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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Vander Borght, P. (2003). Caractérisation de la translocation du facteur d'oedème EF de B.anthracis au travers de la membrane lipidique (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Service de Structure et Fonction des Membranes Biologiques (SFMB)

Caractérisation de la translocation du facteur d’œdème EF de B, anthracis au travers de la membrane lipidique

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Scienees Patrick Vander Borght

Mars 2003

Directeurs de thèse : Dr. Véronique Cabiaux Pr. Jean-Marie Ruyssehaert

0031S0SB1

Université Libre de Bruxelles

X

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Service de Structure et Fonction des Membranes Biologiques (SFMB)

Caractérisation de la translocation du facteur d’œdème EF de B, anthracis au travers de la membrane lipidique

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Doeteur en Sciences Patrick Vander Borght

Mars 2003

Directeurs de thèse : Dr. Véronique Cabiaux

VoicOqiAje/y’achè^&nten/m/de^étudesentipunée^le^20 s^temhre' 1993, et, croye^-mcn/, pc^ mxtid'’ecu^a/coulée!KytA

i'le^ponty deputî,'ce^

^ ow/cU/

foulé' pour leu pr&mlère/ fovy Ic^ yyl du/ ocumJpu^ de/ VULB. V’ahord/ le^ candCi/' puly leu ICcereoe/ aA/eo le/ mémoire' et enfïAV, le/ ^oy morceuM/, leu thè^e/. Cette/

je/ v\/’euArctCy pety pu/ leu réalUer iuny le/ ccmcoury et Veupput dJuru

^eund/ noryCbre/ de/ penonney :

Je/ voudreity tout d/abord/ remercier Jecuv-MeirLe/ Ku^iricKaert, notre/

chef yér\jéré/, le/ ceapiteUre/ du/ LCPMI devenu/ encoury de/ route/ SfMB, de/

m/ecyoir eioceutUt euu yelvx/do ton/iiervice/.

Véronlcjae/ Ceüoieuuu o/ été/ pour mot an/ véritable/ (jutdo cuu coury do cey eurureéoy do thèio. Cey conyetly eû/nyu e\uo noy nombreu4oy diicuyitony ont toujoury été/ pour mot source/ d’vdéey et do motiveition/. Merci/ Véro ! !

(euy&ii/pourlcycoupydopCed/ecu/a.. bion/nécos/sotreydotempyervtcmJpy)

Je/ ticny eu remercier M Cchèlo Moch do Vinytttut Payteur (Pariy) aüniii/

quo VensonMo do iorv service/ (Chantai, Edith/, Mccrtine/, A^nty, fdbion/, Jean/-Lac/ et touy ley autrey) do m/’avehr acceuitU/ erv sta^ durant waa

thèie/etpour m/’avoCr fourntiony compter leytosuneydo0. arithracCy.

Paddy Wattie^ da Laboratoire/ do ChimioBColo^icfuo do VUniyersité/

do Mony-Hainxaut fait é^cdoment partie/ dey persormey quo Je/ tiervy eu remercier.

Varant ley preyquo 6 cuny paysôy aa LCPMI-SfMB, j ai ca la chance/ do rencontrer do nomhrcuyey personney qau m/’ont yyuyent aidéey quo co soit par un/coup do moXn/te<hniquo, une/dÀ

iCUS/Siion/enupar une/bonne/ sortio entre/ copainy :

Pierre/ Quortenmont (ediay « Chlef » ow « le/ chevela aasu pompey do rondo »), Christian/ Woiff (ediay « Chlef biy » ow // Le/ Lasco />) et Kieuo- Min^ (cello qui m/a précédé/ s>ur Veenthreusu) m/ont initié/ à la munipulcituyn/ dey tosUney baotérienney, leur ecs^ststanco et lear frccncho amitié/ont été/pour vnoi eysontiely àla réuli^otiOYv do cotreweUi.

Cuy (comme/ quoi on a toujoury besoin d’un play petit quo soi et,

croye/^-moi, celui-là, ceyt an dey meilloary), Vincent (an vreit paity do

iclence/), Su^fOn (eUo parlo beaucoup meiiy éüo est adoredAo et eyt

toujoury là quand on peut en eevoir besoin), Michel (ano question,

domande^-lui, d euira la réponse), Erik/ (l’homme qui a dey reiyony

infreirouge à la place dey yeasu), fàbrice (le maître incontesté/ et

incOŸ\teytable do Véle<trophysiolo^le), Abdel (dany le monde dey souriy,

on le surnomme Terminator), Carine (une autre petite dw YViômo

gabarit que Cay), florenco (la françaiso maiy bon, on y’hàbituo),

Isabelle (difficile à aborder aw début maiy vraiment trop sympa).

ScLV\dA^vvie/ (vxxytye/ voUeyeu^ie' de/ charme/ et de/ cherc/), Véro- P. (la/ fctfbUe/), Vérct Q. C la/ fée/ du/ labo-, (eidéiperyiohle/ pour charAAru d/erXre/ v\jcnMf), Nojüy

(out, dent hoYV, je/ üAéy parti/, tU/ peaj^o VoA/cnr mon/ bureoAA/), ont toxey partieÀpdd/ur\e/manière/owd/ur\e/aatye/à/ce/tra\/aÂb, je/lo{^ en/re/merde/.

Enfin/, d/y ceaAo qui ont commeneé/ en/ même/ tempy que/ wioi/ ow juyte/

un/ peu/ ccprèy. Certaény étalent déjà/ ow yynt deA/enAey de/ vérîtabley amly.

Vany Vordre/ ow le/ défOrdre/, merci donc/ à/ No (Y’o/ un/1 5 an^ d/d^ qui nowy attend/, j attendy ta/ défeme/ oA/eo impatience/), frant^ (^(yy hiéowy à/ ma/ petite/ fdleAUe/ et arrêtey de/ ytreaer), Oll(attenticm/

/ prioritéy de/

droite/ et

/ piétony, fey trop motv gary !! ), Sebr (ailay le/ paratonnerre/

comme/ Va/ iO bien/ écrit Oll, toAAraly pay dw acheter Audi), Louly (vroum a d/ eit déjà/ parW ow la/ soiation awx/ problèmey énergétiquey mctndioAAAi/), Toune/ (ten/ faéy pay, je/ viendrai encore/ te/ chercher quand/

je/ rentre/ à/ BKL), Cath/ (ohlabA/, épouser un Lufcoü), fred/ (dHwy

« Hockeyman/ »), Mica/ (dommage/ qu/on ne/ pulsiiie/ pay réproduAlre/ wn accent par écrit), Mowyy (hen oui, détait à/ 20 hcAArey Vincitation), Vinclanne/, Mathlay, fawa^, Vanayo/, Pot, Helge/, ... et à/ cew>o que/ f al oublié/.

Il/ y O/ OAAyl ley amly que/ je/ croUe/ de/ tempy erv tempy, pay as^se^

souvent à/mon goût : merclàQdow, fab. Ber, Ouïe/, PasAe/,...

MerclawfRIA pour le/soutien financier dontj alpwhénéficler.

