Détermination de la structure secondaire des TIPs par spectroscopie infrarouge en réfection

3.4.2.1. Reconstitution des TIPs dans des vésicules lipidiques.

Jusqu'ici, les reconstitutions d'aquaporines animales et végétales purifiées décrites dans la littérature ont été obtenues par la technique de dilution rapide. Elle consiste à injecter rapidement un mélange de micelles mixtes protéine-liposomes-détergent dans une solution ne contenant pas de détergent. De cette manière, le détergent se trouve dilué rapidement et sa concentration chute pour atteindre une valeur inférieure à sa concentration micellaire critique. Dans ces conditions, les protéines s’insèrent spontanément dans les liposomes et le

0.3 0.25

E

c

d

d

Figure 111.18,: Analyse de la distribution des lipides et protéines le long d’un gradient de sucrose (5 à 40 % (p/v)) après reconstitution des TIP. Les lipides ont été dosés par détection colorimétrique de la choline (courbe bleue). L’abondance relative des protéines a été déterminée par densitométrie d’un gel SDS-PAGE sur lequel ont migré des aliquots des fractions du gradient.

III. Résultats & Discussion

détergent est dispersé dans la solution sous forme de monomères. Cette procédure requiert l'emploi d'un détergent possédant une CMC élevée. Dans la majorité des cas, le détergent utilisé pour solubiliser les aquaporines est le 1-0-n-octyl-P-D-glucopyranoside (OOP). Des résultats préliminaires indiquent que les TIPs de lentille ne sont pas solubilisés par rOGP, mais la solubilisation est optimale à pH 8,5 dans le Génapol X-080. Ce détergent

T

possède une CMC de 0,13.10" mol/1, une valeur environ cent fois moins élevée que celle de l’OGP (14,5.10"^ mol/1). Nous avons donc utilisé une méthode alternative de reconstitution. La technique consiste à incuber une solution de micelles mixtes lipides- protéines-détergent en présence de billes de polystyrène (Bio-Beads SM-2). Ces billes possèdent la propriété d’adsorber les molécules de détergent en solution, ce qui conduit à une diminution de la concentration apparente en détergent dans la solution. Finalement, lorsque la concentration en détergent atteint la CMC, les protéoliposomes se forment spontanément.

Des liposomes larges unilamellaires ont été préparés par dispersion d’un film sec en solution. Leur taille a été homogénéisée par extrusion sur filtre de polycarbonate dont la taille des mailles est égale à 200 nm. La solution de liposomes est ensuite mélangée aux protéines purifiées solubilisées dans le Génapol X-080 et incubée à 4°C. Trois cycles de congélation / décongélation sont réalisés afin de favoriser l’incorporation des protéines dans la membranes des vésicules lipidiques. Ensuite, quatre cycles d’incubation des micelles mixtes ainsi formées avec des Bio-Beads sont réalisés (4° C et durant 45 minutes par cycle). Ensuite, les protéoliposomes sont récupérés et concentrés par ultracentrifugation. L’efficacité de la reconstitution est confirmée par ultracentrifugation des protéoliposomes sur gradient de sucrose. En effet, comme le montre la Figure III. 18., les lipides et protéines comigrent dans le gradient.

3.4.2.2. Détermination de la structure secondaire des TIPs.

Les spectres infrarouge ont été obtenus après étalement de la solution de protéoliposomes sur une plaque de germanium de manière à former un empilement de bicouches planes hydratées. La région de l’Amide I présente un pic à 1653 cm"’ attribuable à la présence de structure en hélice a, ainsi qu’un épaulement à 1627 cm"’ dans la région d’absorbance des structures en feuillet p (Figure III.17.B).

Figure III.19.; Décomposition des pics de l’amide I en Lorent2dennes par une procédure de “self- déconvolution” suivie d’un ajustement sur la courbe expérimentale. Les lorentzieimes en trait pointillé bleu, la somme des lorentziennes par la courbe bleue en trait plein. La courbe expérimentale est représentée en trait plein vert est occultée par sa superposition avec la somme des lorentziennes.

III. Résultats & Discussion

L’échantillon est ensuite soumis à un flux de D2O jusqu’au moment où la cinétique de deutération est stationnaire. Si la deutération est poursuivie, plus aucun changement significatif de la forme de l’amide I n’est enregistré . La deutération permet de distinguer la contribution des hélices a de celle des structures non-ordonnées. L’analyse du spectre après deutération est réalisée par une procédure de déconvolution de l’enveloppe Amide I après transformée de Fourier, qui permet de mettre en évidence la position des pics d’absorbance associés aux hélices a, feuillets p, tournants P et aux structures désordonnées. A chacun des composants du spectre est attribuée une Lorentzienne. Chaque Lorentzienne correspond à une composante structurale particulière (Figure III. 19). Les aires de ces Lorentziennes sont ajustées de manière a ce que leur somme reconstitue le spectre original (Figure III. 19). La surface des courbes correspondant à chaque type de structure est rapportée à la surface totale de l’Amide I afin de déterminer le pourcentage de chaque structure ayant contribué au spectre enregistré.

