 seuls une centaine d'épendymomes (dont 40 de l'enfant) avaient fait l'objet d'études cytogénétiques approfondies (Hamilton et Pollack, 1997). Ces travaux ont permis de révéler la présence de nombreuses anomalies génétiques (mutations, monosomies) au sein du génome de ces tumeurs dont la plus fréquente (30% des cas) est la monosomie du chromosome 22 (Hammilton et Pollack, 1997; Kleihues et Cavenee, 2000). Ces

i.

V:.'

Figure 5; Aspect histologique d'un oligodendrogliome de grade II (A et B) et de grade III (C et D). Les principales caractéristiques histologiques des oligodendrogliomes de grade II sont : une cellularité modérée, peu d'atypies nucléaires et de mitoses, la présence de nombreux petits vaisseaux sanguins souvent bifurqués ainsi que des calcifications (A, flèche). L'aspect des cellules en "oeufs sur le plat"

(cytoplasme clair, noyau central. B) est également souvent observé. Les oligodendrogliomes malins de grade III sont très cellularisés, présentent de nombreuses atypies nucléaires (C, doubles flèches), de nombreuses mitoses (C, simple flèche) et souvent une importante prolifération vasculaire (D). D’après

Kleihues et Cavenee, 2000. _________________________