Merci à/toi/Muriel, ma/petite/femme/chérie/. Tw étaiy présente/avant, tU/ Vey toujoury aprèy, je/ croiy que/ dest pluy difficile/ de/ vivre/ avec/

quelqu/un qui fait une/ ihése/ que/ d/en faire/ une/. Merci de/ m)avoir sopporté/ et encowra^gé/, tw la méritey tout autant que/ moi/. Merci

I à/

la/trdywKener, et oui, ço/yeyt, deytfinlUl

Merci enfin à/ ma/famille/ maly, avanttout, àmeyparentysianyqulje/

ne/seraly pay là/ oujcnArd/hAAl. Bien sîr, deytlo/formale/cLaSiSiique/; maly

Résumé

La virulence de Bacillus anthracis est caractérisée par 2 toxines sécrétées par la bactérie : la toxine oedématogène et la toxine léthale. Ces deux toxines sont constituées d’un total de 3 protéines.

L’antigène protecteur (PA83, 83 kDa) se lie à son récepteur (ATR pour Anthrax Toxin Receptor) à la surface de la cellule où il subit un clivage par la furine, ce qui a pour conséquence d’éliminer un fragment de 20 kDa et de laisser PA63 en surface de la cellule. L’élimination du fragment de 20 kDa permet à PA63 de s’oligomériser pour former des heptamères et, par ailleurs, libère en surface de chacun des monomères de PA63 un site de fixation auquel soit le facteur d’œdème (EF, 89 kDa) soit le facteur léthal (LF, 87 kDa) peuvent se fixer pour former des complexes PA63/EF ou PA63/LF. Ces complexes sont alors internalisés dans la cellule via une endocytose médiée par le récepteur. Dans l’environnement acide des endosomes, les heptamères de PA63 s’insèrent dans la membrane pour y former des pores, permettant ainsi, par un mécanisme encore peu caractérisé, la translocation de EF et LF au travers de celle-ci. Une fois dans le cytoplasme, EF et LF y exercent leur activité catalytique : EF est une adénylate cyclase calmoduline dépendante et transforme donc l’ATP en AMP cyclique tandis que LF est une zinc-métalloprotéase dont les cibles sont les MAPKK (Mitogen Activated Protein Kinase Kinase).

Le mécanisme exact par lequel s’effectue la translocation de EF/LF au travers de la membrane cible est actuellement peu caractérisé mais des études menées dans le but de mieux le comprendre ont permis de mettre en évidence une possible différence de comportement entre EF et LF après leur translocation au travers de la membrane endosomiale. En effet, des études concernant la dépendance vis-à-vis du pH ainsi que la réversibilité de l’association de EF et LF aux bicouches lipidiques ont permis de montrer que EF interagit avec une membrane lipidique tant à pFI neutre qu’à pFl acide tandis que LF n’interagit avec cette même membrane qu’à pH acide. Ceci suggère donc que, une fois la membrane endosomiale traversée et au contact du pH neutre du cytosol, EF pourrait, contrairement à LF qui serait libéré dans le cytosol, rester membranaire.

La première partie de notre travail a consisté en la localisation cellulaire de EF au moment où la protéine exerce son activité catalytique. En collaboration avec une équipe de l’Institut Pasteur (Paris), nous avons mis au point une expérience de perméabilisation sélective de la membrane plasmique des cellules au moyen d’une « pore-forming toxine » afin de séparer le contenu cytosolique soluble d’une part et le contenu membranaire ainsi que les organites cellulaires d’autre part. Cette expérience nous a permis de mettre en évidence que EF restait associé à la membrane endosomiale et était donc, au moment d’exercer son activité catalytique, une protéine membranaire.

Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la topologie membranaire de la

protéine. Mais, tout d’abord, comme il n’existait pas, jusqu’ici, d’informations quant à la possibilité

que EF traverse la membrane de vésicules lipidiques pures, nous avons évalué cette possibilité. Nous

avons pu démontrer, grâce à des expériences de marquage de ses sites catalytiques (CaM et ATP), que EF était capable, en présence de PA63, de traverser la membrane de liposomes d’asolectine. Cette translocation présente un taux d’efficacité de l’ordre de 60 % lorsque les rapports molaires PA63 : EF de 7 ; 1 ou de 7 : 3 sont utilisés. Cette méthode de reconstitution de EF dans des liposomes d’asolectine nous fournissait, dès lors, l’outil idéal pour étudier la topologie membranaire de EF.

Comme la méthode de reconstitution entraînait la formation de 2 populations de molécules de EF (60 % transloquées et 40 % nous transloquées), nous avons mis au point, dans la troisième partie de ce travail, une méthode de sélection des peptides membranaires de façon à n’étudier que la topologie des molécules correctement orientées. Cette méthode est basée sur l’utilisation de résines auxquelles sont fixés les substrats naturels de EF (CaM et ATP). Après protéolyse à la protéinase K nous avons sélectionné les peptides membranaires correspondants aux molécules de EF correctement orientées. Ces expériences nous ont permis de proposer les premières hypothèses de modèle d’interaction de EF avec une membrane lipidique. Il s’agit de modèles à 6 ou 12 segments transmembranaires.

En conclusion, ce travail nous a donc permis de montrer, pour la première fois, la translocation

de EF au travers de bicouches lipidiques et de proposer plusieurs modèles d’interaction de EF avec la

membrane.

Abréviations :

 ASD ATP CaM

cAMP ou AMPc CHO

DEPC EDTA EF HPLC Hépès kDa LF LUV PA ou PA83 PA20 PA63 PAGE PK PMSF SASD SDS STEM TNS Tris

Angstrôm, 1 Â = 10’'° m

{[2-(p-azido-saIicylamido)ethyl]dithio} propionate Adénosine-5’- Triphosphate

calmoduline

Adénosine MonoPhosphate cyclique

cellules d’ovaires de hamsters chinois (Chinese Hamster Ovary cells) diethyl pyrocarbonate

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

Edema Factor ou facteur d’œdème (adénylate cyclase de B. anthracis) High Performance Liquid Chromatography

acide (N-[2-hydroxyéthyl]pipérazine-N’-[2-éthanesulfonique]) kiloDalton

Léthal Factor ou facteur léthal de B. anthracis

Large Unilamellar Vesicles ou Grands liposomes unilamellaires Protective Antigen ou antigène protecteur de B. anthracis

fragment N-terminal de 20 kDa résultant de la protéolyse de PA83 fragment C-terminal de 63 kDa résultant de la protéolyse de PA83 Polyacrylamide Gel Electrophoresis

protéinase K

phenylmethylsulphonylfluoride

sulfosuccinimidyl 3-[[2-(p-azidosalicylamido)éthyl]dithio]propionate Sodium Dodecyl Sulfate

Scanning Transmission Emission Microscope 2 -p-toluidinyl-naphtalene- 6 -sulfonate

