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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Harvengt, P. (2001). Contribution à l'étude de l'oligomérisation, de la phosphorylation et de la structure secondaire des aquaporines des graines de Lens culinaris (Med.) (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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D 05951

UI ^é B

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Département de Biologie Végétale Laboratoire de Physiologie Végétale

Contribution à l’étude de l’oligomérisation, de la phosphorylation et de la structure secondaire des aquaporines des graines

de Lens culinaris (Med.).

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Promoteur: Prof. Fabrice Homblé.

Pol HARVENGT Décembre 2000.

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Département de Biologie Végétale Laboratoire de Physiologie Végétale

Contribution à l’étude de l’oligomérisation, de la phosphorylation et de la structure secondaire des aquaporines des graines

de Lens culinaris (Med.).

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Promoteur: Prof. Fabrice Homblé.

Pol HARVENGT Décembre 2000.

RESUME

Les flux transmembranaires de solutés et d’eau sont à la base de l’homéostasie cellulaire.

Le passage de ces molécules au travers des membranes biologiques est en majeure partie médiée par des canaux ou transporteurs membranaires. Les aquaporines représentent une classe de canaux membranaires impliquées dans le transport sélectif de l’eau. Le génome des végétaux est particulièrement riche en séquences codantes pour des aquaporines. Parmi ces gènes, deux sont exprimés dans la graine. Néanmoins, jusqu’à présent, une seule protéine avait été isolée dans la graine : l’a-TIP. Ce travail a été entamé afin d’apporter de nouveaux éléments dans la compréhension de l’expression, des propriétés biochimiques et de la structure des aquaporines de la graine. En utilisant les techniques de microséquençage, de spectrométrie de masse, de protéolyse limitée et d’immunodétection, nous avons identifié deux aquaporines à partir des tissus des graines de lentille {Lens culinaris Med.). Par le biais de la technique de marquage radioactif, nous avons montré que les deux aquaporines des graines de lentille sont phosphorylées dans leur membrane native par une kinase endogène. Nous avons caractérisé cette protéine kinase, qui est une enzyme de 52 kDa dont l’activité est dépendante du magnésium et est stimulée par le calcium. Nos résultats suggèrent que que cette enzyme pourrait appartenir à la classe des CDPKs. La technique de pontage chimique nous a également permis d’établir que les deux aquaporines des graines de lentille forment des hétéro-oligomères dans leur membrane native. La forme hétérodimérique présente une grande stabilité, bien que la forme native soit probablement tétramérique. L’étude de la structure secondaire des protéines purifiées indique que les deux protéines sont riches en hélice a. Les techniques d’investigation de la structure secondaire utilisées dans ce travail (CD et ATR-FTIR) ne nous ont pas permis de mettre en évidence de changement conformationnel associé à la phosphorylation des aquaporines des graines de lentille. Cependant, il est possible que ces changements ne concernent qu’un petit nombre d’acides aminés et ne soient pas détectables par les méthodes spectroscopiques de type ATR-FTIR.

Remerciements.

A tout seigneur, tout honneur...je voudrais donc tout d'abord remercier chaleureusement mon promoteur, Fabrice Homblé. Ce travail a grandement bénéficié de l'étendue de ses connaissances scientifiques. Je voudrais également le remercier pour sa patience et sa disponibilité.

Mes plus vifs remerciements au Prof. Jean-Marie Ruysschaert qui m'a -selon la formule consacrée- accueilli dans son laboratoire. Ses conseils pertinents nous ont été précieux. De plus, son inénarable sens de l'humour est tout à fait remarquable (!)...

Je tiens également à souligner l'importance de la contribution du Dr. Ruddy Wattiez (Université de Mons-Hainaut). Son expertise des techniques de microséquençage nous ont apporté des informations importantes.

Je me dois de remercier le Dr. Erik ôoormaghtigh, le gourou du FUR, dont les compétences et la grande disponibilité m'ont été des plus utiles au cours de ces derniers mois.

Je tiens tout particulièrement à remercier le Dr ôuy Vandenbussche, pour son incroyable bonne humeur et ses conseils particulièrement précieux, dont je n'ai pas été le seul bénéficiaire. Je pense que tous le membres du laboratoire se joindront à moi pour lui adresser un "Merci, M'sieur Suy !".

Un grand merci à Helge (Herr Doktor Abrecht) pour son aide, entre autre durant les tentatives de reconstitution des TTPs. En plus, il a supporté mon anglais raz-des - pâquerettes durant 4 ans !

On l'a déjà écrit, et ca ne fera jamais qu'une fois de plus : l'ambiance de travail au LCPMI (enfin, je veux dire au SFMB) est vraiment excellente, et tout le monde y participe : Merci à Véro &., Helge, Moussa, Mathias, Sunu, Catherine, Fred, Mica, Véro C., Frantz, Abdel, Michel VDB, Christian, Ariane, Bruno, Vincent, Vinciane, Françoise, Fabien, Véro P., Anne, Patrick, No, Anthoula et Suzon.

Je voudrais m'excuser auprès de mon vieux compère Olivier R. qui a dû se sentir très à l'étroit en tant que voisin de bureau et de paillasse à cause de ma propension à un certain expansionisme territorial. Ca y est, tu vas avoir de la place, maintenant !

Chapeau bas à mon pote de toujours, Olivier W., pour ses encouragements et son éternel humour noir !

Je voudrais associer mes parents et mon frère à ce travail. Ils m'ont toujours soutenu et encouragé. Je sais que je leur dois beaucoup.

Je n'oublie pas Claire, ma compagne, que je remercie pour son soutien permanent et inconditionnel. Ca y est, c'est fini, Chouke !

TABLE DES MATIERES

1. Introduction... 1

1.1 Fluxd’eautransmembranairechezlesplantes... 2

1.2. Découvertedescanauxàeau... 4

1.2.1. Le CHIP28 (AQP-1) de la membrane du globule rouge humain... 5

1.2.2. Classification des aquaporines...6

1.3. Structuredesaquaporines...10

1.4. Régulationdel’expressionetdelafonctiondesaquaporines... 12

1.4.1. Régulation transcriptionnelle...12

1.4.2. Régulation post-traductionnelle...14

1.5. Lesaquaporinesdelagraine...18

1.5.1. Formation des corps protéiques (CPs) et des vacuoles de stockage des protéines (VSPs)...18

1.5.2. Composition lipidique et protéique des VSPs...19

1.5.3. La protéine majeure de la membrane des VSP : l'a-TlP...20

1.5.4. Régulation du transport d’eau de l'a-TlP...21

2. Objectifs du travail et stratégie scientifîque...23

3. Résultats et Discussion... 24

3.1. Purificationetidentificationdedeuxaquaporinesdesgrainesdelentille... 24

3.1.1. Isolement des membranes des corps protéiques de lentille...24

3.1.2. Purification de deux protéines intégrales des membranes des corps protéiques...24

3.1.3. Identification de deux aquaporines de la membrane des VSPs...25

3.2. OligomerisationdesTIPs... 32

3.2.1. Pontage chimique des TIPs par le glutaraldéhyde...32

3.2.2. Détermination de la nature des oligomères...33

3.2.3. Spécificité de l'association monomère-monomère...34

3.3. Phosphorylationdes TIPs...38

3.3.1. Cinétique de phosphorylation et effet de la température...38

3.3.2. Effet des ions divalents...39

3.3.3. Effet dupH...40

3.3.4. Effet d’effecteurs potentiels...41

3.3.5. Spécificité de la protéine kinase des MVSPs...42

3.3.6. Détermination de la masse moléculaire apparente de la protéine kinase des MVSPs...42

3.3.7. Autres phosphoprotéines des MVSPs de lentille...43

3.4. Etudedelastructuresecondairedesprotéines TIPs... 46

3.4.1. Détermination de la structure des TIPs solubilisées dans le Génapol X-080par dichroisme circulaire...46

3.4.2. Détermination de la structure secondaire des TIPs par spectroscopie infrarouge en réfection totale atténuée...46

3.4.3. Etude des TIPs phosphorylées...50

IV. Conclusions générales et perspectives... 55

5. Méthodologie...58

5.1. Isolementdesmembranesdesvésiculesdestockagedesprotéines (VSPs) delentille... 58

5.2. Enrichissementenaquaporinesdesmembranesdes VSPs... 58

5.3. Purificationdesaquaporines... 59

5.4. Reconstitutiondesaquaporinesdanslamembranedevésiculeslipidiquesunilamellaires. 5.4.1. Préparation des grands liposomes unilamellaires d’asolectine...59

