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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Siyapata-Ntakirutimana, E. (1997). Biotechnologie appliquée aux plantes médicinales : cas de l'Atremisia annua L. (Asteraceae) (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212163/1/33af595e-6772-4c4b-be6e-406c09ad5563.txt
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Université Libre de Bruxelles
Faculté des Sciences
Laboratoire de Morphologie et de Biotechnologie Végétales
Biotechnologie appliquée aux plantes médicinales:
cas de VArtemisia anmia L. (Asteraceae)
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Eugénie SIYAPATA-NTAKIRUTIMANA
Directeur de Thèse Jacques HOMÈS
1996-1997
Bruxelles, Belgique
ERRATA
Page Paragraphe/ligne Au lieu de... Lire, ajouter ou déplacer
4 paragr. 3/ligne 5 traitement schéma thérapeutique
6 paragr. 5/ligne 2 sanguicole sanguinicole
28 paragr. 2/ligne 2 débutentt débutent
74-75 paragr. 4 2.2.6. Conclusion vers page 75
75 paragr. 4/ligne 5 immunoenzymati-ques immunoenzymatiques
161 paragr. 5/ligne 1 pantlets plantlets
162 tableau/ligne 1 those that
176 paragr. 6/ligne 11 observés observées
187 Fulzeleern/. 1995 Journal of Biotechnology J. Biotechnol.
188 Gocane/a/. 1995 Journal de Pharmacie de Belgique J. Pharm. Belg.
189 Heller 1965 International Conférence on Plant
Tissue Culture
Int. Conf Plant Tissue Cuit.
190 Hien 1994 Transactions of the Royal Society of
Tropical Medicine and Hygiene
Trans. R. Soc. Trop Med. Hyg.
191 Jung 1994 Current Medical Chemistry Curr. Med. Chem.
192 Kemp & Morgan 1987 Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants
Cell Cuit. Somatic Cell Genet.
Plants 194 Laughlin 1994 Transactions of the Royal Society of
Tropical Medicine and Hygiene
Trans. R. Soc. Trop Med. Hyg.
195 Marco & Barbera 1990 Studies in Natural Products Chemistry
Stud. Nat. Prod. Chem.
199 Phillipson 1994 Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene
Trans. R. Soc. Trop Med. Hyg.
203 Srivastava e? a/. 1992 International Journal for Parasitology
Int. J. Parasitol.
Laboratoire de Morphologie et de Biotechnologie Végétales
Biotechnologie appliquée aux plantes médicinales cas de VArtemisia annua L. (Asteraceae)
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Eugénie SIYAPATA-NTAKIRUTIMANA
Directeur de Thèse Jacques HOMÈS
1996-1997
Bruxelles, Belgique
Toi qui m’as appris à aimer les plantes,
A MES PARENTS, MES FRERES ET MES SOEURS,
Vous qui avez vite compris que les filles aussi avaient droit à l’enseignement,
A MON MARI, A NOS ENFANTS,
Pour tous les sacrifices.
A Madame Esther Homès-Balasse, pour toute la confiance et l'attention qu 'elle m 'a témoignée ainsi que pour les multiples encouragements.
Mes remerciements les plus sincères s'adressent également:
Au Docteur Mondher Jaziri, auprès de qui J'ai bénéficié d'un encadrement aussi consciencieux que rigoureux;
A tous les membres du Jury qui me font l'honneur de siéger à mon Jury:
- Professeur Jean Lejoly (Président) - Docteur Mondher El Jaziri (Secrétaire) - Professeur Jacques Homès
- Docteur Muriel Eyletters - Professeur Claude Lefebvre
- Docteur Guido François (Membre extérieur) Au Professeur Maurice Vanhaelen de l'Institut de Pharmacie, Laboratoire de Pharmacognosie et de Bromatologie de
l'Université Libre de Bruxelles, pour m'avoir autorisée à réaliser une partie de mes expériences dans son laboratoire;
Au Professeur Thomas Gaspar et ses collaborateurs de l'Institut de Botanique B 22, Laboratoire d'Hormonologie fondamentale et appliquée de l'Université de Liège, pour m'avoir permis de me familiariser avec la mesure de l'éthylène;
Au Professeur Robert Lannoye du Laboratoire de Physiologie Végétale de l'Université Libre de Bruxelles, pour ses conseils sur les travaux effectués dans les serres du Solbosh;
Au Docteur Guido François de l'Institut de Médecine Tropicale d'Anvers, Laboratoire de Protozoologie, pour la fructueuse collaboration dans les tests d'activité;
Aux Docteurs Claire Kevers, Billo Diallo, Carlos Diakanamwa, Mohamed Azarkan, Zhiri Abdesselam, Yanwen Guo et à Madame Badia Bisbis, Messieurs Louis Baboy, Bazabakana Romain, dont la patience et les fructueuses discussions m 'ont beaucoup encouragée;
Au personnel du Laboratoire de Morphologie et de Biotechnologie Végétales: Mesdames Renée Boyer, Nadine De Winter, Lucie Lambert, Inès Masquera, Messieurs Van Huynh-Long et Jean Pierre Dupont..., ainsi qu 'à tous mes collègues étudiants, pour l'ambiance chaleureuse qu 'ils n 'ont cessé de créer sur les lieux de travail;
A mes anciens étudiants de l'Université du Burundi qui m'ont toujours associée à leurs activités au cours de notre séjour en Belgique;
A tous les étudiants qui ont manifesté un intérêt particulier à l'étude d'Artemisia annua L.: Samadi, Marie Paule, Philippe, Didier, Stéphane, Eric, Addo, Carine et Jean;
Aux Ministres Nicolas Mayugi et Liboire Ngendahayo (représentant le Gouvernement du Burundi), qui m 'ont accordé le soutien financier indispensable à la réalisation de ce travail, ainsi qu 'à Monsieur Jean Ndeberi;
.4 toutes celles et ceux qui, d'une manière ou d'une autre, m'ont encouragée moralement et financièrement (ma pensée va particulièrement à ceux qui ont réservé un accueil chaleureux et un accompagnement digne à nos enfants:
Mesdames L. Ndadaye, A. Kanyabigega, R. De Klerck-Hauwaert, L. Nduwarugira, B. Zubatse, S. Nzikoruriho, S. Nzirorera, J. Van Acker, M.-J. Hughes-Ninove, B. Liberski, les familles Bacanamwo A., Bacanamwo Z., Barampama-Ntarataze, Guiot- Langlais M., Milde J., Ngendanganya J., Ndabaniwe E., Bugerere S., Ngendakumana S., Ndikumana L., Lehmann J., Rubirigi A., Rugurika M., Sindayihebura D., Ruritariye J., Nkeshimana A., Rodriguez J., Dupont J.-P., Wamier G., Maître Carlier J.-Y. et ses collaboratrices, ainsi qu 'à toutes celles et ceux qui les ont encadrés à Bujumbura en mon absence: les familles Ntaryamira C., Ntibantunganya S., Narakwiye V., Muteragiranwa B., Kanyaru R., Barumpozako D., Kanihariwe...
Ma reconnaissance s'adresse aussi à:
.4 Madame Nancy Acton et au Dr Robert Engle du Walter Reed Army Institute of Research (Washington) et au Dr David E.
Davidson de PO.M.S., pour m'avoir gracieusement fourni des échantillons de standards;
Au service de documentation de l'Administration Générale de la Coopération au Développement (AGCD) pour l'accueil et la mise à ma disposition des documents nécessaires à mon travail;
Au Dr Catherine Lebeau, au Dr Henri Debroux, au Dr Jean-Pierre Bastin et au Dr Jean-Yves Herman pour leur sympathique réconfort et soins attentionnés.