2-amino-2-(hydroxy méthy 1)-1,3 -porpaned iol

I. INTRODUCTION 1

1.1. La Maladie...1

1.2. La bactérie et la virulence...2

1.2.1. La bactérie...2

1.2.2. La virulence...3

1.3. Génétique, caractérisation et structure des toxines...4

1.3.1. Génétique...4

1.3.2. Caractérisation des toxines... 6

1.3.3. Structure des toxines... 6

1.3.3.1. PA83... 6

1.3.3.2. LF...7

1.3.3.3. EF... 7

1.4. Mode d’action des toxines sur la cellule... 7

1.4.1. Liaison de PA83 au récepteur cellulaire...9

1.4.1.1. Identification du récepteur...9

1.4.1.2. Domaine de PA impliqué dans la liaison au récepteur...10

1.4.2. Activation de PA83 en PA63 par protéolyse... 11

1.4.3. Liaison de LF et/ou EF à PA63... 12

1.4.3.1. Domaine d’interaction de LF avec PA63... 12

1.4.3.2. Domaine d’interaction de EF avec PA63... 14

1.4.3.3. Domaine d’interaction de PA63 avec EF/LF... 14

1.4.4. Endocytose...16

1.4.5. Translocation de LF et EF vers le cytoplasme cellulaire... 17

1.4.6. Activité catalytique des toxines... 18

1.4.6.1. Activité catalytique de EF... 18

1.4.6.1.1. Introduction... 18

1.4.6.1.2. La calmoduline... 18

1.4. 6 .1.3. Interaction de EF avec la calmoduline...19

1.4.6.1.4. Site catalytique...20

1.4.6.2. Activité catalytique de LF... 21

1.5. Translocation de EF / LF vers le cytoplasme cellulaire 24

1.5.1. Oligomérisation de PA63...24

1.5.2. Stoechiométrie du complexe PA63/EF ou PA63/LF... 25

1.5.3. Insertion de PA63 dans des membranes lipidiques...26

1.5.4. Canal formé par PA63... 27

1.5.4.1. Caractéristiques du canal... 27

1.5.4.2. Mode de formation et structure du canal formé par l’heptamère de PA63...27

1.5.4.3. Interaction de EF/LF avec le canal formé par PA63 - Rôle du canal dans le processus de translocation... 32

II. BUT DU TRAVAIL... 34

III. MATÉRIELS ET MÉTHODES... 36

111.1. Matériels... 36

111.2. Procédures expérimentales... 36

111.2.1. Purification des toxines de B. anthracis... 36

111.2.2. Préparation de grands liposomes unilamellaires d’asolectine (LUV)...37

111.2.2.1. Purification de l’asolectine...37

IV.2.2.2. Préparation des LUV... 37

111.2.3. Reconstitution de PA63 et EF dans des LUV d’asolectine... 38

111.2.4. Marquage de EF par le complexe CaM-ASD...38

111.2.5. Mesures densitométriques...39

111.2. 6 . Marquage de EF par le 5-azido-ATP (a-^^P)...40

111.2.7. Topologie membranaire de EF...40

111.2.7.1. Peptides membranaires de EF ayant une affinité pour la calmoduline... 40

111.2.7.2. Peptides membranaires de EF ayant une affinité pour l’ATP...41

111.2.7.3. Séquençage des peptides membranaires isolés... 42

IV. RÉSULTATS... 43

IV. 1. Les protéines PA83, PA63 et EF... 43

IV. 1.1. Purification de PA83 et EF... 43

IV. 1.2. La protéine PA63... 43

IV.3. Orientation de EF dans des liposomes d’asolectine... 50

IV.3.1. Site de fixation de la calmoduline...51

IV.3.1.1. Synthèse du complexe CaM-ASD...51

IV.3.1.2. Spécificité du marquage de EF par le complexe ASD-CaM... 51

IV.3.1.3. Orientation du site de fixation de la calmoduline...52

IV.3.2. Site de fixation de l’ATP... 55

IV.3.2.1. Spécificité du marquage de EF par le 5-azido-ATP (a-^^P)... 56

IV.3.2.2. Orientation du site de fixation de l’ATP... 56

IV.3.3. Discussion... 58

IV. 4. Topologie membranaire de EF reconstitué dans des LUV d’asolectine...60

IV.4.1. Cinétique de digestion des protéoliposomes contenant PA63 et EF... 61

IV.4.2. Identification des peptides membranaires de EF ayant une affinité pour la calmoduline... 61

IV.4.2.1. Conditions de fixation de EF à la résine Calmoduline...61

IV.4.2.2. Peptides membranaires de EF interagissant avec la résine CaM...62

IV.4.3. Identification des peptides membranaires de EF ayant une affinité pour l’ATP...64

IV.4.3.1. Conditions de fixation de EF à la résine ATP...64

IV.4.3.2. Peptides membranaires de EF interagissant avec la résine ATP...64

IV.4.4. Discussion... 65

V. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES...73

VI. BIBLIOGRAPHIE...77

VII. ANNEXE... 90

“Membrane topology of B. anthracis Edema factor inserted into lipid vesicles”... 90

uo||3npoj|ai

Figure 1.1. : Escarres noires typiques des cas d’anthrax cutané. Ces lésions peuvent se développer à

tout endroit du corps comme, ci-dessus, au niveau des bras ou du cou.

I. Introduction

B. anthracis est la bactérie responsable de la maladie communément appelée maladie du charbon ou anthrax. Cette maladie est connue depuis la nuit des temps. En effet, il est communément

admis que les S®”® et 6 ™^ fléaux d’Egypte décrits dans l’Exode étaient dus à l’anthrax tandis qu’au Moyen-Age, la maladie était connue sous le nom de peste noire. Aujourd’hui, l’anthrax apparaît le plus souvent chez des herbivores tels que les moutons, les chèvres, les bœufs ou les chevaux ; chez l’homme, la maladie peut survenir chez les personnes en contact avec des animaux infectés ou des tissus de ceux-ci. La maladie est donc le plus souvent observée chez des personnes exerçant des métiers tels que fermier, boucher, vétérinaire,...

Ces dernières années, l’anthrax est revenu à la une de l’actualité en raison de sa possible utilisation comme arme bactériologique.

I.l. La Maladie

L’anthrax est une maladie surtout répandue dans les régions agricoles où elle se développe chez les animaux. On la retrouve dans des régions telles que l’Amérique du Sud, l’Europe de l’Est et du sud, l’Asie, l’Afrique et le Moyen-Orient.

Les spores d’anthrax possèdent la caractéristique de pouvoir survivre dans le sol pendant plusieurs années ; les premières sources de contamination sont donc les animaux herbivores qui ingèrent ces spores. Par la suite, les humains peuvent être contaminés par simple contact avec des animaux infectés ; ce type de contamination représente plus de 95% des cas et est appelé anthrax cutané. Le microorganisme pénètre la peau au niveau d’une coupure et l’infection commence par un petit bouton qui ressemble à une piqûre d’insecte. Après un ou deux jours, le bouton grossit et se transforme en pustule purigineuse (environ 3 cm de diamètre) caractérisée par la présence de taches noires nécrotiques en son centre (Figure LL). Après 5 à 6 jours, les tissus aux alentours commencent à se nécroser et à évoluer vers une escarre noire typique. Après une dizaine de jours, environ 20% des cas non-traités entraînent la mort tandis que les autres cas guérissent spontanément. Actuellement, un traitement antimicrobien approprié permet un taux de guérison de près de 100 %.

Outre l’anthrax cutané, il existe deux autres formes d’anthrax : la première est l’anthrax

respiratoire qui résulte de l’inhalation de spores de la bactérie (entre 8000 et 50000 spores). Les spores

sont inhalées et peuvent alors se maintenir au niveau de la lumière alvéolaire pour une période

d’incubation de 1 à 43 jours ; les spores sont alors prises en charge par les macrophages alvéolaires qui

tapissent la paroi des alvéoles pulmonaires et c’est à ce moment que commence la germination des

spores ainsi que la réplication de la bactérie (Guidi-Rontani, 2002). La production de toxines par la

bactérie entraîne la lyse des macrophages, les bactéries peuvent alors se répandre dans la circulation

A B

C

Figure 1.2. : Spores et cellules végétatives de B. anthracis vus au microscope électronique (grossissement x 5400), les spores ont une forme ovale et les cellules végétatives une forme typique de bâtonnet (A). Après une aérobie prolongée, les cellules végétatives ont pratiquement toutes disparu et seuls des spores sont présents (C).