5.4.2. Reconstitution des protéines...59

5.5. Identificationdesaquaporinesdelentille...60

5.5.1. Microséquençage...60

5.5.2. Protéolyse limitée des aquaporines...61

5.5.3. Analyse des peptides de clivage par spectrométrie de masse de type Q-TOF...61

5.5.4. Immunodétection des aquaporines...62

5.6. Etudedel’ougomérisationdesaquaporinesparpontagechimique...64

5.6.1. Pontage chimique au glutaraldéhyde...64

5.6.2. Détermination du mode d'oligomérisation des aquaporines...64

5.6.3. Détermination de la nature des monomères par pontage au DTSP...65

5.6.4. Pontage des protéines membranaires des VSPs insérées dans des protéoliposomes...65

5.7. Phosphorylationdesprotéinesmembranairesdescorpsprotéiques... 66

5.7.1. Phosphorylation in vitro des protéines membranaires des VSPs...66

5.7.2. Calcul des concentrations en ions libres dans la solution...66

5.7.3. Séparation des acides aminés par chromatographie sur couche mince (Munoz et Marshall, 1990). ... 67

5.7.4. Localisation sur gel de l'activité protéine kinase associée aux membranes des VSPs...67

5.8. Dichrqïsmecirculaire... 68

5.9. Spectroscopieinfrarougeenréflexiontotaleatténuée (ATR-FTIR)... 69

5.9.1. Prise des spectres infrarouges...69

5.9.2. Détermination de la structure secondaire des aquaporines à partir des spectres ATR-FTIR...69

5.10. Protocoles DIVERS... 71

5.10.1. Electrophorèse sur gel SDS-PAGE...71

5.10.2. Coloration des gels SDS-PAGE...71

5.10.3. Dosage des protéines et des lipides...71

VI. Bibliographie... 72

VII. Annexe... 85

Liste des Abréviations

AQP aquaporine

ATP-y- P adénosine triphosphate (portant un isotope de phosphore 32 sur le groupement phosphate en position y).

ATR-FTIR spectroscopie infrarouge par transformée de Fourier en réflexion totale atténuée (Attenuated Total Reflection—Fourier Transform InfraRed spectroscopy)

BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolylhydrogénophosphate-p-toluidine BSA albumine sérique bovine

BTP bis-tris propane : l,3-bis[tris(hydroxyméthyl)méthylamino]propane CAPS acide cyclohexylaminopropane sulfonique

CD dichroisme circulaire {circular dichroism) CDPK calmodulin-like domain protein kinase DMSO diméthylsulfoxyde

DOC déoxycholate de sodium

DTSP dithiobis-succinimidylpropionate DTT dithiothréitol

EDTA acide éthylènediamine tétracétique

EGTA éthylène glycol-bis (P-aminoéthyl ether) N, N, N’, N’- tétracétique H/D hydrogène/deutérium

Hepes acide (N-2[hydroxyethyl] pipérazine-N’-[2-éthanesulfonique]) HPLC chromatographie liquide à haute performance

HTP hydroxylapatite

IgY immunoglobulines de classe Y KDa kiloDalton

LUV grands liposomes unilamellaires {large unilamellar vesicles) MVSP membrane des vésicules de stockage de protéines

m/z rapport masse sur charge NBT nitro-blue tétrazolium

PBS-T tampon phosphate salin avec Tween {phosphate buffer saline with Tween) PK-C protéine kinase de classe C

PLS moindres carrés partiels {partial least-square) PVDF difluorure de polyvinylidène

RX rayons X

SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis SUV petits liposomes unilamellaires {small unilamellar vesicles) TC A acide trichloracétique

TIP protéine intrinsèque tonoplastique {tonoplast intrinsic protein) T ricine N-tris [hydroxymethyljmethylglycine

Tris 2-amino-2-(hydroxyméthyl)-l,3-propanediol VSP vésicules de stockage de protéines

W-7 N-(6-aminohexyl)-5-chloropentène-l-sulfonamide hydrochloride

1. Introduction

I. Introduction

1. Introduction

L'eau constitue la molécule la plus abondante dans les cellules vivantes. Chez les végétaux, l'eau représente généralement entre 80 et 95 % de la masse des tissus en croissance. Les mouvements d'eau depuis le sol vers l'atmosphère par l'intermédiaire des tissus végétaux impliquent des mécanismes de transport à courte et à longue distance. Les transports à longue distance dans la plante sont réalisés principalement dans les vaisseaux du xylème qui sont caractérisés par une faible résistance hydraulique axiale (Steudle et Peterson, 1998). L’énergie nécessaire au maintien du flux d’eau est fournie par le gradient de potentiel hydrique entre les parties souterraines et les organes aériens de la plante. Ce gradient est entretenu par le flux d'eau transpiratoire régulé par les stomates, principalement localisés au niveau des tissus épidermiques des feuilles (Taiz et Zeiger, 1991). Le terme de transport à courte distance recouvre plusieurs mécanismes distincts (Figure LL). L'eau peut emprunter le continuum de parois cellulaires (appelé apoplaste) sans jamais traverser de membranes. Il s'agit de la voie apoplastique. Par contre, le transport symplastique s'effectue à l’intérieur d'un continuum cytosolique et implique le passage d'eau d'une cellule à l'autre au travers des plasmodesmes. Les transports apoplastiques et symplastiques preiment donc place respectivement dans le compartiment extracellulaire et intracellulaire. L’échange d’eau entre ces compartiments requiert le passage au travers des membranes plasmiques et de la membrane vacuolaire (ou tonoplaste) par la voie transcellulaire. Dans certains types cellulaires, ce flux transcellulaire constitue l'étape limitante. Dans les racines de la plupart des angiospermes, la progression radiale des molécules d'eau vers le cylindre vasculaire est bloquée au niveau de l’endoderme, dont les parois sont subérisées, ce qui les rend imperméables à l’eau et aux solutés (Kaufman et al., 1989). Par conséquent, toutes les molécules transportées au travers de l'endoderme doivent traverser la membrane plasmique et transiter par le cytoplasme des cellules endodermiques. Une fois dans la stèle vasculaire, l'eau emprunte de nouveau une des trois voies apoplastique, symplastique ou transcellulaire en direction des vaisseaux du xylème. La paroi des vaisseaux du xylème est rendue imperméable à l’eau par la présence de lignine. Néanmoins, ce dépôt de lignine n’est pas uniforme et des zones non-lignifiées appelées ponctuations permettent le passage des molécules d'eau au travers de la membrane plasmique des cellules adjacentes. D'autres

1

(A) Voie apoplastiaue (B) Voie svmplastiaue

(O Voie transcellulaire

Figure 1.1.Mouvements de l’eau dans les tissus végétaux. Le tissu est représenté par 4 couches cellulaires arrangées en série. On distingue la voie apoplastique (A) autour des protoplastes (parois en gris). La voie symplastique (B) est médiée par les plasmodesmes qui forment un continuum cytoplasmique (vert). Durant les mouvements impliquant l’apoplaste et le symplaste, aucune membrane ne doit être franchie. Les mouvements par voie trancellulaire (C) impliquent le passage au travers de deux systèmes membranaires (membrane plasmique et tonoplaste) par couche cellulaire (Steudle et paterson, 1998).