Je ne saurais passer sous silence le soutien ô combien réconfortant de mon mari (Anasthase Siyapata) et de nos enfants (Anatole Ntunzwenayo, Rose-Nadège Irakoze et Carine Kwizera), de mon père, ma mère, mes frères, mes soeurs, ma belle- soeur, mes neveux et mes nièces. Qu 'ils trouvent ici le fnnt de leurs sacrifices.
sjc ^jc s|c 3|c sjc sjc 3jc
^HNMR 2i-P 2,4-D ABA ACC ACCT ACF AGCD AIA AIB AIF ANA AOA APB ASA AVG Bs
BA ou BAP BSA
CaOCl CCM CG CG-SM CHCI3
CLHP (HPLC) CLHP-EC (
hplc-
ec)
CPC
CSTR/OUA DAS
DHQHS-BSA DHQHS-OVA DI
DL50 DMF DMSO DNP DO DS50 DS90 EC50
ED50
: résonance magnétique nucléaire protonique : 2 isopentényladénine
: acide 2,4-dichlorophénoxyacétique
; acide abscissique
: acide 1-aminopropane-l-carboxylique
; Agence de Coopération Culturelle et Technique : adjuvant complet de Freund
: Administration Générale de la Coopération au Développement : acide indole acétique
: acide indole butyrique
: adjuvant incomplet de Freund
; acide naphtalène acétique
; acide aminooxyacétique
: Association Pharmaceutique Belge : acide acétylsalicylique
; aminoéthoxyvinylglycine
: milieu de base de Gamborg (1968) : benzyladénine ou 6 benzylaminopurine : albumine de sérum de bovin
: hypochlorite de calcium
; chromatographie sur couche mince : chromatographie en phase gazeuse
: chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse
: chloroforme
: chromatographie liquide haute performance
: chromatographie liquide haute performance avec détection électrochimique
; chromatographie de partage centrifuge
: Commission Scientifique, Technique et de la Recherche de l'Organisation de l'Unité Africaine
; double antibody sandwich (ELISA)
: conjugué dihydroqinghaosu-albumine de bovin : conjugué dihydroqinghaosu-ovalbumine
; diamètre intérieur : dose létale 50 (mg/kg) : diméthylformamide : diméthylsulfoxyde : 2,4-dinitro phénol
; densité optique
: dose suppressive 50 (mg/kg)
: dose suppressive 90 (mg/kg)
: 50% effective concentration
: 50% effective dose
EtOAc EtOH g GA3 GARPOD H
Ig IC50 ISABU K KIN LC50 LS M MeCN MeOH MES MOPS MS-MS MS NaOCl OMS (WHO) OVA
PBS PBSC PBSCT PBSOT PBSOVA PBST PF PM PS PA^
QHS Rf RIA RMN SM STS TGB TMB TPM Tr V/V
w
Z
: acétate d'éthyle : éthanol
: accélération de la pesanteur : acide gibbérellique
: goat anti rabbit peroxydase : milieu de base de Heller : immunoglobuline
: 50% inhibitory concentration
: Institut des Sciences Agronomiques du Burundi : milieu de base de Knop
; kinétine = 6 furfuryladénine (ou 6 furfuiylaminopurine) : 50% létal concentration
: milieu de base de Linsmayer et Skoog (1965) : molaire
; acétonitrile
; méthanol
; 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid : acide morpholino-3-propane sulfonique
; spectrométrie de masse couplée à la spectrométrie de masse : milieu de base de Murashige et Skoog (1962)
: hypochlorite de sodium
; Organisation Mondiale de la Santé (World Health Organization) : ovalbumine
: phosphate bufFered saline (tampon phosphate) : phosphate bufFered sodium casein
: phosphate bufFered sodium casein + tween : phosphate bufFered sodium ovalbumine + tween
; phosphate bufFered sodium ovalbumine : phosphate bufFered sodium + tween : poids Frais
; poids moléculaire : poids sec
; poids/volume : qinghaosu
: rapport Frontal; distance de migration d'une substance/distance de migration du solvant
: radioimmunologie
: résonance magnétique nucléaire : spectroscopie de masse
; silver thiosulFate : thyroglobuline
: 3,3’,5,5’-tétra méthyl benzydine : tours par minute
: temps de rétention : volume/volume : well (puits) = 50 pl
; zéatine
RESUME
Depuis l’apparition de souches de Plasmodium falciparum L. résistant aux antipaludiques habituellement utilisés, des équipes ne cessent de conjuguer leurs efforts en vue d’inventorier les données cliniques et les usages des plantes médicinales du monde entier pour pallier à cette nouvelle forme de fléau.
Parmi les plantes identifiées, VArtemisia annua L. (armoise annuelle) suscite un intérêt particulier. Le mérite de cette plante relève des propriétés des dérivés de l’artémisinine. En effet, ceux-ci sont efficaces contre les formes résistantes du Plasmodium et contre la malaria cérébrale.
C’est dans le but d’étudier les prérequis à une culture en régions touchées par le paludisme que ce travail a été réalisé.
Il s’agissait d’abord de comprendre le comportement de cette plante aussi bien en culture in vitro qu’en culture en terre. Diverses expériences portant principalement sur la micropropagation ont conduit à l’obtention de vitroplants capables de pousser en champs et produisant autant d’artémisinine que les plantes issues de semis.
Les expérimentations réalisées dans les serres et en champs ont permis de comprendre que certaines substances telle que l’acide gibbérellique exercent des effets favorables à la croissance de la plante et à la production de l’artémisinine et de ses analogues.
Il a fallu ensuite développer des techniques d’analyse permettant de cibler, tout au début de leur développement, les cultures les plus intéressantes.
Il s’agit notamment de la technique immunoenzymatique ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) rapide et sensible, utilisant des anticorps polyclonaux.
A côté de ses avantages, cette méthode présente l’inconvénient de détecter un groupe de produits et ne permet donc pas d’identifier et de quantifier les substances mises en évidence.
Nous avons alors associé cette technique aux méthodes chromatographiques et aux méthodes biologiques pour mieux cerner les caractéristiques de ces substances.
Les résultats que nous avons obtenus peuvent être exploités dans des programmes visant à
diffuser la plante dans les régions où sévit le paludisme.