Sur la figure B, spores en cours de germination (x 50000). Le manteau du spore au centre de l’image

s’est divisé et commence à se séparer. Une cellule végétative (flèche) commence à émerger du spore

situé au bas de l’image.

sanguine et infecter l’hôte tout entier (Guidi-Rontani, 2002). Les symptômes initiaux ressemblent à ceux d’un simple rhume mais, après quelques jours, apparaissent les problèmes respiratoires tels que la congestion pulmonaire et un état de choc. L’anthrax respiratoire est fatal dans la plupart des cas.

La seconde forme est l’anthrax intestinal qui est une conséquence de la consommation de nourriture contaminée. Dans ce cas, le développement de la bactérie se déroule soit au niveau du phaiynx soit au niveau de l’intestin grêle. Les symptômes initiaux sont des nausées, une perte d’appétit, des vomissements de sang, de la fièvre, des douleurs abdominales et de la diarrhée.

L’anthrax intestinal est mortel dans 25 à 60% des cas.

Les cas d’anthrax peuvent être facilement traités par des antibiotiques tels que l’ampicilline, la tétracycline, l’érythromycine ou la pénicilline. Actuellement, le meilleur moyen de prévention consiste en une vaccination systématique des personnes susceptibles d’entrer en contact avec la bactérie ou ses spores. Le vaccin disponible est constitué de filtrat de cultures de souches de B. anthracis avirulentes de façon à maximiser la quantité d’élément immunisant et éviter la présence des facteurs toxiques.

1.2. La bactérie et la virulence 1.2.1. La bactérie

B. anthracis est une bactérie appartenant à la famille des Bacillaceae. Cette famille comprend deux principales sous-divisions : les bactéries anaérobiques sporulantes du genre Clostridium et les bactéries sporulantes aérobiques ou facultativement anaérobiques du genre Bacillus. Les cellules bactériennes du type Bacillaceae sont majoritairement Gram positif mais peuvent, pour certaines espèces, devenir Gram négatif en « vieillissant ». B. anthracis appartient au genre des Bacillus ; elle est Gram positif, encapsulée, non mobile et, dans certaines conditions, sporule. Elle a une forme de bâtonnet à bout plat de 5 à 10 pm de long et 1 à 3 pm de large (Figure 1.2).

Bacillus anthracis est une bactérie aérobe, facultativement anaérobe, capable de former des spores. La spore se forme, uniquement en présence d’oxygène, dans la partie centrale de la bactérie et a une forme ovale ou cylindrique de 1,3 à 1,5 pm de long et de 0,8 à 1 pm de large, il n’y a formation que d’une seule spore par bactérie. Les spores de B. anthracis sont constituées de différentes

« couches ». Au centre, le protoplaste porte les constituants de la future cellule végétative ainsi que de

l’acide dipicolinique qui est essentiel pour la résistance de la spore à la chaleur. Autour du protoplaste

se trouve un cortex essentiellement constitué de peptydoglycan (muréine) qui sert également à la

résistance de la spore à la chaleur et aux radiations. Enfin la spore est constituée de 3 manteaux

(interne, médian et externe) qui occupent plus de 50% du volume de la spore et qui servent de

protection à la spore face aux agressions chimiques et enzymatiques. De plus, le manteau interne, aussi

appelé membrane corticale, deviendra le « cell wall » de la nouvelle cellule végétative lorsque la spore

entrera en germination. Les spores peuvent survivre pendant des années dans le sol ou dans les

carcasses d’animaux enterrés. La germination n’aura lieu que lorsque les conditions deviennent favorables, c’est-à-dire en conditions d’anaérobie et en présence de sérum.

1.2.2. La virulence

La virulence de B. anthracis dépend, tant chez l’homme que chez l’animal, de deux facteurs : la capsule et les toxines.

La capsule : la capsule est le premier élément entrant en jeu dans la virulence de B. anthracis car elle est le premier rempart de défense de la bactérie contre le système immunitaire de l’hôte. En effet, il a été démontré que les souches possédant une capsule sont virulentes tandis que celles n’en possédant pas ne le sont pas. Cela est dû au fait que la capsule Joue un rôle essentiel dans la protection de la bactérie contre une liaison externe ou une ingestion par les macrophages de l’hôte (Keppie et al., 1963). La capsule de B. anthracis est constituée de polypeptides composés d’acide yD-glutamique (Bricas et Fromageot, 1953) ; sa formation peut être stimulée in vitro par des concentrations de 10 à 25% de CO 2 (Stephen, 1981).

Les toxines : Les premiers travaux sur l’anthrax datent du milieu du 19 ®™® siècle ; la bactérie est alors utilisée pour poser les premiers pas d’une science appelée bactériologie. Vers 1880, les travaux de Roux, Koch et Pasteur permettent la découverte d’un vaccin efficace contre la maladie du charbon qui cause de sévères dégâts tant chez les animaux que chez les hommes ; ce vaccin était constitué d’un filtrat de culture bactéries porté à un pH légèrement acide. Ce n’est qu’après la seconde guerre mondiale que des travaux ont permis de découvrir la présence, dans le filtrat de culture cellulaire, d’un élément capable d’immuniser les animaux contre l’anthrax ; les chercheurs l’appellent PA pour Protective Antigen (Gladstone, 1946).

Pendant de nombreuses années, la polémique a fait rage afin de savoir si la mort due à l’anthrax était provoquée par la production de toxines ou par la surprolifération de la bactérie. C’est alors que Smith et Keppie démontrèrent que l’injection, à des animaux sains, de plasma d’animaux infectés Induisait soit un oedème si l’injection était intradermique soit la mort si l’injection était intraveineuse. Ceci était donc la preuve que la maladie de l’anthrax était bien due à un ou plusieurs produits sécrétés (Smith et Keppie, 1954).

Suite à des études par ultracentrifugation de plasma de cobaye infecté, il fut démontré que la toxine devait être composée d’au moins deux éléments (Smith et al., 1956). En effet, Smith et al.

démontrèrent que l’injection du culot ou du surnageant obtenus par centrifugation de plasma d’animaux infectés n’avait pas d’effet s’ils étaient injectés séparément ; ceci suggérait donc l’existence d’au moins deux composants essentiels à l’activité de la toxine (Facteurs I et II), un situé dans le culot (Facteur II) et l’autre dans le surnageant (Facteur I). En 1961, des tentatives de purification par chromatographie du facteur I à partir du surnageant permirent la découverte d’un troisième facteur qui semblait être responsable de la léthalité de la toxine (Stanley et Smith, 1961).

3

C’est en 1962 que Beall et ses collaborateurs définirent une terminologie encore utilisée actuellement et qui reflète l’activité de ces différents facteurs : EF pour Edema Factor (Facteur Oedematogène cf Facteur 1), PA pour Protective Antigen (Antigène Protecteur cf Facteur II) et LF pour Léthal Factor (Facteur Léthal cf Facteur III) (Beall et al., 1962). Plus récemment, la combinaison de EF et PA a été dénommée toxine d’œdème (EdTx) ou toxine oedématogène tandis que la combinaison de LF et PA a été appelée toxine léthale (LeTx) (Friedlander et al., 1986).