I. Introduction

organes ou cellules de la plante présentent des mouvements transmembranaires d'eau importants. C'est notamment le cas des cellules de garde qui contrôlent l'ouverture des stomates ou des cellules motrices des pulvini.

1.1 Flux d’eau transmembranaire chez les plantes.

Chez les plantes, les flux d’eau transmembranaires apparaissent en réponse à un gradient de potentiel hydrique (Av|/). Si l’on considère deux compartiments cellulaires séparés par une membrane perméable à l’eau et aux solutés, la différence de potentiel hydrique est défini par la relation (Steudle, 1989):

Av|/ = AP - CS An (Mpa)

où ziP (Mpa) est la différence de pression hydrostatique et An (Mpa) est la différence de pression osmotique entre les deux compartiments, a étant le coefficient de réflection membranaire aux solutés, a = 1 si la perméabilité membranaire aux solutés est nulle et ct = 0 si les solutés traversent la membrane aussi efficacement que l’eau.

Le flux net d’eau au travers de la membrane est déterminé par la valeur du gradient de potentiel hydrique (Aij;) et par la perméabilité hydrique de la membrane (Lp) (Johansson et ai, 2000). Si on considère un seul soluté, le flux net transmembranaire (Jy) est proportionnel à la force motrice (AP-aATr), à l’aire de la membrane (A) et à la conductivité hydraulique de la membrane (Lp)

Jy = Lp.A. (AP-aAn) (cmVs)

La perméabilité osmotique membranaire à l’eau, Pf (cm/s), peut être déduite à partir de Lp par la relation :

Pf = LpRT/Vw (cm/s)

2

Via la bicouche lipidique

Pj / = l

Pf faible (10‘^ m s'^) Eg = 46 à 63 kJ mol''' Insensible au mercure Gating impossible

Via les canaux à eau

Pf/Pd>1

Pf élevé (10'^ à 10'^ m s'^) Eg= 17à25kJ moM Sensible au mercure Gating possible

Figure I.2.:Principales caractéristiques du flux d’eau au travers d’une bicouche lipidique et comparaison avec le flux d’eau au travers d’une membrane biologique incluant des canaux à eaux (Tyerman et al., 1999).

I. Introduction

OÙ R représente la constante des gaz parfaits, T représente la température absolue et Vw représente le volume partiel molaire de l’eau. Pf, la perméabilité osmotique à l’eau, décrit le mouvement d’eau en réponse à un gradient de pression hydrostatique ou osmotique.

Expérimentalement, Pf est mesuré après imposition d’un gradient de concentration en soluté entre les deux compartiments. Il est cependant possible de déterminer la perméabilité hydrique membranaire en l’absence de tout gradient hydrostatique ou osmotique. A cette fin, une partie du volume aqueux dans un compartiment est remplaçé par un volume équivalent d’eau lourde ou radioactive (DHO, THO ou H2O ). Au cours du temps, une partie des molécules d’eau radioactive passe de manière passive dans l’autre compartiment (Verkman, 2000 ; Finkelstein, 1989). Le coefficient de perméabilité diffusionnelle membranaire, Pd, est défini comme étant la vitesse de transport de l’eau radioactive au travers de la membrane en l’absence de gradient osmotique ou hydrostatique

Pd = / (A. ACw*) (cm/s)

où <t>w* représente le flux d’eau lourde ou radioactive et ACw* représente la différence de concentration en eau lourde ou radioactive entre les deux compartiments.

Pf et Pd sont des propriétés intrinsèques de toute membrane. Le calcul du rapport Pf / Pd permet de cerner la nature des mécanismes biophysiques impliqués dans le transport d’eau.

Un rapport supérieur à un est obtenu lorsque le transport d’eau est médié par un canal à eau.

Un rapport égal à un est obtenu lorsque les molécules d’eau diffusent au travers de la bicouche lipidique (Ye et Verkman, 1989). En effet, en l’absence de pore aqueux, la barrière énergétique à franchir lors du passage d’une molécule d’eau d’un compartiment à l’autre est plus importante. En conséquence, le flux volumique d’eau au travers d’une membrane ne contenant pas de pores aqueux est faible. Dans ce cas, l’energie d’activation d’Arrhenius (Ea) est également élevée (> 60 kJ.mof') alors que le mécanisme de transport au travers d’un pore aqueux est caractérisé par une énergie d’activation faible (<25 kJ.mof ') (Figure 1.2.). De plus, la présence d’un transporteur d’eau de nature protéique peut être suspectée si Pf est significativement modifié par l’ajout de dérivés du mercure (Tyerman et ai, 1999).

3

/. Introduction

1.2. Découverte des canaux à eau.

L’existence de protéines perméables à l’eau a été suggérée de longue date (Ray, 1960 ; Dainty, 1963). Néanmoins, l’hypothèse d’une diffusion simple au travers de la bicouche lipidique a été longtemps privilégiée. La grande variabilité de perméabilité osmotique mesurée pour différents types cellulaires (de 6,59.10'^ à 2,4.10"^ cm.sec'*) (voir Maurel, 1997a) pouvait être expliquée par la grande variabilité de la composition lipidique des membranes (Stadelman et Lee-Stadelman, 1989). La valeur proche de l’unité du rapport Pf/Pd mesuré sur les cellules de Valonia et surtout la faible valeur mesurée de Pf (2,4.10'^

cm.sec'') suggéraient également l’absence de pore aqueux dans la membrane (Gutknecht, 1967). L’étude des propriétés de transport d’eau des cellules intemodales géantes des Characeae a cependant apporté des indices probants en faveur de l’existence de pores protéiques aqueux. En condition d’osmose transcellulaire, la perméabilité osmotique de la membrane plasmique des cellules de Characeae adopte une valeur élevée (environ 10' ‘y cm.sec'') (Kamiya et Tazawa, 1956). Dans ce type d’expérience, les deux extrémités d’une cellule sont mises en contact avec des milieux d’osmolarité différente. En conséquence, un flux d’eau transcellulaire est généré depuis le compartiment le moins concentré vers le compartiment le plus concentré. La mesure du flux d’eau permet alors le calcul de Pf. Par ailleurs, l’energie d’activation du mouvement d’eau chez Chara corallina (Kiyosawa, 1975), Nitella flexilis (Tazawa et Kamiya, 1966) et Nitellopsis obtusa (Wayne et Tazawa, 1988), comprise entre 17 et 25 kJ.mof', n’est pas significativement différente de l’energie d’activation du phénomène de diffusion simple de l’eau en solution (Kohn, 1965). Les travaux de Wayne et Tazawa (1990) ont démontré que la perméabilité osmotique à l’eau de cellules intemodales de Nitellopsis est inhibée de 25 à 30 % après ajout d’un inhibiteur métabolique capable de se lier au groupements sulfhydryles des protéines, le para- chloromercuribenzenesulfonate (pCMBS). Ces résultats impliquent donc l’existence d’une protéine membranaire impliquée dans le transport de l’eau chez les Characeae. Cette protéine n’a pas été identifiée. Néanmoins, d’autres membranes biologiques présentent les mêmes caractéristiques -en terme de perméabilité hydrique- que celles des Characeae.

C’est le cas de la membrane érythrocytaire, au sein de laquelle le premier canal à eau (ou aquaporine) a été identifié et caractérisé. Il s’agit de la protéine CHIP 28 (actuellement rebaptisée AQP-1, pour aquaporine-1) (Preston et ai, 1992). Chez les végétaux, une

4

/. Introduction

activité spécifique de transport d’eau par l’aquaporine tonoplastique y-TIP a été démontrée pour la première fois en 1993 (Maurel et al, 1993). Depuis leur découverte, plus de 200 aquaporines ont été identifiées chez les procaryotes, les plantes et les animaux. Leur rôle majeur dans le transport d’eau transmembranaire a été largement confirmé.