INTRODUCTION GENERALE...1
1. ARTEMISJA ANNUA L„ UNE PLANTE AUX PROPRIETES ANTIPALUDIQUES... 3
2. LE PLASMODIUM ET LE PALUDISME...6
3. L'ARTEMISININE ET SES ANALOGUES...8
3.1. Biosynthèse et structure de l'artémisinine et de ses analogues...8
3.1.1. Biosynthèse de l'artémisinine et de ses analogues... 8
3.1.2. Sites de biosynthèse et formes d'accumulation de l'artémisinine et de ses analogues... 11
3.1.3. Structure de l'artémisinine et de ses analogues... 12
3.2. Chimiosynthèse et stabilité de l'artémisinine et de ses analogues... 12
3.2.1. Synthèse chimique... 12
3.2.2. Stabilité...13
3.3. Mécanismes et mode d'action de l'artémisinine et de ses analogues...13
4. LES RECHERCHES EN PHYTOCHIMIE... 14
5. LES METHODES D'ANALYSE DES METABOLITES SECONDAIRES... 14
6. LES METHODES IMMUNOLOGIQUES... 16
MATERIEL ET METHODES...19
1. MATERIEL VEGETAL...19
1.1. Le matériel végétal mis en culture... 19
1.2. Le matériel analysé...20
2. METHODOLOGIE... 20
2.1. Les cultures in vitro... 20
2.2. Les cultures en terre (serres et champs)...23
2.3. Les techniques d’analyse... 23
3. TRAITEMENT DES DONNEES... 24
(ARTEMISIA L.)... 25
1.1. TAXONOMIE ET DISTRIBUTION... 25
1.1.1. Position systématique... 25
1.1.2. Caractères systématiques... 26
1.1.3. Description de l'Artemisia annua L... 26
1.1.4. Données ethnopharmacognosiques et usages traditionnels dits Artemisia...28
1.1.5. Ecologie et distribution...29
1.2. CONSTITUANTS CHIMIQUES ARTEMISIA... 30
1.2.1. Les terpènes...30
1.2.2. Les acétylènes...31
1.2.3. Les coumarines... 31
1.2.4. Les flavonoïdes...31
1.2.5. Les analogues de la sésamine... 31
1.2.6. Les autres métabolites... 33
1.3. LES POTENTIALITES DE U ARTEMISIA ANNUA L... 33
1.4. AUTRES PLANTES A ACTIVITE ANTIPALUDIQUE EN COURS D’ETUDE...34
CHAPITRE II MISE AU POINT DE TECHNIQUES D’ANALYSE POUR LA DETECTION DE L’ARTEMISININE ET DE SES ANALOGUES... 2.1. INTRODUCTION... 2.2. MISE AU POINT D'UNE METHODE IMMUNOLOGIQUE DE TYPE ELISA... 2.2.1. Principe des méthodes immunologiques... 2.2.2. Production et utilisation des immunoglobulines (Ig)... 2.2.3. Caractérisation et titrage des anticorps... 41
2.2.4. Protocole expérimental...42
2.2.4.1. Synthèse des conjugués (haptène-protéine)... 42
2.2.4.2. Immunisation de lapins... 47
2.2.5. Résultats et discussion... 48
2.2.5.1. Caractérisation des anticorps: tests de fixation...48
2.2.5.2. Etablissement de la courbe standard: tests d'inhibition... 57
2.2.5.3. Etude des réactions croisées... 2.2.5.4. Comparaison entre l’ovalbumine et la caséine comme protéines de saturation 2.2.5.5. Etude de la reproductibilité du test... 2.2.6. Conclusion... 2.3. UTILISATION DE METHODES CHIMIQUES... 2.4. UTILISATION DE TESTS BIOLOGIQUES... 78
2.5. CONCLUSION... 78
CONTRIBUTION A LA CULTURE IN VITRO D’ARTEMISIA ANNUA L...
3.1. INTRODUCTION...
3.2. INITIATION ET ENTRETIEN DES CULTURES DE CALS Ü'ARTEMISIA ANNUA L...
3.2.1. Protocole expérimental...
3.2.2. Résultats et discussion... 85
3.2.2.1. Influence de différents milieux de base sur l'initiation et la prolifération des cals...85
3.2.2.2. Influence du type d’explants sur l’initiation et la prolifération des cals... 87
3.2.2.3. Influence des régulateurs de croissance sur l’initiation et la prolifération des cals...88
3.2.2.4. Influence de la température sur l’initiation et la prolifération des cals... 90
3.2.2.5. Influence de la lumière sur l’initiation et la prolifération des cals...91
3.2.3. Conclusion... 91
3.3. INITIATION ET ENTRETIEN DES CULTURES DE SUSPENSIONS CELLULAIRES H'ARTEMISIA ANNUA L...92
3.3.1. Introduction... 92
3.3.2. Protocole expérimental... 93
3.3.3. Résultats et discussion... 94
3.3.4. Conclusion... 94
3.4. INITIATION, ENTRETIEN DES CULTURES DE POUSSES FEUILLÉES ET MICROPROPAGATION D'ARTEMISIA ANNUA L...95
3.4.1. Initiation et entretien des pousses feuillées... 95
3.4.1.1. Introduction...95
3.4.1.2. Protocole expérimental... 95
3.4.1.3. Résultats et discussion... 96
3.4.2. Enracinement des pousses feuillées...102
3.4.2.1. Introduction... 102
3.4.2.2. Protocole expérimental... 102
3.4.2.3. Résultats et discussion... 103
3.4.3. Acclimatation... 105
3.5. EFFET DE L’ETHYLENE SMRARTEMISIA ANNUA L... 109
3.5.1. Introduction...109
3.5.1.1. Biogenèse de l’éthylène... 109
3.5.1.2. Importance de l’éthylène dans la vie de la plante... 110
3.5.1.3. Accumulation de l’éthylène et ses conséquences dans les cultures in vitro...110
3.5.2. Mesure de l'éthylène dans les cultures in vitro d’^4. annua...112
3.5.2.1. Matériel et méthode... 112
3.5.2.2. Principe de la méthode... 112
3.5.2.3. Résultats et discussion... 113
3.6. CULTURES D’ORGANES TRANSFORMES... 116
3.6.1. Introduction...II6 3.6.2. Protocole expérimental...117
3.6.3. Résultats et discussion...118
3.7. CONCLUSION 119
4.1. INTRODUCTION...
4.2. CULTURE EN SERRES...
4.2.1. Germination des graines et étude de leur viabilité...
4.2.2. Préparation des plantules pour le transfert en champs... 125
4.2.2.1. Influence du démariage sur la croissance et le développement de la plante... 125
4.2.2.2. Empotage... 127
4.2.3. Influence de l’acide gibbérellique sur les cultures en serres...127
4.2.3.1. Dispositif expérimental réalisé en serres... 128
4.2.3.2. Résultats et discussion... 128
4.2.3.3. Conclusion... 129
4.2.4. Influence de la taille sur la production de la biomasse... 132
4.3. CULTURE EN CHAMPS...134
4.3.1. Calendrier des activités culturales... 134
4.3.2. Influence de la période de transfert des plantes des serres vers les champs sur la production de la biomasse... 135
4.3.3. Etude de l’influence de l’acide gibbérellique sur les cultures en champs...136
4.3.4. Ennemis de VA. annua et mesures phytosanitaires...147
4.3.4.1. Les ravageurs...147
4.3.4.2. Les dégâts mécaniques... 148
4.3.4.3. Mesures phytosanitaires...148
4.4. CONCLUSION... 150
CHAPITRE V... APPLICATION DE LA METHODE IMMUNOENZYMATIQUE (ELISA) POUR LE DOSAGE DE L'ARTEMISININE ET DE SES ANALOGUES... 5.1. INTRODUCTION... 5.2. DOSAGE DE L'ARTEMISININE ET DE SES ANALOGUES... 5.2.1. Dosage de l’artémisinine et de ses analogues dans les plantes cultivées en serres...154
5.2.1.1. Evolution des teneurs en artémisinine dans les plantules en fonction du temps... 154
5.2.1.2. Influence de la taille (coupe)...156
5.2.1.3. Effets de l’acide gibbérellique... 158
5.2.2. Dosage de l’artémisinine et de ses analogues dans les plantes cultivées en champs: influence de l’acide gibbérellique... 159
5.2.3. Dosage de l’artémisinine et de ses analogues dans les cultures in vitro... 160
5.2.3.1. Influence de la composition des milieux de culture... 160
5.2.3.2. Influence de la lumière... 172
5.2.4 Dosage de l’artémisinine dans les plantules régénérées in vitro...172
5.3. CONCLUSION 173
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...179
ANNEXES...209
APPLICATION DES DIFFERENTS TRAITEMENTS DANS L’ESSAI EXPERIMENTAL SE RAPPORTANT AUX CULTURES EN SERRES... 209
PRODUITS CHIMIQUES ET PREPARATION DES TAMPONS... 209
1. Les produits chimiques... 209
2. Préparation des tampons... 210
INTRODUCTION GENERALE
L'intérêt que l'homme porte à l'étude de tout ce qui l'entoure, l'a amené à imaginer plusieurs possibilités pour dompter la nature. Tant que la densité de la population restait encore faible et que la nature se montrait florissante, l'homme se contentait de cueillir et parfois de protéger les espèces qui lui étaient utiles, tant sur le plan alimentaire que sur le plan thérapeutique.