Ces éléments constituant les toxines ont les propriétés suivantes :

■ Aucun des trois facteurs n’a d’effet toxique sur l’animal lorsqu’il est injecté seul

■ L’injection intradermique de PA et EF (EdTx) provoque la formation d’œdème chez l’animal

■ L’injection intraveineuse de PA et LF (LeTx) cause la mort de l’animal

■ La combinaison de EF et LF est sans effet

■ La combinaison des 3 facteurs provoque la mort et la formation d’œdème chez l’animal mais un effet synergique est observé : la présence de EF accélère la mort des animaux causée par PA et LF, tandis que LF réduit la dimension de l’œdème dû à PA et EF (Stanley et Smith,

1961)

La toxicité de B. anthracis est donc liée à deux toxines distinctes :

O

la toxine oedématogène (EdTx) qui est constituée de l’Antigène Protecteur PA et du facteur d’œdème EF et qui provoque l’œdème chez l’animal

O

la toxine léthale (LeTx) qui est constituée de l’antigène Protecteur PA et du facteur Léthal LF et qui provoque la mort de l’animal

1.3. Génétique, caractérisation et structure des toxines 1.3.1. Génétique

Les souches virulentes de B. anthracis portent deux grands plasmides extrachromosomiaux : pXOl (182 kbp) et pX02 (95 kbp) (Mikesell et al., 1983 ; Green et al., 1985 ; Uchida et al., 1985). Les deux plasmides ont été caractérisés (Kaspar et al., 1987), des cartes de restriction ont été construites et les origines de réplication ont été clonées (Uchida et al., 1987 ; Robertson et al., 1986 et 1988).

Récemment, les plasmide pXO 1 et pX02 ont été complètement séquencés (Okinaka et al., 1999) :

□ pXOl est un plasmide de 181654 paires de base parmi lesquelles 143 phases ouvertes de

lecture (ORF) ont été identifiées. Différents algorithmes ont permis de montrer que 97 de ces

ORF codent pour des protéines de fonction inconnue ; des fonctions potentielles ont pu être

assignées à 35 ORF grâce à des similarités significatives pour d’autres protéines bactériennes

et 11 ORF ont été assignées à des protéines grâce à des similarités avec d’hypothétiques

Sterne

NOVOBIOCINÊ

CAP', TOX^

Souche non virulente 43 °C

NOVOBIOCINÊ

CAP\ TOX' CAP', TOX'

Souche non virulente Souche non virulente

CAP^, TOX^

Souche virulente

43 O C

Figure 1.3, : Différents types de souches de B. anthracis pouvant être obtenues à partir de la souche sauvage suite à un traitement thermique ou par antibiotique. La virulence de B. anthracis est directement liée au phénotype des différents variants. CAP+ et CAP' sont les équivalents de pX02+ et pX02‘ et représentent les souches capables et Incapables de produire la capsule tandis que TOX+ et TOX- sont les équivalents de pXOL et pXOT et représentent les souches produisant ou non les toxines (Leppla et al.,

1991)

protéines d’autres organismes. pXOl porte, sur un îlot de pathogénicité (PAI) d’une taille de 44,8 kb, les trois gènes pag, lef et cya qui codent respectivement pour les protéines PA, LF et EF qui composent les toxines de B. anthracis.

Les îlots de pathogénicité sont des segments définis du génome qui sont fortement impliqués dans la pathogénicité de certaines espèces bactériennes. Ils peuvent coder pour des toxines, des adhésines, des invasines ou d’autres facteurs de pathogénicité. Ils sont d’origine étrangère à l’espèce bactérienne qui les contient ; on ne connaît pas leur provenance ni les mécanismes de leur transfert.

Deux éléments régulateurs des toxines, atxK et pag^ sont également situés sur ce PAL Les gènes pag et lef sont séparés de 3290 bp tandis que les gènes pag et cya sont distants de 18769 bp (Mikesell et al., 1983 ; Mock et al., 1988 ; Tippets et al., 1988 ; Escuyer et al., 1988 ; Robertson, 1988, Robertson et al., 1986 ; Ivins et al., 1986 ; Welkos et al., 1988 ; Vodkin et al., 1983 ; Bragg et al., 1989 ; Okinaka et al., 1999).

□ pX02 est un plasmide de 96231 paires de base parmi lesquelles 85 phases ouvertes de lecture (ORF) ont été identifiées. pX02 porte les gènes capk, capB et capC qui codent pour des enzymes de la capsule (Green et al., 1985 ; Uchida et al., 1985 ; Makino et al., 1988 et 1989).

acpA. , un gène régulé par atxK ainsi que par la présence de sérum et de CO 2 , est également situé sur pX02 ; ce gène active l’expression de cqpB et a un rôle essentiel, avec atxA., dans la régulation de l’expression des gènes de virulence de B. anthracis (Hoffmaster et al., 1997,

1999 a et b, Guignot et al., 1997).

Comme nous l’avons décrit précédemment au chapitre I.2.2.concernant la virulence de B.

anthracis, tant la capsule que les toxines sont nécessaires à la virulence de la bactérie. Ceci signifie donc que la présence des deux plasmides pXOl et pX02 est nécessaire pour déterminer la virulence des souches sauvages de B. anthracis. Les souches dépourvues de pXOl (pXOF) ne produisent pas de toxines et sont donc avirulentes (Ivins et al., 1986 ; Uchida et al., 1986). Ce type de souche peut être obtenu par des cultures successives à 43°C (Leppla, 1991) (Figure I.3.). De la même façon, les souches dépourvues de pX02 (pX02 ) ne produisent pas de capsule et sont au moins 10^ moins virulentes que la souche sauvage (Ivins et al., 1986 ; Welkos et al., 1988) ; cette souche (pX0U,pX02 ) est appelée souche STERNE, du nom de son découvreur Max Sterne, et servait encore il y a peu à la préparation des vaccins humains (Sterne et al., 1937). Cette souche Sterne peut être obtenue à partir de la souche sauvage en effectuant des cultures en présence d’un antibiotique tel que la novobiocine (Leppla, 1991).

11 existe actuellement deux types de vaccins contre l’anthrax. Le premier, appelé vaccin vivant, est

constitué de spores de B. anthracis de la souche Sterne ; il sert pour l’immunisation des animaux qui

acquièrent alors une immunité d’environ 18 mois (Shlyakhov et al., 1994). Le second vaccin est celui

servant pour l’immunisation des êtres humains ; il est appelé vaccin chimique et est constitué

Figure 1.4. : Structure tridimensionnelle de PA83. Les 4 domaines de la protéine sont représentés, le

domaine 1 est constitué de PA20 (bleu foncé) et du domaine 1’ (Petosa et al., 1997)

principalement de l’antigène protecteur (PA) de B. anthracis purifié à partir de cultures in vitro de la souche Sterne. Ce vaccin nécessite 6 injections sur un laps de temps de 18 mois suivies d’un rappel annuel (Ivins et al., 1990).

1.3.2. Caractérisation des toxines

La régulation de la sécrétion des toxines par la bactérie reste encore aujourd’hui un point d’interrogation. En efifet, une fois que les spores de la bactérie ont pénétré l’hôte, il semble clair que la germination est provoquée par un signal spécifique uniquement présent chez l’hôte (Mock et al., 2001). Par ailleurs, une régulation au niveau transcriptionnel par le bicarbonate et la température a été mise en évidence pour la production des toxines par la bactérie. Mais, actuellement, peu de choses sont connues sur la manière dont les toxines sont sécrétées par la bactérie.