Les aquaporines ne sont cependant pas responsable de la totalité du transport d’eau transmembranaire. En fait, tous les transporteurs transmembranaires possèdent une perméabilité hydrique non-nulle (Maurel et al, 1997a). Une activité de transport d’eau a ainsi été mise en évidence dans le cas de cotransporteurs et de canaux ioniques. Le cotransporteur de Na’^-glucose GATl de l’intestin humain transporte de 65 à 85 molécules d’eau par molécule de soluté (Loo et al, 1999). Chez les plantes, le canal à du tonoplaste des cellules intemodales de Chara transporte au moins 29 molécules d’eau par ion potassium (Homblé et Véry, 1992). Néanmoins, la perméabilité hydrique unitaire de ces transporteurs est au moins vingt fois plus faible que celles des aquaporines (Maurel, 1997a ; Zeuthen, 2000) et ne permet pas d’expliquer les flux d’eau importants observés au niveau de nombreuses membranes biologiques.

1.2.1. Le CHIP28 (AQP-1) de la membrane du globule rouge humain.

Certains systèmes membranaires sont remarquablement perméables à l’eau. Chez l’homme, c’est notamment le cas des membranes des cellules épithéliales des tubules rénaux ou de la membrane des érythrocytes. Ceci a mené à l’hypothèse de la présence de pores de nature protéique au sein de ce type de membrane (Sidel et Salomon, 1957). La première confirmation expérimentale de l’existence d’une composante protéique impliquée dans le mécanisme de transport de l’eau dans la membrane érythrocytaire a été obtenue sur base d’une observation accidentelle. En effet, durant la caractérisation des antigènes majeurs impliqués dans la définition des groupes sanguins Rh de l’érythrocyte, une procédure d’isolement d’un polypeptide de 32 kDa a été développée. Cette préparation contenait une protéine contaminante de 28 kDa. Des anticorps préparés contre cette protéine ont permis de démontrer que la protéine de 28 kDa ne provenait pas de la dégradation protéolytique de l’antigène Rh de 32 kDa (Denker et al., 1988). Cette protéine est très abondante dans la membrane érythrocytaire (~ 160 000 copies par érythrocyte). La caractérisation de cette protéine a montré qu’il s’agit d’une protéine intégrale, qui a été appelée CHIP28 (pour

5

N42 polylactos- aminoglycan

Figure 1.3.:Topologie membranaire du monomère d’AQP-1. Les séquences signatures Asn-Pro-AIa sont indiqués en noir (NPA). Les zones ombrées présentent les deux hémiprotéines en orientation inverse (Repeat-1 et Repeat-2). Les sites de N-glycosylation ainsi que les résidus impliqués dans le polymorphisme de surface (Colton polymorphism) sont également représentées. (Borgnia, 2000).

I. Introduction

« çhannel-like intégral grotéine of 28 kDa ») (Figure 1.3.)- La protéine est présente sous forme non-glysosylée, mais également sous forme N-glycosylée. Le rapport entre les formes non-glycosylées et glycosylées a été estimé à 3:1 (Denker et al, 1988 ; Smith et Agre, 1991). D’autres travaux suggèrent un rapport 1:1 et caractérisent la glycosylation de CHIP28 : il s’agit d’un motif polylactosaminyl de 5,4 kDa greffé sur le résidu Asp-42 (Van Hoek et al, 1995). La glycosylation de CHIP28 ne montre aucune influence sur la fonction ou l’adressage vers la membrane de cette protéine (Zhang et al, 1993 ; Van Hoek et al, 1995). La fonction de CHIP 28 a été démontrée par la technique, devenue classique, des ovocytes de xénope. Le cRNA (ou mRNA) codant pour la protéine CHIP 28 est injectée dans l’ovocyte. Le CHIP 28 est alors exprimé dans la membrane des ovocytes. Preston et collaborateurs (1992) ont montré que les ovocytes exprimant CHIP 28 présentaient une vitesse de gonflement 20 fois supérieurs aux ovocytes contrôles lorsqu’ils sont transférés dans un milieu hypotonique. Cette augmentation de la vitesse de gonflement est inhibée par ajout de HgCl2, un inhibiteur des transporteurs d’eau, ce qui indique que CHIP 28 est responsable de l’augmentation de la perméabilité osmotique des ovocytes. De plus, l’expression de CHIP 28 ne conduit pas à l’augmentation de la perméabilité ionique de la membrane des ovocytes, ce qui suggère la spécificité du transport de l’eau (Preston et al,

1992). En outre, le processus de transport passif est caractérisé par une faible énergie d’activation (5 kcal.mof'). Ces résultats ont trouvé une autre confirmation expérimentale lorsque la perméabilité osmotique à l’eau de protéoliposomes contenant CHIP 28 a été mesurée (Zeidel et al, 1992). Le nom «aquaporine» a été proposé sur base de la spécificité du transport de l’eau, et CHIP 28 est à l’heure actuelle appelé AQP-1 (aquaporin-1) (Agre et al, 1993).

1.2.2. Classification des aquaporines.

La séquence N-terminale de CHIP 28 (AQP-1) a révélé une forte homologie avec la protéine intrinsèque majeure du cristallin MIP26 (Gorin et al, 1984), et dans une moindre mesure avec la protéine Big Brain de drosophile (Rao et al, 1990), la noduline 26 (Fortin et al, 1987) et avec le transporteur de glycérol d’Escherichia coli (Muramatsu et Mizuno, 1989). Sur base de leur homologie de séquence, ces protéines ont été regroupées au sein de la famille des protéines MIP (en référence à MIP26, le premier membre séquençé) (Pao et

6

Alveolar Airspace

H,0

Basement

Membrane Capillary

Respiratory Airspace

Goblet Cell

AQP4^

Surlace Layer AQP5

/ Pi

Basement Membrane

conjunctiva

AQP1 Capillary

Secretory Gland

AQP3

Basement Membrane

AQP1

nonpigmented epithelium

(ciliaiy and iris)

lens epithelium corneal endothélium trabecular meshwork

AQP3

AQP5

corneal epithelium lacrimal gland

AQP4 retinal glia (Mûller celte)

Fieure 1.4. : Représentation schématique montrant la localisation de multiples aquaporines dans des tissus complexes chez les mammifères. (A) Alvéole pulmonaire, (B) Bronche, (C) glande de sécertion et (D) oeil.

(King et al., 2000)

I. Introduction

al, 1991 ; Reizer et al, 1993). Les protéines MIP sont caractérisées par la présence de six à huit domaines transmembranaires et par une masse moléculaire comprise entre 25 et 34 kDa. Cette famille comprend aujourd’hui plus de 200 membres identifiés chez les animaux, les plantes et les procaryotes (Verkman et Mitra, 2000 ; Johansson et al, 2000 ; Borgnia et al, 1999).

1.2.2.1. Classification des aquaporines humaines.

Après la caractérisation fonctionnelle de AQP-1, les méthodes de clonage des gènes par homologie ont rapidement permis d’identifier d’autres membres de la famille des aquaporines chez l’homme. La méthode la plus fréquente utilise une procédure d’amplification par PCR (polymerase chain reaction) à partir d’amorces oligonucléotidiques dégénérées (Agre et al, 1999). A l’heure actuelle, 10 gènes codant pour des aquaporines ont été clonés chez l’homme (Borgnia et al, 2000). L’identité de séquence en acides aminés entre les aquaporines humaines varie entre 19 et 52 % (Verkman et Mitra, 2000). Deux groupes distincts peuvent être distingués au sein de la famille des aquaporines humaines : d’une part, les aquaporines strictes qui ne transportent que l’eau (AQP-1, AQP-2, AQP-4, AQP-5, AQP-6 et AQP-8) et d’autre part, les aquaglycéroporines qui sont capable de transporter à la fois l’eau et des petites molécules non-chargées comme le glycérol (AQP-3, AQP-7 et AQP-9). Les aquaporines connues à l’heure actuelle sont toutes synthétisées de manière constitutives et adressées vers la membrane plasmique. La distribution tissulaire des aquaporines est complexe et de nombreux organes sont le siège de l’expression conjointe de plusieurs aquaporines. A titre d’exemple, six aquaporines sont coexprimées dans les reins (Knepper et al, 1996).

