L’ immunohistochimie

L'immunohistochimie consiste à utiliser des anticorps spécifiques qui ont la particularité d'être couplés de manière directe ou indirecte à une substance facilement détectable telle qu’un fluorochrome, une enzyme ou une particule dense aux électrons. Les méthodes directes consistent en la fixation directe du marqueur sur l’anticorps spécifique de la substance étudiée. Cette technique est relativement peu sensible (1 antigène révélé par une seule molécule marqueur) et nécessite l’utilisation d’un anticorps marqué spécifique pour chaque antigène à étudier. Les méthodes indirectes présentent l’avantage de ne requérir qu’un seul type d’anticorps marqué pour la révélation de nombreux types d’antigènes. D’autre part, ces techniques permettent d’augmenter le rapport “marqueur/antigène” ce qui les rend nettement plus sensibles. Dans ce cas, l’anticorps primaire spécifique de l’antigène sera reconnu par un deuxième anticorps spécifique des immunoglobulines de l’espèce ayant servi à produire l’anticorps primaire et portant la substance chromogène.

Un autre principe d’amélioration de la sensibilité des techniques immunohistochimiques est l’association de l’immunohistochimie indirecte à la technique exploitant la forte affinité de l’avidine (une protéine issue du blanc d’oeuf) pour les petites molécules de biotine (vitamine du jaune d’oeuf). C’est cette technique

biotin-labelied second layer First antibody / \ A Antiqony\ y\

Ihird layer: ABC avidin /biotinylated vj.Ugl-X peroxidase complex

tissue antigen blocked with normal sérum /lOnOrx ..XÆakZ. avidin-binding sites blocked with avidin and uniabelled biotin

Figure 45 : Schéma illustrant le principe de révélation immunohistochimique utilisé dans le présent travail. Trois couches séparent les antigènes des molécules marqueurs. En effet, l’antigène étudié est reeonnu par l’anticorps primaire spécifique, reconnu lui-même par l’anticorps secondaire couplé à des molécules de biotine. Sachant que l’avidine peut fixer quatre biotines, la troisième couche sera constituée par des molécules d’avidine dont l’un des quatre sites de liaison se conjuguera à l’une des biotines de l’anticorps secondaire alors que les trois autres sites auront été préconjugués avec des biotines couplées à l’agent marqueur. Cette technique est communément appelée la technique ABC. Le taux de précision des marquages obtenus par cette méthode nécessite certaines précautions lors de l’expérimentation afin d’éviter tout marquage aspéeifique. En effet, des molécules endogènes de biotine sont généralement présentes dans les tissus. Il est done primordial que ces sites soient saturés avant l’application de l’anticorps biotinylé. Pour ce faire, le tissu sera incubé dans une solution d’avidine libre qui sera ensuite saturée par de la biotine libre non conjuguée à la molécule marqueur.__________________________________________________

dont le principe est illustré dans la figure 45 que nous avons choisie dans le but d’étudier l’expression des protéines S100 et des galectines dans les biopsies humaines de tumeurs gliales et dans les tumeurs obtenues par greffes de cellules tumorales dans le cerveau des souris athymiques. La substance chromogène choisie est ime enzyme, la peroxidase issue du raifort (Armomcia rusticana). La révélation des sites de liaisons antigène-anticorps (Ag-Ac) dans le tissu se fera par l’intermédiaire de l’activité enzymatique de cette peroxidase conjuguée au complexe avidine-biotine. En fin de protocole, les coupes seront recouvertes d’une solution contenant du peroxyde d’hydrogène (H2O2) et de la diaminobenzidine (DAB). La réduction de l’H202, substrat de la peroxydase, va permettre l’oxydation de la DAB incolore en un précipité brunâtre révélant ainsi la présence des complexes antigène (Ag) - anticorps pnmaire (Ac ) - anticorps secondaire (Ac ) - ABC (figure 45).

Notons que les peroxydases sont des enzymes naturellement présentes dans les tissus. Une étape préalable d’inactivation de ces peroxydases endogènes par l’H202 est donc requise afin d’éviter tout marquage aspécifique.

L’expression immunocytochimique des galectines dans les lignées cellulaires fut révélée de manière similaire mais les substances chromogènes choisies furent dans ce cas des fluorochromes directement couplés à l’anticorps secondaire (Table 15). Cette technique permet de réaliser aisément des doubles marquages et donc d’analyser simultanément l’expression de deux protéines dans une même préparation cytologique afin d’obtenir des renseignements quant à leur éventuelle colocalisation.

a. Protocoleexpérimental.

Les anticorps primaires utilisés dans notre travail sont décrits dans la table 14. Selon la méthode de visualisation choisie, les anticorps secondaires utilisés (Table 15) doivent soit être biotinylés soit couplés à un fluorochrome. Quelle que soit la technique choisie, les anticorps sont toujours dilués dans du tampon contenant 0.1 % d’albumine bovine (BSA) afin de minimiser les réactions aspécifiques.