A partir d’un milieu synthétique dont le composant clé est le bicarbonate (milieu RP42), un fermenteur de 50 litres permet d’obtenir typiquement, après purification, 500 mg de PA, 100 mg de LF et 40 mg de EF (Puziss et al., 1963 ; Ristroph et al., 1983).

Le séquençage des gènes pag, lef et cya a permis de montrer que les protéines PA, LF et EF étaient respectivement constituées de 764, 809 et 800 acides aminés (Welkos et al., 1988 ; Bragg et al., 1989 ; Robertson et al., 1988 ; Escuyer et al., 1988). Elles présentent chacunes, avant maturation, du côté N-terminal, une série d’acides aminés typiques des peptides signaux des bacilles (29 pour PA et 33 pour EF et LF).

Ces 3 protéines partagent diverses particularités : elles sont similaires en taille et en charge ; elles ne comportent aucun résidu cystéine

1.3.3. Structure des toxines L3.3.1.PA83

La protéine PA83 est une molécule longue et plate. Elle a été cristallisée à une résolution de 2,1 Â et est constituée de 4 domaines (Petosa et al., 1997) (Figure I.4.). Elle a une dimension de 100 x 50

30 Â et s’organise essentiellement en feuillets P anti-parallèles.

Le domaine 1 (résidus 1-258) est constitué d’un « sandwich p » avec une topologie de type « jelly-

roll » et d’une série de petites hélices ; le domaine 2 (résidus 259-487) a un « corps de tonneau P »

avec une topologie de type « clé grecque ». Le domaine 3 (résidus 488-595) comprend un feuillet P

constitué de 4 brins et enfin, le domaine 4 (résidus 596-735) est d’abord constitué d’une épingle à

cheveux de 2 feuillets p puis une hélice a suivie d’un « sandwich P » avec un reploiement de type

immunoglobuline (Petosa et al., 1997).

Figure L5. : Structure tridimensionnelle de LF. Les différents domaines de la protéine (I, II, III et IV) sont représentés respectivement en bleu foncé, jaune, vert et bleu clair. Le substrat de la toxine est représenté en rouge (Pannifer et al., 2001)

S»¥»td^ A

S«i&chC

Figure 1.6. : Structure tridimensionnelle du corps catalytique de EF (résidus 294-800). Les 3 domaines

constituant cette partie catalytique sont représentés respectivement en jaune, bleu et vert (Drum et al.,

2002).

1.3.3.2. LF

LF a été cristallisée à une résolution de 2,2 Â (Figure 1.5.) ; il s’agit d’une longue molécule de 100 Â de haut sur 70 Â de large (Pannifer et al., 2001). Elle est constituée de 4 domaines :

1. le domaine I est constitué d’un paquet de 12 hélices a empilées le long d’un feuillet P constitué de 4 brins, ce domaine est impliqué dans la liaison à PA63

2. le domaine II ressemble fortement au domaine catalytique de la toxine VIP2 de B.

cereus mais le domaine II ne possède pas la poche de liaison du NAD caractéristique de la toxine et ne doit donc pas avoir d’activité d’ADP-ribosylation

3. le domaine III est un petit paquet d’hélices a qui contient une partie hydrophobe entre les résidus 303-382, il partage une surface hydrophobe avec le domaine IV.

4. le domaine IV est constitué d’un paquet de 9 hélices a empilées contre un feuillet P constitué de 4 brins, ce domaine contient le site catalytique de la protéine.

1.3.3.3.EF

Actuellement, EF est la moins bien caractérisée des protéines des toxines de l’anthrax. En effet, concernant la structure, il a été démontré que le taux d’hélices a est d’environ 39 % et celui de feuillets P de l’ordre de 28 % (Wang et al., 1997). Seuls les domaines catalytiques de la protéine (résidus 294-800) ont été récemment cristallisés en présence et en absence de calmoduline et d’un analogue non cyclisable de l’ATP (Drum et al., 2002). La partie catalytique de EF est constituée de 3 domaines globulaires (Figure 1.6.) : le site actif de EF est situé à l’interface de 2 domaines, C

(résidus 294-349 et 490-622) et C

(résidus 350-489) ; un troisième domaine hélicoïdal (résidus 660-800) est relié à C

par un linker (623-659) (Drum et al., 2002)

1.4. Mode d’action des toxines sur la cellule

PA seul n’est pas toxique pour la cellule. Les premières indications concernant sa fonction

proviennent d’une série d’expériences réalisées par Molnar et Altenbem (1962) qui utilisèrent les

composants partiellement purifiés des toxines. Ils montrèrent que PA était éliminé de la circulation

sanguine moins de deux heures après son injection dans des rats de Fisher. Contrairement à PA, LF

restait dans le flux sanguin au moins pendant 4 heures après son injection. Si LF ou PA -i- LF étaient

injectés peu de temps après PA, alors l’animal mourait en moins de 70 minutes. Curieusement, si LF

ou PA + LF étaient injectés 1 heure après PA, alors le moment de la mort de l’animal était reculé ; de

plus, si LF était injecté plus de deux heures après PA, aucune cytotoxicité n’était constatée. Ces

résultats suggèrent donc un modèle dans lequel PA est lié et est « séquestré » par un composant des

tissus de l’hôte et que, pour exercer son activité catalytique, LF doit interagir avec PA avant sa

Figure 1.7. : Représentation schématique de l’entrée des toxines de l’anthrax dans la cellule. L’antigène protecteur (PA83) se lie à son récepteur en surface de la cellule puis est activé par protéolyse. Cette activation permet à PA63 de lier EF ou LF et de s’oligomériser. L’entrée de ce complexe dans la cellule est alors médiée par la voie endosomiale. L’acidification des endosomes provoque alors des changements conformationnels au niveau de l’heptamère de PA63, ce qui a pour conséquence d’entraîner son insertion dans la membrane endosomiale et ainsi transloquer EF ou LF. Une fois dans la cellule, EF et LF peuvent exercer leur activité catalytique (Duesbery et al., 1999).

Certaines parties de ce schéma, suite à des découvertes récentes, ne sont plus correctes et seront donc

discutées au cours de notre introduction.

« séquestration » (Momar et Altembem, 1962). Les auteurs n’ont pu réaliser des expériences similaires avec EF à cause de leur incapacité, à l’époque, à purifier la protéine.

Ce modèle dans lequel il semble que la toxine soit constituée de deux parties et que seule une des deux parties soit porteuse de l’activité catalytique ressemble à celui proposé pour de nombreuses toxines bactériennes, le modèle des toxines binaires de type A-B. Il implique l’organisation de la toxine en deux domaines fonctionnels : un domaine B (pour binding) et un domaine A, porteur de l’activité enzymatique. La toxine se fixe d’abord sur des récepteurs cellulaires par l’intermédiaire de son domaine B puis, le domaine A traverse la membrane cible par des mécanismes encore non élucidés mais impliquant le domaine B. Enfin, le domaine A exerce son activité sur sa cible intracellulaire (Gill, 1978).

La toxine type de ce groupe des toxines de type A-B est la toxine diphtérique secrétée par C.

diphtheriae. Il s’agit d’une protéine de 58 kDa qui, une fois dans le milieu extracellulaire, est clivée par une protéase du type de la furine pour générer deux fragments liés entre eux par un pont disulfure : le fragment A (DTA, 21 kDa) et le fragment B (DTB, 37 kDa). Après liaison du fragment B à son récepteur, un précurseur de facteur de croissance humain de type EGF liant l’héparine (HB-EGF), la toxine est internalisée via endocytose. Au niveau du pH acide des endosomes, un changement de conformation a lieu au niveau du fragment B qui s’insère alors dans la membrane endosomiale. Cette insertion dans la membrane permet la translocation du fragment A qui, libéré du fragment B par réduction du pont disulfure, peut exercer son activité catalytique en ADP-ribosylant le facteur d’élongation 2 , ce qui a comme conséquence de le rendre inactif et d’ainsi inhiber la synthèse protéique.