Les sites d’expression des aquaporines humaines sont repris ci-après :

• AQP-0 est localisée dans la membrane plasmique des cellules fibreuses du cristallin (Fortin et al, 1984 ; Bok et al, 1982) (chronologiquement, AQP-0 constitue le premier membre identifié de la classe des aquaporines, mais sa fonction n’a été étudiée que plus tardivement).

• AQP-1 est insérée dans la membrane plasmique des érythrocytes. Elle est également très abondante dans le rein, et plus précisément dans la membrane apicale des bordures en brosse des tubules proximaux et des branches descendantes des anses de Henlé

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Animal aquaporins

Qlycaroi facïlitators and aqaa<My««nip4>nBs

Figure [.5.:Arbre phylogénique de 41 protéines apprtenant à la famille MIP. Le facilitateur du glycérol d’£. coli (Ec-GlpF) et de la levure (Sc-Fpsl) transportent le glycérol, tandis que les aquaglycéroporines humaines AQP-3, AQP-7 et AQP-9 transportent à la fois le glycérol et l’eau. La nodulin-26 du soja, NOD26, appartient au groupe des NIPs (ou NLMs). Par contre, Nt-AQPl et Nt-TIPa qui sont perméables au glycérol et à d’autres solutés non-chargés ainsi qu’à l’eau sont classées parmi les PIPs et les TIPs respectivement. Ceci montre que la séquence d’une aquaporine n’est pas suffisante pour déterminer sa localisation intracellulaire. Les autres protéines MIP sont soit des aquaporines ou soit des protéines dont la spécificité n’est pas connue. At, Arabidospsis thaliana, Cv, Cicadella viridis, Ec, Escherichia coli, Gm, Glycine max, Hs, Homo sapiens, Nt, Nicotiana, tabacum, Pv, Phaseoltis vulgaris, Rn, Rattus norvégiens, Sc, Saccharomyces cerevisiae, So, Spinacia oleracea. (Johansson et al., 2000)

I. Introduction

(Smith et al, 1993). AQP-1 a également été détectée au niveau de l’épithélium des capillaires sanguins, ainsi que dans l’oeil (Figure 1.4.).

• AQP-2 a été identifié grâce à l’homologie du gène avec celui d’AQP-1 (Fushimi et al, 1993). Cette isoforme est localisée dans les cellules principales des canaux collecteurs du rein.

• Le gène codant pour AQP-3 a été cloné à partir de cRNA de rat (Echevarria et al, 1994 ; Ishibashi et al, 1994 ; Ma et al, 1994) et est exprimée dans le compartiement baso-latéral de la membrane plasmique des cellules épithéliales des canaux collecteurs.

L’expression de AQP-3 dans la trachée, l’oeil, le colon et les cellules de l’épendyme du cerveau a également été rapportée (Frigeri et al, 1995).

• AQP-4 montre une expression baso-latérale dans la membrane plasmique des cellules épithéliales au niveau des canaux collecteurs du rein. AQP-4 est également exprimée dans le cerveau (Jung et al, 1994) et le poumon (Hsegawa et al, 1994).

• AQP-5 est exprimée dans la membrane plasmique apicale des cellules des acini au niveau des glandes salivaires et lacrimales (Raina et al, 1995 ; He et al, 1997). AQP-5 est également exprimée dans le poumon (Raina et al, 1995) et la cochlée (Mhatre et al,

1999).

• Le gène codant pour AQP-6 a été cloné à partir de tissu rénal (Ma et al, 1996).

• AQP-7 et AQP-8 sont exprimées dans les testicules (Ishibashi et al, 1997a, 1997b).

• AQP-9 est exprimée dans le foie, les poumons et la moelle osseuse (Tsukaguchi et al, 1999).

1.2.2.2. Classification des aquaporines végétales.

Les aquaporines végétales possèdent des isoformes insérées dans la membrane plasmique, les PIPs (pour Plasma membrane Intrinsic Proteins) et des isoformes tonoplastiques, les TIPs (pour Tonoplast Intrinsic Proteins) (Figure I.5.). L’existence d’isoformes membranaires et tonoplastiques a été démontrée par immunocytochimie (Hôfte et al, 1992 ; Johnson et al, 1990 ; Kaldenhof et al, 1995) et immunodétection sur des organites ou fractions membranaires purifiées (Daniels et al, 1994 ; Kaldenhof et al, 1995 ; Kammerloher et al, 1994 ; Maeshima et al, 1994). Les TlPs et PlPs forment deux groupes phylogéniques distincts (Johansson et al, 2000), mais leur localisation intracellulaire ne

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HydrophobicitéHydrophobicité

AQP-1 {Homo sapiens) Alpha-TIP {Phaseolus vulgahs)

GlpF {Eschenchia coli) Noduline-26 (Glycine max)

Figure 1.6.: Diagrammes d’hydropathie dérivés de l’algorythme de Kyte et Doolitlle réalisé sur une fenêtre de 13 acides aminés pour quatre membres de la famille MIP : 1’AQP-1, l’alpha-TlP, le GlpF et la noduline-26.

Les chiffres romains indiquent la localisation des régions hydrophobes.

I. Introduction

peut être déduite de leur séquence en acide aminés. D’une manière générale, la séquence N- terminale des PIPs qui précède le premier domaine transmembranaire est plus longue chez les PIPs que chez les TIPs. Le groupe des PIPs contient deux sous-ensembles appelés PIPI et PIP2 qui sont caractérisés par la longeur et la composition en acides aminés des extrémités C- et N-terminales. Outre les TIPs et les PIPs, il existe deux autres groupes de protéines MIP chez les végétaux : les NIPs et les SIPs. Le goupe des NIPs (pour Nodulin- like Intrinsic Proteins) comprend des protéines fortement homologues à la noduline-26 (ou NOD26) du soja, une protéine de la membrane du symbiosome. Le symbiosome est un organite cellulaire d’origine tonoplastique qui englobe les bactéries fixatrices de l’azote chez certaines légumineuses. Le symbiosome contrôle les flux métaboliques entre ces bactéries et la plante-hôte (Fortin et al, 1987 ; Rivers et al, 1997). Le quatrième et dernier groupe phylogénique comprendrait des protéines présentant une très courte boucle cytoplasmique du côté N-terminal et caractérisées par un point isoélectrique très élevé (pl proche de 10). Ces protéines font partie du groupe des SIPs (pour Small basic Intrinsic Proteins) (Johanson et Kjellbom, 2000). La localisation cellulaire et la spécificité de ces protéines n’est pas connue. La plupart des isoformes ont été identifiées par analogie avec des séquences connues et pour un grand nombre d’entre elles, leur localisation et leur activité ne sont pas connues.

Dans la plante modèle Arabidopsis thaliana, 34 gènes codant pour des protéines de la famille MIP ont été identifiés, principalement par analyse des banques EST (résultats obtenus lorsque 92 % du génome était connu). Parmi ces gènes, 13 codent pour des PIPs,

10 codent pour des TIPs, 8 pour des NIPs et 3 appartiennent au groupe des SIPs.