Le tampon utilisé pour les bains de rinçages est du tris (TBS). Cette solution est composée de 50 mM de Tris (aaa Tris-(hydroxyméthyl)-méthylamine) et de 150 mM

Table 14 : Caractéristiques des antieorps primaires.

Anticorps anti- _{Type Source Dilution Fournisseur}

Actine Monoclonal souris 1/100 Chemicon International

Galectine-1 Polyclonal Lapin lOpg/ml Pr. Gabius

GaIectine-3 Polyclonal Lapin lOpg/ml Pr. Gabius

Galectine-8 Polyclonal Lapin lOpg/ml Pr. Gabius

GFAP Monoclonal Souris 1/100 Dako

Ki-67 Monoclonal Souris 1/100 Immunotech

SlOOAl Polyclonal Chèvre 1/200 Pr. Heizman

S100A2 Polyclonal Lapin 1/500 Pr. Heizman

S100A3 Polyclonal Lapin 1/200 Pr. Heizman

S100A4 Polyclonal Chèvre 1/200 Pr. Heizman

S100A5 Polyclonal Lapin 1/500 Pr. Heizman

S100A6 Polyclonal Chèvre 1/200 Pr. Heizman

SlOOB Polyclonal Lapin 1/200 Pr. Heizman

Vimentine Monoclonal Souris 1/200 Biogenex

Chemicon Int., Biognost, Wevelgem; Dako, Glostrup, Danemark, Immunotech, Marseille, France, Biogenex, San Ramon, CA, USA

Table 15 : Caractéristiques des anticorps secondaires

Anticorps anti- Source Molécule conjuguée Dilution Fournisseur

IgG lapin Chèvre AlexaFluor-488 Ipg/ml Molecular Probes

Chèvre AlexaFluor 594 Ipg/ml Molecular Probes

Chèvre HRP 0.2ng/ml NEN

IgG souris Chèvre AlexaFluor-488 Ipg/ml Molecular Probes

Chèvre AlexaFluor 594 1 |ig/ml Molecular Probes

Chèvre HRP 0.2 pg/ml NEN

IgG souris et lapin

Chèvre biotine 1/100 Vector

de NaCl dissout dans 2000 ml d’H20 bidistillée. Le pH est ajusté à 7.6 à l’aide d’HCl 2N.

Dans le cas de sondes biotinylées, les réactions aspécifiques sont empêchées en début de protocole par l’incubation des spécimens avec du sérum de l’espèce dont est issu l’anticorps secondaire à une dilution de 1/20 dans du tampon TES. La biotine endogène est saturée à l’aide de VAvidin-biotin blocking kit également de chez Vector Laboratories. La révélation des complexes Ag-Ac’-Ac^ est réalisée à l’aide du Peroxidase Vectastain® ABC kit produit chez Vector Laboratories et spécifique à l’espèce dont l’anticorps secondaire est issu. La DAB est obtenue sous forme liquide (Biogenex, San Ramon, CA) et préparée selon les indications du fabricant. Les préparations histologiques sont montées à l’aide du milieu de montage DPX (BDH Chemical). Les détails de la méthodologie utilisée et des divers protocoles expérimentaux sont décrits dans le Matériel et Méthodes de chacune des annexes concernées.

Dans le cas de sondes fluorescentes, seule l’étape impliquant l’incubation avec du sérum issu de l’espèce correspondant à l’anticorps secondaire est nécessaire. Les préparations cytologiques sont montées à l’aide de la solution de montage Vectashield (Vector Laboratories).

b. Evaluation quantitative des marquages immunocyto- ou

HISTOCHIMIQUES.

Nous avons utilisé la microscopie assistée par ordinateur telle qu’elle a été développée et validée au sein du Laboratoire d’Histopathologie par Kiss (1996) et Salmon (1993) pour quantifier les marquages immunocyto- ou histochimiques.

Nous avons utilisé un système SAMBA 2005 (Samba Technologies, Grenoble, France) dont le détecteur est une caméra tri-CCD couleur de type SONY. Pour chacune des trois couleurs primaires (rouge, vert et bleu), ce détecteur délivre un signal proportionnel à la quantité de lumière reçue sur la cible. Le logiciel de numérisation et d’analyse des images utilisé est interactif et permet d’isoler les

Matériel et Méthodes 55

structures histologiques d’intérêt à l’aide d’une souris informatique. Trois variables sont calculées au sein de la zone histologique sélectionnée.