Dans le cas de B. anthracis, les domaines A et B sont deux polypeptides distincts, PA sert de domaine B tant à la toxine léthale qu’à la toxine d’œdème tandis que le domaine A est constitué de LF dans le cas de la toxine léthale et de EF pour la toxine d’œdème.

Le mode d’action des toxines de B. anthracis peut donc être divisé en 6 étapes (Figure 1.7.):

^ Liaison de PA83 au récepteur cellulaire Activation de PA83 en PA63 par protéolyse Fixation de LF et/ou EF à PA63

Endocytose

Translocation de LF et EF vers le cytoplasme cellulaire

Expression de l’activité catalytique

1.4.1. Liaison de PA83 au récepteur cellulaire 1.4.1.1, Identification du récepteur

La démonstration de l’existence d’un récepteur pour PA83 date des travaux de Escuyer et Collier (1991). Ils ont caractérisé l’interaction de l’antigène protecteur PA83 de B. anthracis avec des récepteurs sur des cellules CHO-Kl d’ovaires de hamster chinois. La technique classique permettant d’étudier les interactions récepteur-ligand consiste à incuber les cellules avec le ligand à une température de 4°C (Cuatrecasas, 1974). Escuyer et Collier ont ainsi pu démontrer la spécificité et la réversibilité de l’interaction de PA avec son récepteur ; de plus, la saturabilité du récepteur (saturation du récepteur pour les concentrations en PA > 0,5 pg/ml) ainsi que la haute affinité de l’interaction (constante de dissociation Kj de 0,9 nM) ont pu être démontrés. La spécificité, la haute affinité, la saturabilité et la réversibilité sont les 4 critères définis par Cuatrecasas (1974) pour la caractérisation d’un véritable récepteur. Malheureusement les diverses tentatives d’identification définitive du récepteur par des techniques telles que le cross-linking ou la purification sur gradient de sucrose se sont révélées infructueuses (Escuyer et Collier, 1991 ; Beauregard et al., 1999).

Ce n’est que très récemment, grâce à une méthode génétique, que le récepteur de PA83 a pu être identifié. Après utilisation d’un agent alkylant pour introduire des mutations au hasard dans des cellules CHO-Kl sensibles à la toxine léthale (PA+LF) de B. anthracis et à la toxine chimère LF

- DTA + PA (DTA pour diphtheria toxin A fragment) dont l’activité catalytique est facile à détecter, Bradley et ses collaborateurs ont isolé 10 colonies résistantes (CHO-Rl.l) à la toxine chimère en supposant que cette résistance devait provenir de la perte du récepteur de PA essentiel à l’entrée de la toxine chimère dans les cellules (Bradley et al., 2001). Cette hypothèse a pu être confirmée par cytométrie de flux puisque ces cellules CHO-Rl.l étaient incapables de lier du PA83 conjugué avec du vert oregon (OGPA pour Oregon Green Protective Antigen).

Le système des retrovirus a alors été utilisé pour complémenter les cellules résistantes isolées par des ADN complémentaires issus d’une librairie de cDNA de cellules HeLa humaines sensibles.

Les cellules transfectées ont alors été testées par cytométrie de flux sur base de leur capacité à lier l’OGPA et une colonie a pu être isolée (Bradley et al., 2001). Après PCR, les auteurs ont démontré que ces cellules contenaient 7 inserts d’ADN complémentaire. Chaque insert a alors été purifié sur gel et testé à nouveau sur des cellules CHO-Rl.l afin de déterminer lequel des 7 inserts restaurait la sensibilité des cellules à la toxine chimère ainsi que leur capacité à lier l’OGPA.

L’ADN complémentaire de 1,5 kb isolé et capable de restaurer la capacité de liaison à PA83 contient une phase de lecture ouverte qui code pour une protéine de 368 acides aminés dont un peptide signal de 27 a.a., 1 domaine extracellulaire de 293 a.a. avec 3 sites de glycosylation et une extrémité cytoplasmique de 48 a.a.. Cet ATR (Anthrax Toxin Receptor) présente la particularité de contenir, entre ses a.a. 44 et 216, le domaine extracellulaire du facteur de Von Willebrand de type A (VWA).

Ce VWA est présent dans le domaine extracellulaire de beaucoup de protéines de surface de la cellule

9

l

MKKRKVLIPL MALSTILVSS TGNLEVIQAE VKQENRLLNE SESSSQGLLG YYFSDLNFQA 31

PMWTSSTTG DLSIPSSELE NIPSENQYFQ SAIWSGFIKV KKSDEYTFAT SADNHVTMWV 91

DDQEVINKAS NSNKIRLEKG RLYQIKIQYQ RENPTEKGLD FKLYWTDSQN KKEVISSDNL 151

r^Trypsine

QLPELKQKSS NSRKKRSTSA GPTVPDRDND GIPDSLEVEG YTVDVKNKRT FLSPWISNIH 211

EKKGLTKYKS SPEKWSTASD PYSDFEKVTG RIDKNVSPEA RHPLVAAYPI VHVDMENIIL 271

^Chymotrypsine

SKNEDQSTQN TDSETRTISK NTSTSRTHTS EVHGNAEVHA SFFDIGGSVS AGFSNSNSST 331 VAIDHSLSLA GERTWAETMG LNTADTARLN ANIRYVNTGT APIYNVLPTT SLVLGKNQTL 391 ATIKAKENQL SQILAPNNYY PSKNLAPIAL NAQDDFSSTP ITMNYNQFLE LEKTKQLRLD 451

TDQVYGNIAT YNFENGRVRV DTGSNWSEVL PQIQETTARI IFNGKDLNLV ERRIAAVNPS 511

DPLETTKPDM TLKEALKIAF GFNEPNGNLQ YQGKDITEFD FNFDQQTSQN IKNQLAELNA 571

TNIYTVLDKI KLNAKMNILI RDKRFHYDRN NIAVGADESV VKEAHREVIN SSTEGLLLNI 631

DKDIRKILSG YIVEIEDTEG LKEVINDRYD MLNISSLRQJ) GKTFIDFKKY NDKLPLYISN 691 PNYKVNVYAV

■ - --- TKENTIINPS ENGDTSTNGI KKILIFSKKG YEIG 735

domaine de PA responsable de la liaison au récepteur

Figure 1.8. : Séquence de la protéine PA83. La flèche indique la position du premier résidu dans la

proteine secrétée. Les acides aminés 164-168 sont soulignés car ils représentent le site de clivage de la

trypsine (et de la furine). De même, les résidus sont soulignés car ils représentent le site de

clivage de la protéine par la chymotrypsine.

comme les intégrines et les matrilines et est impliqué dans des interactions protéines-protéines. Dans le cas des intégrines, le VWA constitue le site de fixation des ligands via un motif MIDAS (Métal lon- Dependent Adhesion Site) qui semble être conservé dans l’ATR (Bradley et al, 2001).