En effet, malgré l'essor de la chimie de synthèse, les végétaux fournissent encore de nombreuses substances utiles à la médecine et à l'agroalimentaire. Parmi ces produits, on connaît les métabolites secondaires, qui sont des substances spécifiques (c’est-à-dire caractéristiques d’une espèce) qui ne sont pas synthétisées par les circuits du métabolisme de base communs à de grands groupes de plantes (métabolisme primaire par exemple), (Zrÿd 1988). Ces métabolites secondaires sont très importants pour les animaux et pour l’homme en particulier, et constituent des matières premières utilisées dans la préparation des médicaments, des parfums, des insecticides, des herbicides et de certains colorants notamment.
Outre l'intérêt qu'ils présentent pour l'homme, les métabolites secondaires jouent un rôle primordial dans les interactions entre les plantes et le milieu environnant. Ils interviennent dans les relations plantes-plantes, plantes-insectes, plantes-insectes-plantes. Quelques exemples illustrent ces interactions;
- l'inhibition de la germination des graines de diverses plantes,
- l'attraction des insectes ou autres agents pollinisateurs (arômes, couleurs...), - la défense contre les parasites (produits amers, malodorants ou toxiques; par
exemple, la plante de tabac développe un effet répulsif à l'égard de certains ravageurs).
En effet, au Burkina Faso et au Burundi, des agriculteurs observent que les attaques de chenilles foreuses du maïs, sont moindres lorsque cette plante est associée au tabac (Dupriez &
De Leener 1987).
Mais on s'est vite rendu compte que les ressources naturelles n'étaient pas inépuisables, et que
tous les produits intéressants ne sont pas toujours abondants. Ainsi, outre la protection et
l'amélioration des espèces, l'homme cherche à créer des variétés plus performantes, aussi bien pour la qualité que pour la quantité de la production.
Parmi les voies qui lui sont offertes, en plus des techniques classiques d'amélioration, la culture in vitro constitue une alternative qui permet entre autres d'améliorer, de multiplier et de conserver les plantes, surtout celles qui sont les plus menacées de disparition.
La culture in vitro présente d'autres avantages, les principaux étant:
- de permettre la réalisation de cultures sur une petite surface et en conditions contrôlées;
- d'éviter les aléas politiques et climatiques et de disposer de matériel tout au long de l'année;
- de permettre des recherches dans des disciplines variées, telles que la biochimie, la phytochimie, la phytotechnie, la physiologie et la génétique;
- de faciliter le contrôle de la qualité;
- de produire, dans certains cas, une grande quantité de matériel végétal;
- de produire parfois de nouvelles substances... (Phillipson 1990).
Malheureusement, malgré les succès réalisés dans les recherches relatives à la production de métabolites secondaires par des cultures cellulaires de Coptis japonica (Sato &. Yamada 1984) et de Lithospermnm erythrorhizon (Fujita et al. 1982), il subsiste des difficultés à surmonter pour mettre au point des systèmes de culture et de production de métabolites secondaires pour chaque espèce de plantes.
Ainsi, dans certains cas, les organes ou les tissus mis en culture voient leur capacité de biosynthèse fortement diminuer (Tabata et al. 1971, Hamill et al. 1988, Charlewood et al.
1990, Wink 1990).
C'est pour pouvoir détecter ces quantités infinitésimales de produits biologiquement actifs que des procédés d'extraction et des techniques d'analyse très sensibles se développent, et que d'autres sont perfectionnées.
Depuis longtemps, les métabolites secondaires sont analysés par des méthodes chimiques (la
chromatographie étant la plus utilisée), des méthodes biochimiques (immunologiques pour la
plupart) et des méthodes biologiques, dont le but est de rechercher l'existence d'une activité
thérapeutique associée à ces métabolites.
Actuellement, les analyses par les techniques immunologiques se multiplient de plus en plus et c'est dans ce contexte que se place une partie de notre travail.
Nous parlerons brièvement, dans cette introduction générale, à!Artemisia annua L., qui constitue le matériel de notre travail et qui est réputée pour le traitement du paludisme, surtout de celui qui est dû aux formes de Plasmodium falciparum résistantes aux antipaludiques habituellement utilisés, ainsi que pour le traitement de la malaria cérébrale.
Nous aborderons ensuite le paludisme, avant de discuter des méthodes d'analyse des métabolites secondaires.
Le premier chapitre est consacré à une étude bibliographique sur les armoises et VA. annua en particulier, tandis que les autres chapitres traitent successivement de la mise au point, dans notre laboratoire, d'une méthode immunologique pour la détection de l'artémisinine et de ses analogues, et des essais de culture à'Artemisia annua L. in vitro et in vivo, qui constituent des préalables à des cultures en champs. Un accent est mis sur la micropropagation et la culture en terre.
Nous terminons par les applications de la méthode immunoenzymatique (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) dans la détermination de l’artémisinine et de ses analogues.
1. ARTEMISIA ANNUA L., UNE PLANTE AUX PROPRIETES ANTIPALUDIQUES
L'armoise annuelle (A. annua) est une Asteraceae d'origine asiatique, introduite dans plusieurs régions européennes, américaines (Klayman 1985) et africaines (Niamien 1992, Bukenya- Ziraba et al. 1997). Certains de ses constituants sont biologiquement actifs. On rapporte notamment que, depuis longtemps, les Chinois en utilisent les extraits comme fébrifuges. De plus, des travaux ont permis de mettre en évidence leurs propriétés antipaludiques (Klayman et al. 1984, Tawfiq et al. 1989) et herbicides (Bryson & Croom 1991). Il a aussi été montré que cette plante est efficace in vitro, vis-à-vis d'une espèce d’amibes, Naegleria fowleria, et de deux espèces de schistosomes, Schistosoma japonica et S. mansoni (Hien & White 1993).
Duke & Ayensu (1990) rapportent que les feuilles de la plante sont aussi utilisées en médecine traditionnelle chinoise pour le traitement de la dysenterie, des abcès et des affections oculaires, voire même dans le traitement de l'infarctus cérébral (au Yunnan).
La principale molécule responsable de l'activité antipaludique est l'artémisinine (1) (Qinghaosu,
QHS, Figure 1). Cette lactone sesquiterpénique, possédant un groupement endoperoxyde, fut
isolée dès 1972 par des chercheurs chinois (Schmidt &. Hoffeinz 1983, Klayman 1985,
Stiles et al. 1994). La structure tridimensionnelle de l’artémisinine a été établie par cristallographie en rayons-X et le nom chimique est: 3,6,9-triméthyl-octahydro-3,12-epoxy- pyrano[4,3-j]-l,2-benzodioxepin-10-one (Tang & Eisenbrand 1992). Depuis lors, des dérivés de l'artémisinine ont été identifiés et/ou obtenus par hémisynthèse et certains se sont avérés être plus efficaces que l'artémisinine elle-même. Parmi ceux-ci, on peut distinguer l’artémisitène (2), l'artéméther (3), l'artééther (4), l'artésunate de sodium (5) et la déoxoartémisinine (6) (Acton &
Klayman 1985, Klayman 1985, OMS. 1987, Jung et al. 1990, Benakis et al. 1991, Melendez et al. 1991, Doury et al. 1992, Karbwang et al. 1992a, Kyaw et al. 1992, Li & Rieckmann 1992, Liu et al. 1992, Tang & Eisenbrand 1992, White 1992, Maeno et al. 1993, Meshnick 1993, Woerdenbag et al. 1993a, Karbwang et al. 1994).
De tous ces dérivés, l’artéméther constitue le meilleur candidat aux tests de la phase clinique III. En effet, des études comparatives effectuées par Karbwang et ses collaborateurs (1992) ont montré que ce produit est plus efficace que la quinine, et provoque moins d’effets secondaires que celle-ci. Cette augmentation de l’efficacité se manifeste aussi au niveau du nombre de survivants.