La première protéine végétale pour laquelle une fonction de transporteur d’eau a été démontrée par expression dans les ovocytes de xénope est le y-TIP d’Arabidopsis thaliana (Maurel et al, 1993). Une activité de transport de l’eau a notamment été démontrée pour l’a-TIP (Maurel et al, 1995), le Ô-TIP (Daniels et al, 1996), ainsi que cinq PIP (Kammerloher et al, 1994) à.'Arabidopsis thaliana, le ZmTIPl de Zea mais (Chaumont et al, 1998), MipA et MipB de Mesenbryanthemum crystallinum (Yamada et al, 1995). La noduline 26 de la membrane du symbiosome de Glycine max (Rivers et al, 1997) et le Nt- TIP du tabac (Gerbeau et al, 1999) transportent à la fois l’eau et des solutés de taille réduite (urée, glycérol, formamide).

9

hemipore-l hemlpore-2

Figure 1.7. : Modèle en sablier (Hourglass model) de la topologie membranaire de l’AQP-1. Chaque monomère est constitué de 6 hélices transmembranaires (numérotées de 1 à 6) formant deux hémipores en orientation inverse dans la membrane. Les deux motifs NPA, portés par les boucles B et E, se juxtaposent dans la cavité dessinée par les hélices transmembranaires, de manière à délimiter le pore aqueux (le sablier). Le résidu sensible au mercure (Cys-189) est représenté en rouge. (Jung et al., 1994).

FigureljS.: Structure tridimensioimelle de l’aquaporine-1 (AQP-1) de Homo sapiens à une résolution de 6 Â.

Les images ont été obtenues par cryo- microscopie électronique sur des cristaux bidimensionnels d’AQP-1.

Les images montrent le monomère d’AQP-1 depuis a, la face extracellulaire et b, après une rotation de 45°

autour de l’axe x. c, image du monomère après une seconde rotation de 45° et d, vue de la constriction centrale (x). Les hélices transmembranaires sont numérotiées de 1 à 6 (Walz étal., 1997)

I. Introduction

1.3. Structure des aquaporines.

Toutes les isoformes d’aquaporine connues à ce jour possèdent une masse moléculaire comprise entre 26 et 34 kDa. Bien que l’identité de séquence entre ces formes soit parfois relativement faible (moins de 25 %), tous les membres de la famille des aquaporines partage plusieurs caractéristiques structurales communes. Les diagrammes d’hydropathie dérivés de l’algorithme de Kyte et Doolittle suggèrent toujours la présence de 6 à 7 domaines non-polaires suffisamment long pour former des domaines transmembranaires (Figure I.6.). La présence de 6 hélices transmembranaires a été confirmée par des travaux utilisant la mutagenése dirigée ou des anticorps site-spécifiques (Preston et al., 1994 ; Skach et al., 1994 ; Shi et al., 1995). Ces travaux ont également permis d’établir que les extrémités N- et C-terminale de la protéine se trouvent du même côté de la membrane. De plus, les analyses de structure primaire ont montré qu’il existe une analogie entre la moitié C-terminale et la moitié N-terminale des aquaporines. Ces deux hémiprotéines sont orientées de manière inverse dans la membrane. Cette observation a mené à la formulation de l’hypothèse selon laquelle la structure actuelle est le résultat d’une duplication inverse d’un gène ancestral (Reizer et al., 1993). Cet évènement a dû avoir lieu très tôt dans révolution, puisque les aquaporines animales, végétales et bactériennes présentent une organisation moléculaire comparable.

Des alignements de séquence ont permis de mettre en évidence l’existence de régions fortement homologues et de motifs hautement conservés. C’est le cas du motif SGx(S/A/C)xNPA(V/R)(T/S) qui est connu sous le nom de « boîte NPA » (Reizer et al.,

1993 ; Schâffner, 1998). Ce motif est présent en double exemplaire dans la séquence en acides aminés. Les boites NPA sont situées sur deux boucles extramembranaires localisées de part et d’autre de la membrane. Ces deux boucles présentent un caractère partiellement hydrophobe et pourraient interagir avec la membrane. Des expériences de mutagenése dirigée réalisées dans ces deux boucles et particulièrement au niveau des boites NPA ont permis d’établir leur importance dans le maintien de la fonction de transport (Jung et al.,

1994). De plus, le site d’inhibition du transport par le HgCb chez AQP-1, constitué par le résidu Cysl89 (Preston et al., 1993 ; Zhang et ai, 1993), est situé à deux résidus en amont d’un des motifs NPA (Figure I.3.). La mutation de Cysl89 en un résidu Ala empêche cette inhibition (Preston et ai, 1993). Il a été proposé que l’inhibition du transport soit une

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A C

Fi2ure I.9.:Modèle structural de l’aquaporine-1 (AQP-1) de Homo sapiens à une résolution de 3.8 Â. Cette représentation montre les six hélices transmembranaires (H1 à H6), les deux courtes hélices du pore (HB et HE), et les boucles reliant ces héüces en différentes couleurs. A, vue du monomère depuis la surface extracellulaire. B, vue de côté, C, modèle cylindrique du tétramère depuis la face extracellulaire, D, vue de côté du tétramère (Murata et al., 2000).

I. Introduction

conséquence de l’occlusion du pore par un atome de mercure (Preston et al, 1993). D’une manière générale, ces résultats suggèrent que les deux boucles portant les boites NPA participent directement à la fonction de transport des aquaporines et sont impliquées dans l’architecture moléculaire du pore aqueux.

La technique de cryo-microscopie électronique a permis d’obtenir les premières images à basse résolution d’AQP-1. Ces travaux ont permis de confirmer la nature tétramérique d’AQP-1 qui apparaît sur les images comme un assemblage intramembranaire dont le diamètre est estimé à 8,5 nm (Verbavatz et al, 1993). Par la suite, les premières informations relatives à la structure secondaire des aquaporines ont été obtenues par des techniques spectroscopiques. L’utilisation du dichroisme circulaire et de la spectroscopie infrarouge par Transformée de Fourier ont permis d’estimer le contenu en hélices a et feuillet P à 38-40 % et 40-43 % respectivement (Van Hoek et al, 1993). Des études postérieures utilisant les mêmes techniques ont confirmé la présence d’une forte proportion en hélice a (36-48 %) (Haris et al, 1994 ; Cabiaux et al, 1997). Ces travaux ont conduit à l’élaboration d’un premier modèle topologique pour les aquaporines, appelé modèle en sablier (hourglass model) (Figure I.7.). Ce modèle décrit l’existence d’interaction entre une boucle cytoplasmique et une boucle extracytoplasmique qui s’insèrent de part et d’autre de la bicouche pour former un domaine transmembranaire additionnel (Jung et al, 1994). Ce domaine forme le pore aqueux et les molécules d’eau le traversent en file simple.

La structure à moyenne résolution (6 Â) de cristaux 2-D d’AQP-1 obtenue par cryo- microscopie éléctronique montre que la protéine adopte une structure en tonneau formée par les six hélices transmembranaires (Figure 1.8.). Ces hélices adoptent une inclinaison de

~ 20° par rapport à la normale à la bicouche (Cheng et al, 1997 ; Cabiaux et al, 1997). Le tonneau entoure une zone de densité éléctronique élevée. Cette constriction centrale est formée par les deux boucles portant les motifs NPA qui pénètrent profondément dans le tonneau et délimitent le pore (Cheng et al, 1997 ; Walz et al, 1997). Chacune de ces boucles adopte une structure plus complexe comprenant une courte hélice (appelées HB et HF, Figure 1.9. et 1.10.)(Mitsuoka et al, 1999). Le premier modèle à l’échelle atomique, élaboré à partir de dormées cristallographiques à 3,8 Â, a été publié récemment (Murata et al, 2000). Ce modèle apporte de nouvelles précisions sur la topologie du pore aqueux (Figure 1.9.): les deux motifs NPA se croisent selon un angle proche de 90° au niveau de la région la plus étroite du pore. Le diamètre du pore à cet endroit (3 Â) est à

11

b

Figure 1.10.: Diagrammes représentant la structure du pore aqueux de AQP-1. a, section parallèle à la membrane à travers le centre du monomère d’AQP-1 montrant la constriction centrale du pore. b,même vue que a, mais représentant l’encombrement stérique des atomes et montrant le diamètre du pore, c, section du centre du monomère dans un plan parallèle à la normale à la membrane (perpendiculaire à la vue représentée en a), d, même vue que c en représentation stérique montrant la constriction du pore. Les chaines latérales situées vers l’intérieur du pore sont représentées : les chaines latérales hydrophobes au niveau de la constriction sont représentées en jaune ; Asn 76 et Asn 192 sont représentés en rouge ; la cystéine 189 est représentée en vert et His 180 en bleu. (Murata et al., 2000).