La première variable concerne le pourcentage de surface de tissu analysé exprimant la molécule d’intérêt recherchée. Cette variable est dénommée IJ pour Labeling Index. Pour chacune des analyses histochimiques, un « contrôle négatif » est réalisé. Il s’agit de toute la procédure de révélation histochimique dans laquelle on omet la sonde primaire, e’est-à-dire l’anticorps primaire dans le cas de la technique immunohistochimique ou la sonde néoglycoconjuguée biotinylée dans le cas de la technique glycohistochimique. Le logiciel permet ainsi de calculer la valeur moyenne du marquage non-spécifique (coloration brune non liée à la présence spécifique de la protéine recherchée). Chacun des pixels constituant l’image numérisée par l’ordinateur sera étiqueté de négatif ou de positif selon que sa valeur de densité optique dans le canal vert de la caméra tri-CCD couleur (quantifiant le marquage brun) sera inférieure ou supérieure à la valeur moyenne du contrôle négatif augmentée de deux fois sa valeur de déviation standard. Ainsi, le microscope assisté d’un ordinateur et possédant les logiciels que nous avons mis au point au laboratoire soustrait automatiquement de chacun des pixels (constituant d’une image histologique numérisée) eette valeur du contrôle négatif La variable LI détermine donc le pourcentage de pixels positifs au sein de l’ensemble des pixels définissant l’image numérisée. Dix champs microscopiques sont analysés pour chacune des zones histologiques et chacun des marqueurs histochimiques qui ont été retenus dans notre travail. La fenêtre de numérisation de la caméra tri-CCD couleur SONY que nous avons utilisé “mesure” 768 x 512, soient 393 216 pixels. En d’autres termes, au grossissement G x 200, un champ analysé au microscope assisté de sa caméra et de son ordinateur “mesure” 393 216 pixels et ces 393 216 pixels couvrent une surface de 92 496 pm^. Au grossissement G x 400, ces mêmes 393 216 pixels couvrent une surface de 23 124 pm^. L’ordinateur calculera donc le nombre de pixels positifs (par rapport au contrôle négatif) au sein de chacun de ces 393 216 pixels couvrant un champ histologique numérisé. Cette opération est réalisée dix fois pour chacun des tissus analysés.

de la variable MOD (pour Mean Optical Density) dans la zone histologique numérisée et au sein de laquelle la variable LI a révélé les zones de marquages positives. La détermination de cette concentration de marquage MOD consiste à diviser l’intégrale (somme) de l’ensemble des densités optiques (s’échelonnant de “x” à 255) associées aux pixels “positifs” par une surface arbitraire afin de s’affranchir de la corrélation qui existe entre l’intensité de marquage intégrée (variable lOD pour Integrated Optical Density) et la taille de la surface analysée. La valeur “x” de densité optique est donc la valeur de densité optique qui est supérieure à la moyenne (additionnée de deux fois sa déviation standard) de l’intensité de marquage calculée dans le contrôle négatif.

La troisième variable est la variable CH pour Concentration Heterogeneity. Elle se calcule en divisant la valeur moyenne de la variable MOD par sa déviation standard. Cette variable CH représente donc le coefficient de variation (CV) associé à la variable MOD. Elle traduit de manière quantitative le degré d’hétérogénéité de l’intensité de marquage au sein de la zone histologique analysée.

c. Remarques relatives à la quantification des marquages

HISTOCHIMIQUES.

La quantification de marquages histochimiques telle que nous l’avons pratiquée dans le présent travail implique l’utilisation de protocoles de coloration rigoureusement standardisés afin d’obtenir des marquages spécifiques reproductibles. La mise au point de nos protocoles de coloration repose sur les recommandations émises dans diverses publications dont les objectifs étaient de mettre en exergue les points critiques menant à des colorations immunohistochimiques reproductibles de bonne qualité (Bermo et ai, 1982; Elias et ai, 1989; Giroud et Camby, 1997).

En outre, afin d’être assuré de la qualité et de la reproductibilité des différentes mesures de densité optique effectuées par les systèmes SAMBA, toute une stratégie de calibration a été mise au point. Cette mise au point a été réalisée dans le cadre d’un projet européen dénommé PRESS (Prototype Reference Standard Slides), auquel le laboratoire a participé. Cette calibration permet d’assurer la stabilité (et donc la

I)-(;ic(al-4)-l)-Gk

Figure 46 : Représentation tridimensionnelle des différents mono- et disaccharides utilisés comme ligands spécifiques des sondes néoglycoconjuguées. La représentation de la conformation spatiale d'énergie minimale de ces différents hydrates de carbone fut réalisée à l'aide du logiciel SWEET en accès public sur le site http://www.dkfz.heidelberg.de/spec/sweet2/doc/index.html (Bohme et al,

reproductibilité) des mesures, l’ajustement des optiques des microscopes et la correction de divers phénomènes dus aux différents instruments utilisés (microscope, caméra CCD, ...), comme par exemple des variations de luminosité (phénomène d’ombrage et/ou d’éblouissement) et des distorsions géométriques. Tous les systèmes de microscopie assistée par ordinateur qui ont été utilisés pour la réalisation du présent travail ont donc été soumis aux divers tests de calibration établis dans le projet PRESS.