En plus, concernant l'artésunate de sodium, des études ont montré qu'une administration orale de 600 ou 700 mg pendant 5 jours est aussi efficace qu'une dose de 600 mg de quinine, prise toutes les 8 h pendant 7 jours, en association avec 250 mg de tétracycline toutes les 6 h (Barradell «& Fitton 1995). Il serait utile de remarquer la lourdeur de ce dernier traitement, compte tenu du nombre de prises de ces médicaments.
Quant à la rapidité d’action, l’artéméther s’est révélée être supérieure à la sulfadoxine- pyriméthamine et à la chloroquine, tandis que les résultats sont similaires à ceux obtenus avec la quinine (OMS 1994-1995).
Cependant, en comparaison avec les résultats obtenus avec l'artésunate de sodium, cette dernière s'est révélée plus rapide que la méfloquine, que la quinine associée à la tétracycline et que la quinine administrée en intraveineux, dans la réduction de la parasitémie et de la fièvre (Barradell Fitton 1995).
Une des différences entre ces molécules et les antipaludiques classiques réside dans la structure. En effet, alors que les antipaludiques tels que la quinine et ses analogues contiennent un atome d'azote, l'artémisinine et ses analogues n'en possèdent pas, mais sont, pour la plupart, caractérisés par un groupement endoperoxyde.
La particularité de l'artémisinine et de ses analogues réside également dans son efficacité contre
les souches de Plasmodium résistantes aux antipaludiques tels que la chloroquine, la
méfloquine, la pyriméthamine, l’association méfloquine-pyriméthamine, et contre la malaria cérébrale (Klayman 1985). On a également observé que des formes de Plasmodium développent une résistance vis-à-vis de la quinine, de l’amodiaquine, de la proguanil et de la pyriméthamine associée à la sulfadoxine (Le Bras & Basco 1994).
1 Artémisinine
3 Artéméther
5 Artésunate de sodium
2 Artémisitène
4 Artééther
6 Déoxoartémisinine
Fki. I. Structure de l’artéinisininc et de quelques-uns de scs analogues.
2. LE PLASMODIUM Y.T LE PALUDISME
Le Plasmodium est un protozoaire appartenant à l'embranchement des Apicomplexa et à la classe des Sporozoaires, comme les Coccus et les Toxoplasma (Rémy-Kristensen & Pesson
1993).
Quatre espèces de Plasmodium sont responsables du paludisme chez l'homme. Il s'agit de P.
falciparum (le plus répandu et le plus dévastateur), P. vivax, P. malariae et P. ovale. Les quatre espèces diffèrent surtout par le type de fièvre qu'elles provoquent (Gentilini 1988).
D'autres espèces existent: le P. chabaudi et le P. bergei parasitent les souris, le P. cynomolgi et le P. knowlesi parasitent les primates (Srivastava et al. 1992), tandis que P. gallinaceum et P. inmi sont utilisés pour infecter respectivement les poulets et les singes au cours d'études visant à tester l'activité de nouveaux médicaments (Woerdenbag et al. 1990).
Etymologiquement, le mot paludisme (également appelé "malaria") dérive du mot latin palus qui signifie marais, et malaria provient de mala - mauvais et aria = air.
Les Italiens du 17ème siècle croyaient, en effet, que les fièvres étaient dues à la respiration du mauvais air en provenance des marais. Ce n'est qu'au 19ème siècle qu'on découvrit que le paludisme se transmettait par la piqûre d'un moustique, l'anophèle femelle.
Lapierre (1990) définit le paludisme comme «une maladie parasitaire fébrile et hémolysante due à un protozoaire sanguicole (hématozoaire) du genre Plasmodium, transmis par un moustique du genre anophèle ».
De part ses symptômes, le paludisme constitue l'un des obstacles majeurs au développement économique des pays tropicaux. En effet, les paludéens souffrent de fièvres, de frissons, d’anémies ... et se retrouvent dans l'impossibilité de travailler.
La malaria se classe parmi les maladies parasitaires les plus répandues. Selon l'OMS, ce fléau
touche plus de 300 millions de personnes dans le monde et parmi celles-ci, 2,7 millions en
meurent chaque année. En 1991, le nombre d'enfants morts du paludisme en Afrique était de
800.000. En outre, le paludisme déclenche ou aggrave d'autres affections susceptibles d'être
mortelles, par exemple les infections respiratoires et les diarrhées chez le nourrisson et le jeune
enfant. Les personnes non immunisées tels que les voyageurs en provenance des régions non-
endémiques, les nourrissons et les enfants non encore exposés à la maladie, constituent un
groupe à haut risque pour le développement de la malaria. Les femmes enceintes vivant dans
les zones endémiques sont aussi des personnes à risque, en ce sens qu'elles perdent une partie
de leur immunité acquise (Barradell & Fitton 1995).
Par ailleurs, les maladies affectant l'immunité telle que le syndrome de l'immunodéficience acquise (SIDA) dégradent l'état général de la santé des malades.
La plupart des cas recensés se rencontrent en Afrique mais le paludisme sévit également en Asie, en Amérique Centrale et en Amérique Australe. Ces régions jouissent d'un climat tropical chaud et humide, favorable à la vie des moustiques et des Plasmodium.
On connaît également des cas de malaria importée, notamment chez les voyageurs et les travailleurs des aéroports.
Malgré les efforts consentis dans la lutte antipaludique, avec des résultats variables, de nouvelles souches résistantes continuent à émerger, tant dans les populations du vecteur (l'anophèle femelle) que parmi les souches du parasite (le Plasmodium).
La résistance aux antipaludiques a été observée depuis 1951 et, après l'Amérique et l'Asie où elle est prépondérante, elle s'étend de façon alarmante sur le continent africain. Selon Le Bras et Basco (1994), parmi les quatre espèces infestant l’homme, seul P. falciparum montre une capacité à acquérir la résistance vis-à-vis des schizonticides sanguins.
La mise au point de nouveaux antipaludiques constitue donc une des priorités des responsables de la recherche en parasitologie tropicale, sans pour autant oublier l'amélioration de la lutte antivectorielle et les travaux sur les vaccins.
L'enthousiasme suscité par la mise au point du vaccin SPf66 fut atténué par les résultats qui montrèrent qu'après une année, seules 38,8% des personnes vaccinées étaient encore protégées (Valero et al. 1993 cité par Ferreira 1994). Plusieurs molécules sont en cours d’études dont MSP-1 (merozoite surface protein-1) appelé également MSA-1 (merozoite surface antigen-1) et HRP-2. Cette dernière est une protéine produite par la membrane du globule rouge parasité.
On connaît également l’AMA-l (apical membrane antigen-1) (Dodet 1994), le LSA-1 (liver stage antigen-1)...
La lutte antipaludique devra donc, pour être plus efficace, tenir compte des exigences du
vecteur, des formes du parasite et des réalités socio-économiques des pays touchés par le
paludisme. C'est pour cela qu’à côté des moyens de lutte antivectorielle (insecticides et lutte
biologique) et de chimiothérapie, des efforts particuliers devraient être consentis pour
encourager et soutenir la mise au point des vaccins, ainsi que les recherches en phytochimie, les
plantes constituant encore la principale source de médicaments.
3. L'ARTEMISmiNE ET SES ANALOGUES
3.1. Biosynthèse et structure de l'artémisinine et de ses analogues
3.1.1. Biosynthèse de l'artémisinine et de ses analogues
La plupart des métabolites élaborés par les armoises se rencontrent chez A. annua et lui confèrent une grande importance parmi les autres espèces à'Artemisia. La présence de ces produits justifie également son usage, tant en médecine traditionnelle et populaire qu'en médecine moderne, comme antipyrétique et antipaludique.