I. Introduction

peine plus grand que celui d’une molécule d’eau (2,8 Â), ce qui exclut le passage de tout ion solvaté (Figure I.IO.). Le pore aqueux est caractérisé par une structure amphipathique qui permet le transport rapide des molécules d’eau. Lorsqu’elle atteint la constriction centrale, la molécule d’eau forme des liens H avec les chaînes latérales de Asn 76 et Asn 192 (Figure 1.10.), ce qui pourrait rompre la chaîne de liens H entre les molécules d’eau disposées en file simple dans le pore et empêcher le passage des protons au travers du canal par propagation le long de cette colonne de liens H.

La structure du transporteur de glycérol d'Escherichia coli, GlpF, déterminée à 2,2 Â, présente une organisation similaire, avec une constriction centrale de ~3,5 Â de diamètre.

Le pore présente également une structure amphipathique qui permet d’expliquer la sélectivité du canal (Fu et al, 2000).

1.4. Régulation de l’expression et de la fonction des aquaporines.

La régulation de l’activité des aquaporines peut s’effectuer de plusieurs manières différentes : une régulation transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle.

1.4.1. Régulation transcriptionnelle.

Chez les végétaux, la régulation de l’expression des gènes intervient, entre autre, en réponse à l’apparition d'un stress. Au niveau génomique, il a été démontré que plusieurs gènes codant pour des aquaporines peuvent être induits ou réprimés par la dessication.

Ainsi, si le niveau de transcrit du gène codant pour la protéine RD28 est presque indétectable dans les conditions non-stressantes, son niveau d'expression augmente considérablement après exposition à un stress hydrique ou salin (Yamaguchi-Shinozaki et al, 1992). A contrario, l'expression des formes MipA et MipB de Mesenbryanthemum crystallinum est fortement stimulée durant les périodes non-stressantes et l'exposition à un stress osmotique mène à une réduction de l'abondance des produits de transcription. A l’heure actuelle, la signification physiologique de l’induction de gènes codant pour des aquaporines durant les situations de stress hydrique n’est pas connue. L’expression d’aquaporines pourrait permettre l’ajustement des flux transmembranaires d’eau vers les

12

I. Introduction

divers organes de la plante durant la phase de déficit hydrique ou permettre la réhydratation rapide des tissus après leur déshydratation (Maurel, 1997a et 1997b).

D'autres signaux sont capables de réguler l'expression de gènes codant pour des aquaporines. La lumière induit l'expression des gènes VM23 codant pour des protéines du groupe des TIPs dans les racines et cotylédons et induit sa suppression dans l'hypocotyle des jeunes pousses de Raphanus (Higuchi et al., 1998). L’expression du y-TIP d'Arabidopsis est stimulée par l’hormone de type gibbérelline GA3 chez un mutant caractérisé par une concentration faible en gibbérélines endogènes (Philips et Huttly, 1994).

L’application de GA3 chez ce mutant induit l’élongation et la division cellulaire des cellules de la tige (Philips et Huttly, 1994). Par ailleurs, TobRB7 est exprimée dans les tissus méristématiques des racines de tabac et cette expression est stimulée par les attaques de nématode. L’expression du gène codant pour SunTIP7, une aquaporine tonoplastique exprimée dans les cellules de guarde des stomates, montre une variation d’expression circadienne avec un pic d’expression vers midi et un minimum de transcription à l’aube et au coucher du soleil. Ce profil peut être corrélé à la variation d’ouverture/fermeture des stomates. Le gène SunTIP20, très similaire dans sa séquence et son site d’expression dans la plante, ne montre pourtant aucune variation d’expression ni aucune régulation en cas de déficit hydrique.

Si certaines aquaporines sont exprimées en réponse à un stimulus extérieur, la plupart semblent exprimées de manière constitutive. Dans ce cas, le profil d’expression semble dépendre du type cellulaire et être régulée par un facteur développemental (Eckert et al, 1999). Ainsi, plusieurs isoformes sont exprimées dans les zones méristématiques ou dans des régions en croissance dans lesquelles la taille des cellules augmente. La croissance cellulaire implique généralement un influx important d’eau provoqué par l’augmentation du potentiel osmotique intracellulaire. Au niveau histologique, les cellules en croissance sont caractérisés par la présence d’une large vacuole. Cet organite joue un rôle prépondérant dans la régulation fine du potentiel osmotique (Marty, 1999). Des aquaporines sont présentes dans la membrane vacuolaire des cellules en croissance. C’est le cas du y-TIP d’Arabidopsis (Ludevid et ai, 1992) et du maïs (Barrieu et ai, 1998) ou du Ô-TIP de l’épinard (Karlsson et ai, 2000). D’autres organes de la plante sont le siège de mouvements d’eau importants et représentent donc des sites potentiels d’expression d’aquaporines. Par exemple, les tissus directement adjacents au cylindre vasculaire et qui participent au

13

i

A

. T

M

Figure 1.11 ■ : Immunolocalisation d’AQP-2 dans les cellules principales de canaux collecteurs de rats perfusés en présence (A) ou en l’absence de vasopressine (B) à l’aide d’anticorps anti-AQP-2 marqués par des billes d’or. Lors d’une stimulation par la vasopressine, la population intracellulaire d’AQP-2 (>) est phosphorylée et dirigée vers la membrane plasmique ( i ). (Agre et ai, 1998).

/. Introduction

« chargement » en eau des vaisseaux du xylème. La composition et la concentration en soluté de la sève est par ailleurs contrôlée par les cellules compagnes du phloème. Au niveau de l’endoderme des racines, le dépôt massif de subérine (imperméable à l’eau) forme une barrière physique au passage d’eau par voie apoplastique vers la stèle vasculaire (Esau, 1977). La perméabilité hydrique de l’endoderme augmente vers l’extrémité de la racine (Frensch et ai, 1996) ce qui suggère la présence de transporteurs d’eau à ce niveau.

La présence hypothétique d’aquaporine est suggérée par l’expression d’ARNs codant pour des aquaporines dans ces organes de la plante. ZmTIPl, une aquaporine tonoplastique du maïs, est exprimée dans la région terminale de l’endoderme des racines, dans les cellules parenchymateuses entourant le xylème des racines et des tiges et au niveau des cellules compagnes du xylème (Barrieu et al, 1998). Le profil d’expression du yTIP à'Arabidopsis, abondante dans le cylindre vasculaire des racines et tiges, est similaire à celui du ZmTIPl (Ludevid et al, 1992). De plus, MipA, une isoforme des membranes plasmiques de Mesembryanthemum crytallinum, est fortement exprimée dans l’épiderme et le xylème en voie de maturation des tissus racinaires (Yamada et al, 1995).