Nous avons également déterminé la structure secondaire des TIPs reconstitués par une méthode alternative. Les spectres non-deutérés sont normalisés dans la région de l'Amide I et comparés à une banque de spectres de protéines solubles dont la structure tridimensionnelle est connue à la résolution atomique. La comparaison de la forme de l’enveloppe Amide I permet de déterminer le pourcentage des divers types structuraux. Une autre méthode utilisant un spectre chimérique obtenu en fusionant le spectre CD (entre 190 et 260 nm) et le spectre infrarouge non-deutéré (entre 1800 et 1400 cm"') a permis d’optimiser la détermination de la structure secondaire. Les résultats obtenus par ces différentes méthodes ont été comparés entre eux et avec les résultats obtenus dans le cas de l’aquaporine-1 (Tableau III.6.). Les résultats indiquent la présence d’une forte proportion d’hélice a (38-50 %). La proportion de feuillet P semble faible (entre 13 et 18 %), mais les valeurs obtenues varient peu en fonction de la méthode de détermination utilisée.

0.45 1

Lipid v(C=0) Amide I Amide II

-0.05 -I---1---1---1---1---^---1

1800 1750 1700 1650 1600 1550 1500

Nombre d'onde (cm"^ )

Figure III.20.: Spectres ATR-FTIR polarisés des TIPs reconstituées. Les spectres ont été enregistrés avec un plan de polarisation parrallèle (//) ou perpendiculaire (J.) au plan d’incidence. Le spectre dichroïque (// - 1) représente la différence entre le spectre parrallèle et le spectre perpendiculaire. Le spectre dichroïque a été agrandi 4 fois par rapport aux spectres polarisés. Une distance de 0,1 unité d’absorbance a été introduite entre chaque spectre pour préserver la clarté du graphique.

1 2 3 4 5

Figure IH.21.: Influence de la procédure de purification sur la phosphorylation des TIPs. Autoradiographie d’un gel SDS-PAGE montrant les phosphoprotéines durant la purification des TIP phosphorylées. Pistes 1 et 2, Phosphoprotéines totales des membranes des VSP. Piste 3, culot membranaire après solubilisation dans le DOC. Piste 4, TIP pures solubilisées dans le Génapol et purifiées par chromatographie sur hydroxyapatite. Piste 5, protéoliposomes après reconstitution des TIP phosphorylées.

III. Résultats & Discussion

Méthode Type de Structure secondaire (%) données _{a P tournant}

Moindres carrés de FTIR 50 18 21

l’Amide I déconvoluée AQP-1 :48 AQP-1 : 18 AQP-1 : 21 Analyse multivariée FTIR 43

AQP-1 : 48 13 AQP-1 : 0 13 AQP-1 : 11 Analyse multivariée CD 38 14 11 Analyse multivariée CD+FTIR 47 13 13

Cristallographie (Murata et al., 2000)

AQP-1 : 50 AQP-1 : 0

Tableau III. 6. : Détermination de la structure secondaire des TIPs.

3.4.2.3. Orientation des protéines dans la bicouche lipidique.

L’orientation d’une structure secondaire donnée peut être déduite à partir de spectres FTIR- ATR enregistrés sous lumière polarisée. A cette fin, des spectres de films lipidiques contenant les deux aquaporines ont été enregistrés en utilisant des faisceaux de lumière polarisée parallèlement et perpendiculairement au plan. Les spectres perpendiculaires et parrallèle sont soustraits l’un à l’autre pour donner un spectre dichroïque (Figure III.20.). Sur le spectre dichroïque, une déviation positive de l’Amide I indique une orientation préférentielle tendant à être proche de la normale à la plaque de germanium (c’est à dire une orientation transmembranaire), tandis qu’une déviation négative de l’Amide I indique une orientation parallèle à la bicouche. Pour les aquaporines de lentille, une déviation positive est notée dans la région de l’amide I et le spectre dichroïque présente un maximum à 1658 cm''. Ce résultat suggère que les hélices a des aquaporines de lentille sont orientées perpendiculairement à la surface de la membrane lipidique. Le spectre dichroïque présente également une contribution mineure à 1629 cm''. Les structures responsables de cet épaulement ne sont pas connues.

8

A

Figure IIL22.: Spectres obtenus par CD (A) et ATR-FTIR (B) de la forme native (en noir) et de la forme phosphorylée (en rouge) des TIPs des graines de lentille.

III. Résultats & Discussion