Parmi ces métabolites, l'artémisinine attire de plus en plus l'attention des chercheurs. C'est une lactone sesquiterpénique possédant un groupement endoperoxyde qui dérive du farnésyl pyrophosphate comme le suggèrent différentes propositions de voies de biosynthèse.
Pour l'artémisinine comme pour les autres terpènes (mono-di-tri et tétraterpènes), le précurseur
de la biosynthèse est l'isopentényl diphosphate ou isoprène activé, dérivant lui-même de l'acide
mévalonique (Figure 2) (Richter 1993). L’isopentényl diphosphate est synthétisé à partir de
deux molécules qui forment tout d’abord l’acéto-acetylCoA; une troisième molécule, ajoutée
par condensation, fait apparaître la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA. Après différentes autres
réactions, la polymérisation par additions successives de trois éléments isopréniques en Cs
conduit à la formation du farnésyl diphosphate qui représente le produit initial pour la synthèse
des sesquiterpènes et des triterpènes. A partir du farnésyl diphosphate, une voie de biosynthèse
conduirait aux triterpènes par dimérisation; ceux-ci seraient convertis en stéroïdes en passant
par le squalène. Une deuxième voie amènerait à la formation du géranyl-géranyl-P-P pour
arriver aux diterpènes et/ou aux tétraterpènes, tandis qu'une troisième voie aboutirait aux
sesquiterpènes parmi lesquels se trouvent l'artémisinine et ses analogues.
Figure 2; Biosynthèse des terpènes et position de l’artémisinine et de ses analogues
(Résumé tiré des figures de Richter 1993).
Figure 3: Voie de biosynthèse de l’artémisinine proposée par Jung et ses collaborateurs (1990).
Nair et al. 1986 et Roth & Acton 1989, pensent que c'est l'artéannuine B qui serait le précurseur de l'artémisinine. Dans d’autres travaux, Nair et ses collaborateurs (1986) suggèrent que l'artémisinine et l'artéannuine B sont produites indépendamment à partir de l'acide artémisinique. Selon Akhila et ses collaborateurs (1987), le famésyl pyrophosphate est considéré comme le précurseur des sesquiterpènes et donc de l'artémisinine aussi.
El-Feraly et al. (1986), Jung et al. (1990), Misra et al. (1993a) et Sangwan et al. (1993) considèrent l'acide artémisinique comme un éventuel précurseur biogénétique aussi bien pour l'artéannuine B que pour l'artémisinine. La figure 3 représente une proposition de voie de biosynthèse selon Jung et ses collaborateurs (Jung et al. 1990).
Par contre, d’autres auteurs pensent que l'artémisitène est le précurseur immédiat de
l’artémisinine (Woerdenbag et al. 1993a). Ces mêmes auteurs rapportent également que l’acide
artémisinique et l’artéannuine B sont aussi des précurseurs de l’artémisinine.
Par ailleurs, les travaux de El-Feraly et ses collaborateurs (1986) ont montré que l'acide artémisinique pouvait être converti, in vitro, en artéannuine B par photooxygénation et, selon Roth & Acton (1989), l'acide artémisinique a été converti en artémisinine et en ses analogues tels que l'artéannuine B et l'artémisitène. Cette dernière peut également être préparée à partir de l'artémisinine (El-Feraly et al. 1990).
D'autre part, Sangwan et ses collaborateurs (1993) ont réalisé la transformation in vivo et in vitro de l'acide artémisinique en artéannuine B et en artémisinine.
3.1.2. Sites de biosynthèse et formes d'accumulation de l'artémisinine et de ses analogues
Il semble que la biosynthèse des métabolites secondaires est confinée à des tissus spéciaux ou même des cellules spéciales en fonction du niveau de différenciation, du stade de développement ou des conditions écologiques ou environementales, comme les blessures ou l’attaque par les microorganismes (Wink 1990).
L’accumulation, elle, peut prendre place dans plusieurs types de tissus ou d’organes (racines, feuilles ou fruits), même si la biosynthèse se déroule dans un tissu particulier. Les deux phénomènes peuvent avoir lieu dans le même type de tissus ou de cellules, mais dans certains cas, des problèmes d'accumulation peuvent avoir lieu. Par exemple, chez les plantes à alcaloïdes, l’un des problèmes d’accumulation des alcaloïdes indoliques serait dû à leur faible solubilité dans l’eau, même en milieu acide (Verpoorte étal. 1993).
Chez les Asteraceae, les métabolites secondaires s’accumulent dans les trichomes glandulaires, qui sont des structures spécialisées de type poils (Liersch et al. 1986).
Dans le cas de VA. anmta, les travaux de Duke et ses collaborateurs (1994) ont montré que l'artémisinine et l'artémisitène sont accumulées dans l'espace subcuticulaire des trichomes glandulaires. Un traitement des tissus foliaires au chloroforme (CHCI3) permet d'extraire l'artémisitène. Selon ces auteurs, la forme d'A. anniia dépourvue de trichomes ne contient ni l'artémisinine ni l'artémisitène (Duke et al. 1994)
Par ailleurs, la forte accumulation de l'artémisinine dans la partie aérienne suscite un intérêt quant à la manière de valoriser la récolte de ces plantes. De plus, les travaux de Ferreira et al.
(1995a, 1995b) indiquent que le taux d'artémisinine, présent dans les sommités et les
inflorescences, diminue au mois de juin pour augmenter en juillet, tandis que le taux
d'artémisinine présent dans les feuilles reste presque constant au cours des mois de mai, juin et
juillet. Les expérimentations sont menées en serres. Dans ce contexte, une question peut se
poser: la taille (coupe) des plantes pourrait-t-elle conduire à une augmentation de la production de l'artémisinine en induisant une augmentation du nombre de pousses à cueillir? Les détails des manipulations et les résultats obtenus seront explicités dans le chapitre V.
3.1.3. Structure de l'artémisinine et de ses analogues
Contrairement aux dérivés de la quinine, l'artémisinine et ses analogues ne contiennent pas d'atomes d'azote.
La principale particularité dans la structure de ces nouveaux antipaludiques est la présence d'un pont peroxyde qui semble être lié à l'activité biologique de ces molécules (Figure 1).
3.2. Chimiosynthèse et stabilité de l'artémisinine et de ses analogues
3.2.1. Synthèse chimique
Des essais de synthèse chimique de l'artémisinine ont été réalisés. La littérature rapporte que la première synthèse chimique de l'artémisinine fut réalisée par Schmid & Hofheinz en 1983. La procédure nécessita 19 étapes et le rendement de la réaction fut de 30%. Un peu plus tard, Xu et ses collaborateurs (1986) effectuèrent aussi la synthèse de l'artémisinine. Ravindranathan et ses collaborateurs (1990), ainsi que Ravindranathan (1994) réussirent, eux aussi, la synthèse chimique de l'artémisinine.
L'ultime étape de cette synthèse fut la photooxygénation d'un éther méthylique alcool « methyl enol ether » conduisant à l'intermédiaire présumé, qui fut converti en artémisinine (Tang &
Eisenbrand 1992).
Toutes ces méthodes présentent l'inconvénient d'être longues, sans pour autant avoir un
rendement économiquement intéressant. Beaucoup d'auteurs considèrent alors que la plante
cultivée reste la meilleure source de l’artémisinine et de ses analogues (Liersch 1986,
Woerdenbag et al. 1994, Ferreira 1994). Aussi, certains autres se sont-ils intéressés à
l’hémisynthèse de l’artémisinine et de ses analogues. C’est ainsi qu’un dérivé fut préparé à
partir de l’acide artémisinique. Il s’agit de la 12-(3’-hydroxy-n-propyl)deoxoartémisinine, qui
s’est avérée être, in vitro, 5 fois plus active que l’artémisinine.