1.4.2. Régulation post-traductionnelle.

1.4.2.1. Chez les animaux.

L’étude des séquences en acides aminés des aquaporines indique la présence de séquences consensus de glycosylation, de phosphorylation et de sites de clivage protéolytique. Ainsi, la structure primaire de AQP-1 et AQP-2 contient un site de glycosylation sur un résidu Asp et Arg respectivement (Smith et Agre, 1991 ; Van Hoek et al, 1995 ; Fushimi et al, 1993 ; Sasaki et al, 1994). Le rôle de la glycosylation de certaines isoformes d’aquaporine reste inconnu à ce jour. Les formes glycosylées de AQP-1 et AQP-2 ne montrent aucune différence quant à leur activité ou à leur traffic intracellulaire (Baumgarten et al, 1998 ; Van hoek et al, 1995 ; Zhang et al, 1993).

Chez les mammifères, de nombreuses isoformes montrent des séquences consensus de phosphorylation par des protéines kinase de classe A ou C. Néanmoins, aucune certitude expérimentale n’existe sur l’existence d’une régulation de l’activité par la phosphorylation.

L’induction d’une conductance cationique par un processus de phosphorylation de l’AQP-1 14

/. Introduction

dépendant de l’AMP cyclique a été reportée (Yool et al, 1996), mais n’a pu être confirmée (Verkman et Yang, 1997 ; Yang et al, 1998). De même, les travaux démontrant l’effet de la phosphorylation sur l’activité de AQP-2 (Kuwahara et al, 1995) et de AQP-4 (Han et al, 1998) n’ont pas été confirmés (Lande et al, 1996; Yang et Verkman, 1997). La phosphorylation de 1’AQP-2 est néanmoins responsable de la régulation du traffic intracellulaire conduisant la protéine vers la membrane apicale. L’AQP-2 est une aquaporine qui est spécifiquement exprimée dans les cellules principales des canaux collecteurs des reins (Fushimi et al, 1993 ; Nielsen et al, 1993 : Sabolic et al, 1995). Son activité à la surface apicale des cellules est régulée par l'hormone vasopressine (Nielsen et al, 1993; Sasaki et al, 1994). En dehors de toute stimulation hormonale, l'AQP-2 est localisée dans une population de vésicules intracellulaire subapicale (Di Giovanni et al, 1994; Yamamoto et al, 1995). Après liaison de la vasopressine à son récepteur membranaire de type V2, la concentration intracellulaire en AMP cyclique augmente et entraîne l'induction d'une kinase de type PK-A (Katsura et al, 1997). Cette protéine kinase phosphoryle alors l'AQP-2 et probablement d'autres polypeptides. La partie C-terminale de AQP-2 possède plusieurs sites potentiels de phosphorylation par les PK-A (Ser-256), les PK-C (Ser-256) ou par une caseine kinase (Ser-229 et Thr-244) (Sasaki et al, 1994). In vivo, la protéine est phosphorylée uniquement sur Ser-256 (Fushimi et al, 1997). La phosphorylation de AQP-2 provoque la fusion de la population de vésicules intracellulaires avec la membrane apicale (Figure 1.11.).

1.4.2.2. Chez les végétaux.

Dans le monde végétal, les arguments en faveur d’une régulation directe de l’activité des aquaporines par la phosphorylation semblent plus convaincants. La phosphorylation de quelques isoformes végétales a été rapportée in vivo et in planta pour NOD-26, l’a-TIP et PM28A (Weaver et al, 1991 ; Johnson et Chrispeels, 1992 ; Johansson et al, 1998).

La séquence en acides aminés de la noduline-26 comprend 5 sites potentiels de phosphorylation. In vivo, la protéine est uniquement phosphorylée sur le résidu Ser-262 dans la région C-terminale (Weaver et Roberts, 1992). La noduline-26 est phosphorylée par une kinase de type CDPK (protéine kinase calcium-dépendante et calmoduline- indépendante). Après reconstitution dans une bicouche lipidique plane, la protéine montre une activité de canal ionique caractérisée par une conductance unitaire élevée (entre 1,6 et 3,1 nS) et une faible sélectivité pour les anions (Weaver et al, 1994). La phosphorylation

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Sous-Famille Domaine Domaine Domaine Variable catalytique calmoduiin-like

I

n m

IV V

vr

vu

ion» ^ Motif de

^ N-myristoylation fl Domaine

g

I

Figure 1.12.:Structure moléculaire des septs sous-familles de CDPK. Les CDPKs possèdent des sites catalytiques dont les séquences montrent une signature de type Ser/Thr kinase. Le domaine variable diffère en taille et en structure suivant la sous-famille envisagée. De nombreuses formes possèdent des motifs de myristoylation dans le domaine N-terminal. Les membres de la sous-famille IV possèdent des motifs PEST, qui peuvent être associée à un tum-over rapide la protéine. Le domaine auto-inhibiteur sépare le domaine catalytique et le(s) domaine(s) “calmoduiin-like”. Les domaines “calmodulin-like”

présentent dans la plupart des cas quatre motifs de type EF-hand impliqués dans la liaison du calcium, bien que les membres de certaines sous-familles ne possèdent qu’un nombre inférieur de séquences consensus EF-Hand (Saterlee et Sussman, 2000).

I. Introduction

du résidu Ser-262 par une kinase calcium-dépendante provoque l’apparition d’états de plus faible conductance et une augmentation de la fréquence d’ouverture/fermeture du canal aux tensions élevées (Lee et al, 1995). De plus, une augmentation du transport du malate par des vésicules de symbiosome purifiées est observée après phosphorylation (Ou Yang et al,

1991).

PM28A est une des protéines les plus abondantes dans la membrane plasmique des cellules des feuilles d'épinard (Johansson et al, 1996). Cette protéine est phosphorylée dans la région C-terminale sur le résidu Ser-274 (Johansson et al, 1998). Lorsqu'elle est exprimée dans les ovocytes de xénope, PM28A pourrait être phosphorylée sur les résidus Ser-115 et Ser-274. L'activité de transport d'eau est réduite lorsque des inhibiteurs de protéines kinases sont ajoutés, ce qui suggère une régulation positive de l'activité de PM28A par la phosphorylation. De plus, in planta, la phosphorylation du résidu Ser-274 de PM28A augmente lorsque le potentiel hydrique apoplastique augmente (Johansson et al, 1996). La phosphorylation de PM28A est un processus calcium-dépendant qui requiert des concentrations submicromolaires en calcium.

Chez le haricot, l'a-TIP est phosphorylée par une enzyme de type CDPK. La phosphorylation est également régulée par le calcium. Bien que la structure primaire de l'a- TIP contienne trois sites de phosphorylation potentiels, il semble que seul le résidu Ser-7 de la région N-terminale soit phosphorylé in vivo. L'expression de l'a-TIP dans les ovocytes de xénope provoque l'augmentation de la perméabilité osmotique à l'eau sans induire de variation dans la conductance électrique de la membrane des ovocytes (Maurel et al, 1995). De plus, l'ajout de divers agonistes de l'AMP, qui stimulent l'activité des kinases de type PKA, provoque une augmentation de l'activité de transport de l'a-TIP.

La phosphorylation des aquaporines végétales PM28A, a-TIP et noduline-26 est un processus calcium-dépendant (Johansson et al, 1996 ; Weaver et al, 1991 ; Johnson et Chrispeels, 1992). Chez les végétaux, il existe une classe de protéines kinases qui sont directement régulées par le calcium : les CDPKs. Les CDPKs sont caractérisées par la présence d'un domaine catalytique N-terminal, d’un domaine de jonction auto-inhibiteur et d'un domaine régulateur C-terminal présentant de fortes analogies de séquence avec la calmoduline (Hardie, 1999) (Figure 1.12.). La région C-terminale comprend quatre motifs

"EF-hands" (hélice-boucle-hélice). Ces motifs sont directement impliqués dans la liaison du calcium par la calmoduline (Ohki et al., 1997 ; Zhang et al, 1995, Andersson et al, 1983)

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