Par ailleurs, les régions habitées par les populations les plus touchées par le paludisme bénéficient de conditions climatiques qui sont favorables à la culture de VArtemisia. De plus, la main d'oeuvre y est généralement plus accessible et moins chère.
3.2.2. Stabilité
Après traitement par un acide fort tel que l'acide sulfurique (H2SO4) ou le carbonate de potassium (K2CO3), l'artémisinine forme une lactone norsesquiterpénique. L'artémisinine est également instable aux températures élevées: chauffée à 190°C pendant 10 min, elle se dégrade (Lin et al. 1985, Sipahimalani étal. 1991, Tang & Eisenbrand 1992). Chauffée dans du xylène pendant 22 h, l’artémisinine libère deux produits par rupture du pont peroxyde (Xuan-De Luo et al. 1985). D’après Wei et al. (1992), un des produits de dégradation a été identifié comme étant l’artéannuine G. Soumise à ces conditions de température, la dihydroartémisinine est également instable.
3.3. Mécanismes et mode d'action de l'artémisinine et de ses analogues
L'artémisinine (qinghaosu) et ses précurseurs de biosynthèse (incluant l’acide artémisinique, l'artéannuine B et l'artémisitène) ainsi que ses dérivés (incluant la dihydroqinghaosu, l'artéméther, l’artééther, l’artélinate, l’acide artélinique et l'artésunate) sont d'un grand intérêt pour le traitement de la malaria cérébrale et des cas de résistance aux médicaments habituels (Brossi 1988, Editorial Lancet 1992).
L’artémisinine et ses analogues agissent par alkylation et oxydation des protéines, oxydation des graisses, inhibition de la biosynthèse des protéines et des acides nucléiques (Kamchonwongpaisan et a/. 1992).
Ces substances agissent également en perturbant le métabolisme énergétique membranaire (Peters 1989, cité par Rémy-Kristensen &. Pesson 1993).
D'après Rémy-Kristensen & Pesson (1993), les travaux de Meshnick et ses collaborateurs (1991) ont révélé que l’artémisinine génère des radicaux d’oxygène après destruction du pont peroxyde et entraîne un endommagement membranaire chez le parasite.
Toujours selon Rémy-Kristensen &. Pesson (1993), l'artémisinine se fixe sélectivement sur la
membrane parasitaire, forme un complexe covalent avec la ferriprotoporphyrine IX et se
concentre ainsi dans le parasite: c'est un antagoniste de la chloroquine. Woerdenbag et ses
collaborateurs (1990) ont, par ailleurs, montré qu’il existe une interaction entre la cytochrome oxydase et le système de transport de la glutamine (Woerdenbag et al. 1990).
4. LES RECHERCHES EN PHYTOCHIMIE
Les recherches en phytochimie et en pharmacologie se sont souvent basées sur des données ethnopharmacologiques. En effet, dès la plus haute Antiquité, l'homme recourt à son environnement pour résoudre ses problèmes et de nombreuses recherches sont menées en agroalimentaire, en pharmacie et en cosmétologie en vue de comprendre et de rationaliser la gestion des ressources végétales. Dans cette optique, des programmes entiers sont consacrés à l'inventaire des données cliniques et des utilisations sur le terrain des plantes médicinales du monde entier (Afrique, Madagascar, Inde, Sri Lanka, Indonésie, Népal, Chine, Vietnam, Brésil), (Anton 1993).
Parmi les plantes identifiées, l’armoise annuelle {Artemisia annua L.), qui fait l’objet de notre travail, intéresse particulièrement les paludologues. C’est une Asteraceae d’origine asiatique dont les extraits des feuilles sont doués de propriétés antipaludiques grâce, principalement, à la présence de l’artémisinine. Cette molécule fut découverte en 1972 par des scientifiques chinois.
Depuis longtemps, la plante était connue, en médecine traditionnelle chinoise, pour ses effets contre les frissons et les fièvres.
Cependant, ce regain d'intérêt vis-à-vis des plantes médicinales ne signifie pas que ce sont les seules sources convenables de médicaments, mais permet d'apprécier à sa juste valeur la chimie de synthèse et de garder à l'esprit que l'une ou l'autre forme de production de médicaments a ses intérêts, ses qualités et ses défauts.
5. LES METHODES D'ANALYSE DES METABOLITES SECONDAIRES
D'une manière générale, les métabolites secondaires sont analysés par des procédés classiques,
principalement les méthodes chimiques et les méthodes biochimiques utilisées pour la détection
et l'identification des substances végétales. Ces méthodes sont basées sur les propriétés
physico-chimiques des composés recherchés, quand ceux-ci sont connus.
Le problème se pose quand il faut détecter, isoler et caractériser de nouvelles molécules ou de nouveaux produits de biotransformation. Les propriétés biologiques sont également exploitées lors du screening du matériel végétal.
Trois types de méthodes sont habituellement utilisées pour l'analyse des métabolites secondaires: il s'agit des méthodes chimiques (les plus utilisées), des méthodes biologiques permettant la mise en évidence d'activités thérapeutiques et des méthodes biochimiques qui font appel aux interactions entre différentes substances telles que les anticorps et les récepteurs.
Les méthodes chimiques sont caractérisées par une série d'étapes dont les principales sont l'extraction, l'isolement et l'identification des substances. Ces étapes font appel aux techniques chromatographiques telles que la chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie liquide haute performance (CLHP), la chromatographie de partage centrifuge (CPC), la chromatographie en phase gazeuse (CG), la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG-SM), la spectrométrie de masse associée à la spectrométrie de masse (SM-SM) et tant d'autres.
Les méthodes biologiques sont utilisées dans le but de rechercher une activité biologique dans les extraits à analyser. Elles sont largement mises en application lors de tris à réaliser sur divers extraits végétaux.
Les méthodes biochimiques, faisant surtout appel aux techniques immunologiques, ont longtemps été utilisées dans les laboratoires de biologie clinique et de biochimie avant d'être introduites dans le domaine de la biologie végétale. Kemp & Morgan 1987 rapportent que le premier type de méthode immunologique fut développé en 1959 par Yalow et Berson pour mesurer la teneur en insuline du plasma sanguin. C'était une méthode radioimmunologique.
Elle fut ensuite introduite dans la recherche médicale et rapidement développée pour le dosage des peptides et des hormones. Plus tard, elle fut étendue à la détermination des haptènes (Oliver et al. 1968 cité par Kemp & Morgan 1987), ce qui permit de faire des analyses immunologiques sur les médicaments stéroïdiques.
L'utilisation des méthodes immunologiques en sciences végétales ne fut connue qu'en 1969 (Fuchs &. Fuchs 1969, cité par Kemp & Morgan 1987) avec le dosage de l'acide indole acétique et de l'acide gibbérellique.
Par la suite et jusque maintenant, beaucoup de travaux sont publiés, aussi bien dans le domaine
médical que dans celui de la biologie végétale, où les méthodes immunologiques prennent une
grande ampleur (Weiler & Zenk 1976, Fong et al. 1980, Weiler et al. 1981, Robins et al.
1984a, 1984b, Lee et al. 1990, Yoshimatsu et al. 1990, Kikuchi et al. 1991, Jaziri et al. 1991, laimetal. 1992, Jaziri e/a/. 1993, Kitagawae/a/. 1994, Nelson a/. 1994).
6. LES METHODES IMMUNOLOGIQUES
Ce sont des méthodes basées sur l'utilisation d'anticorps spécifiques et d’antigènes. Elles reposent sur les interactions antigènes-anticorps, interactions dont la spécificité dépend en grande partie de l'antigène utilisé. Le dosage se fait grâce à des marqueurs. Selon le type de marqueurs, les méthodes immunologiques se subdivisent en radioimmunologie, en immunoenzymologie et en immunofluorescence. L'utilisation des anticorps pour la localisation des antigènes au sein des tissus, relève du domaine de l'immunohistologie. On recourt à l'immunohistochimie et à l'immunocytochimie pour la localisation des métabolites au sein des tissus végétaux et des cellules végétales. L’immunopharmacologie a été utilisée lors d’études permettant la mise en évidence d’effets potentialisateurs de certains produits à tester (Chihara
1992).
Les principaux avantages des méthodes immunologiques sont la sensibilité, la spécificité de la réaction antigène-anticorps et la rapidité avec laquelle elles sont appliquées (Gafré et Butcher
1986, Koppatschek étal. 1990, Jaziri & Homès 1991, Jaziri et al. 1991, Jaziri étal. 1993).
Comme mentionné au début, une partie de notre travail porte sur les méthodes de détection de l'artémisinine et de ses analogues, surtout les méthodes immunologiques, ainsi que sur une mise au point d'un système de culture in vitro et in vivo en vue d'étudier les prérequis à un transfert en champs.
Il a été en effet, démontré, que la meilleure source d'artémisinine et de ses analogues reste la
plante cultivée (Liersch et al. 1986, Delabays et al. 1992, Woerdenbag et al. 1994) et que la
culture in vitro de tissus et/ou d'organes ne serait qu'une alternative. C’est le cas notamment,
pour la micropropagation de souches plus productrices et pour des recherches d'ordre
fondamental, telle que l'étude des voies de biosynthèse et la transformation génétique. Aussi,
l'identification de ces souches plus productrices doit-elle se faire au moyen de méthodes
sensibles et rapides, vu le grand nombre d'échantillons à analyser. C'est pour cela que nous
avons choisi l'utilisation de méthodes immunoenzymatiques combinées avec les méthodes
chromatographiques et biologiques, pour détecter l'artémisinine et ses analogues dans les
cultures d'A. annua. La méthode ELIS A est largement utilisée en biologie végétale et s’étend à ragroalimentaire où elle est employée pour la détermination des résidus d’herbicides et de fongicides dans les aliments, aussi bien d’origine végétale qu’animale (Koppatschek et al.
1990, Brandon et al. 1995, Matthews Haverly 1995), ainsi que pour d’autres applications
phytochimiques (Belunis & Hrazdina 1988).
MATERIEL ET METHODES
1. MATERIEL VEGETAL
1.1. Le matériel végétal mis en culture
Le matériel de départ est constitué de graines provenant du Walter Reed Army Institute of Research (Washington D.C.) et multipliées au Jardin Botanique Expérimental Jean Massait de l'Université Libre de Bruxelles (Belgique).
Les cultures réalisées dans le cadre de notre travail sont initiées à partir de ces graines mises à germer, soit en conditions stériles pour les cultures in vitro, soit en germoir pour les cultures en terre (serres et champs).
Selon les objectifs poursuivis, les différents types de cultures in vitro sont réalisés à partir de jeunes plantules axéniques, de fragments de racines, de tiges, de feuilles ou d'inflorescences.
Les graines utilisées pour la culture m vitro sont désinfectées suivant un protocole que nous avons mis au point et qui est décrit ci-après.
Le protocole de désinfection des graines débute avec un trempage-lavage des graines à l'eau de robinet additionnée d'une ou deux gouttes de Tween 20 dans 100 ml. Plusieurs lavages sont nécessaires avant que les graines ne soient complètement imbibées. Elles sont ensuite successivement traitées avec du Benomyl® à 5 g/l pendant 1 h, de l'éthanol à 70% (V/V) pendant 15 min et de l'hypochlorite de calcium à 7,5 g/l pendant 10 min. Elles sont finalement rincées à l'eau distillée stérile (3 fois 10 min) et mises à germer dans des pots ou des boîtes de Pétri contenant du papier filtre humide, le tout préalablement autoclavé à 135°C pendant 1 h.
Les cultures en terre sont réalisées avec des plantules issues de semis ou des plantules
régénérées in vitro.
1.2. Le matériel analysé
La plupart des échantillons sont séchés à l’air libre (22-23°C). Ils sont étalés en couche mince pendant une semaine puis broyés.
Certains échantillons (principalement ceux provenant de la culture in vitro) sont lyophilisés avant le broyage et l'extraction. Les analyses portent sur des extraits de poudres.
2. METHODOLOGIE
2.1. Les cultures in vitro
Les cultures in vitro sont effectuées en conditions stériles sous hotte à flux laminaire dans des tubes et/ou des bocaux en verre, des raviers en plastique ainsi que des boîtes de Pétri en plastique. Les milieux de culture sont composés d'eau, de sels minéraux (macro et microéléments), de sucres, de régulateurs de croissance, de vitamines et d'autres substances. Ils sont soit liquides, soit solidifiés par un gel (de l'agar Bacto dans notre cas). La stérilisation se fait par filtration (filtre de 0,2 |j,m, Sartorius GmbH, Germany) pour les milieux liquides contenant des antibiotiques ou par autoclavage (120°C pendant 20 min) pour les milieux solides et les milieux liquides en grande quantité. Les hormones sont stérilisées par filtration et ajoutées au milieu de culture après autoclavage de celui-ci. En effet, Berton et ses collaborateurs (1989) ont montré que l’ajout d’auxines avant l’autoclavage provoque des effets néfastes sur les cultures. Les pousses enracinées sur un milieu contenant de l’ANA autoclavé manifestent, par ailleurs, des signes de toxicité.
La composition des différents milieux de base utilisés est reprise dans le tableau 1 tandis que le tableau 2 résume la composition en acides aminés de Margara. L'eau ultrapure, distillée, désionisée (filtre Millipore MILLI-Q™ Water Purification System MOD 1106280400 HP 1/6 V230), est stérilisée à 135°C pendant 60 min et les instruments (bistouris, lames, spatules, ...) sont stérilisés au four à 180°C pendant 60 min également.
Les paramètres étudiés pour évaluer la croissance sont l'évolution de la matière fraîche et l'évolution de la matière sèche. La production de l'artémisinine et de ses analogues est également analysée.
L'analyse des résultats se fait en comparant les moyennes des valeurs des différents paramètres
observés au niveau des témoins et au niveau des échantillons traités en cas d'études des effets
de différents facteurs sur la croissance des cultures et la production de l’artémisinine et de ses analogues. Les bactéries utilisées pour l’étude de la transformation sont cultivées sur les milieux YEB et LB, solides ou liquides selon la finalité. La composition de ces différents milieux est indiquée dans le tableau 3.
Tableau 1: Composition des différents milieux de base utilisés pour la culture in vitro d’A. annua
A. Composés minéraux (mg/1):
Macroéléments MS
Murashige et Skoog
MS/2 B
5Gamborg
LS Linsmaïyer
et Skoog
H Heller
K Knop
CaCl
2.
2H
20440
220150 440 75 -
KH
2PO
4170 85
-170
-125
KNO
31900 950 2500 1900
-125
NaNOj
- - - -600
-MgS04.7H20 370 185 250 370 250 125
NH
4NO
31650 825
-1650
- -NaH
2P
04.H
20 - - - -125
-NaH2P04.4H20
-- 130
-- -
(NH4)2S04 - - 130 - - -
Ca(N03>2.4H20 - - - - - 500
KCl -
-- - 750 -
Microéléments MS MS/2 Bs LS H K
C
0CI
2.
6H
2O 0,025 0,025 0,025
1ml des
oligo de Heller
CUSO
4.
5H
2O 0,025 0,025 0,025 0,025 0,03
H
3BO
36,200 6,200 3,000 6,200 1
Kl 0,830 0,830 0,750 0,830 0,01
MnS04.4H20 22,30 22,30 10,00 22,30 0,1 -
Na2Mo04.2H20 0,250 0,250 0,250 0,250
- -ZIISO4.7H2O
8,600 8,600 2,000 8,600
1 -FeS04.7H20