Le domaine I de l’ATR constitué des acides aminés 41-227 a été exprimé et purifié dans E.

coli au moyen d’un Tag-histidine (T7-ATR). Des expériences de co-immunoprécipitation en présence d’un sérum anti-PA polyclonal ont permis de montrer que ce T7-ATR se liait de manière directe et spécifique à PA ; de plus, en présence d’EDTA, cette liaison est rompue ce qui démontre l’importance des cations divalents dans cette interaction, et donc probablement l’importance du motif MIDAS dans la liaison de PA83 à l’ATR (Bradley et al, 2001).

L’ATR est largement conservé au travers des espèces ; en effet, l’ATR de souris présente plus de 98% d’identité de séquence avec l’ATR humain isolé grâce aux expériences de Bradley et ses collaborateurs. Par ailleurs, en accord avec le fait que l’ATR est exprimé dans une grande variété de lignées cellulaires, l’ATR est exprimé dans une large série de tissus différents tels le système nerveux central, le cœur, les poumons et les lymphocytes (Bradley et al, 2001) ; ce qui explique sans doute l’ubiquité des toxines de l’anthrax pour ces différents hôtes.

1.4.1.2. Domaine de PA impliqué dans la liaison au récepteur

Différentes études ont permis de montrer que le site d’interaction de PA avec son récepteur était situé au niveau de l’extrémité C-terminale de PA. En effet, des délétions au niveau de l’extrémité C-terminale de PA (Singh et al., 1991) ainsi que l’utilisation d’anticorps monoclonaux spécifiques qui empêchent la liaison de PA à son récepteur (Little et al., 1988 ; Little et al., 1991 et Little et al., 1996) ont permis de montrer que les 5 à 7 acides aminés C-terminaux de PA jouent un rôle essentiel en stabilisant PA dans une conformation favorable à son interaction avec son récepteur et que les acides aminés situés entre l’Asp-671 et TIle-721 devaient contenir le site d’interaction entre PA et son récepteur.

La cristallistion de PA83 à une résolution de 2,1 Â a permis de montrer que la protéine était reployée en 4 domaines distincts (Petosa et al., 1997). Le domaine 4 comprend les 139 acides aminés C-terminaux (596-735) (Figure 1.8.) et a donc été largement étudié afin d’identifier la région de PA impliquée dans la liaison à son récepteur. Des délétions de 9 ou 16 résidus au niveau de la boucle exposée au niveau des a.a. 703-722 induisent une diminution d’affinité d’un facteur 10 de PA pour son récepteur (Brossier et al., 1999). D’autres travaux basés sur des mutants dans lesquels seul un résidu de la boucle est substitué indiquent que la boucle 704-722 n’est pas impliquée dans la liaison de PA à son récepteur mais des substitutions au niveau de la boucle située entre les a.a. 679-693 inhibent cette liaison (Varughese et al., 1999). Cette différence d’interprétation au niveau de la boucle 703-722 est sans doute causée par la différence de méthode utilisée ; en effet, les monosubstitutions utilisées par

10

Varughese et al. peuvent ne pas tenir compte de la structure tertiaire adoptée par cette région alors que la délétion de cette région tendrait à démontrer son importance.

L’ensemble de ces résultats indique donc qu’il existe, dans l’interaction entre PA et son récepteur, à la fois un site conformationnel et un site de liaison : les 5 à 7 acides aminés C-terminaux de PA jouent un rôle essentiel dans l’interaction de PA avec son récepteur en stabilisant la protéine dans une conformation favorable à son interaction avec son récepteur. Par contre, la localisation exacte sur la protéine du site d’interaction de PA avec son récepteur n’est pas établie ; il semblerait que les deux boucles exposées situées au niveau des a.a. 679-693 et 704-722 soient des sites privilégiés mais diverses expériences doivent encore être effectuées afin d’identifier le rôle exact de chacune de ces régions.

1.4.2. Activation de PA83 en PA63 par protéolyse

Après liaison au récepteur, PA subit un clivage protéolytique essentiel pour que EF et/ou LF puissent s’y lier. Leppla et ses collaborateurs ont montré que PA était clivé en deux fragments de 63 kDa (PA63) et de 20 kDa (PA20) par une protéase cellulaire (Leppla et al., 1988). Le séquençage N- terminal de PA63 a permis de montrer que le clivage avait lieu après le résidu Arg'^’ au niveau de la séquence Arg-Lys-Lys-Arg-Ser'^* de PA. Il a pu être démontré que cette région de PA était essentielle à la toxicité de l’anthrax (Singh et al., 1989). En effet, en combinaison avec LF, un mutant de PA83 délété des résidus 163 à 168 est non toxique pour des cellules J774A.1 ; il a pu être vérifié que cette perte de toxicité n’était pas due à l’absence de liaison de PA à son récepteur ni à une perte de la liaison de LF à PA mais bien à l’impossibilité du PA mutant d’être clivé (Singh et al., 1989). In vitro, cette protéolyse peut être réalisée par traitement limité de PA83 avec de la trypsine (Singh et al., 1989).

Dans cette région de 5 résidus, l’analyse des acides aminés concernés a permis de montrer la présence d’un site de clivage pour la furine, une sérine-endoprotéase calcium dépendante qui clive des précurseurs de protéines au niveau de paires de résidus basiques (-Lys-Arg- ou -Arg-Arg-) (Leduc et al., 1992). La furine est principalement localisée au niveau de la membrane du Golgi mais sa présence a également été démontrée au niveau de vésicules de clathrine provenant du TGN, au niveau de la membrane plasmique en tant que protéine membranaire intégrale et, enfin, en solution comme une en 2 yme soluble (Molloy et al., 1992 ; Schafer et al., 1995 ; Bosshart et al., 1994 ; Seidah et al., 1993).

L’importance de la furine dans le processus d’activation de PA a pu être démontrée grâce à

l’utilisation d’une protéine de fusion constituée du domaine N-terminal de LF (LF

) et d’un épitope de

lymphocyte T cytotoxique (CTL). En effet, dans des cellules dans lesquelles le gène de la furine avait

été inactivé, la protéine LF

-CTL n’était pas délivrée de manière efficace par rapport aux cellules dans

lesquelles la furine était active; cela est dû à un déficit dans l’activation de PA qui ne peut dès lors pas

AGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEIMKIIIVKIEVKGEEVKKEAAE 60 KLLEKVPSDVLEMYKAIGGKIYIVDGDITKHISLEALSEDKKKIKDIYGKDALLHEHYVY 120 AKEGYEPVLVIQSSEDYVENTEKALNVYYEIGKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNA 180 SDSDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAYYIEPQHRDVLQLYAPEA 240 FNYMDKFNEQEINLSLEELKDQRMLSRYEKWEKIKQHYQHWSDSLSEEGRGLLKKLQIPI 300 EPKKDDIIHSLSQEEKELLKRIQIDSSDFLSTEEKEFLKKLQIDIRDSLSEEEKELLNRI 360 QVDSSNPLSEKEKEFLKKLKLDIQPYDINQRLQDTGGLIDSPSINLDVRKQYKRDIQNID 420 ALLHQSIGSTLYNKIYLYENMNINNLTATLGADLVDSTDNTKINRGIFNEFKKNFKYSIS 480 SNYMIVDINERPALDNERLKWRIQLSPDTRAGYLENGKLILQRNIGLEIKDVQIIKQSEK 540 EYIRIDAKVVPKSKIDTKIQEAQLNINQEWNKALGLPKYTKLITFNVFINRYASNIVESAY 600 LILNEWKNNIQSDLIKKVTNYLVDGNGRFVFTDITLPNIAEQYTHQDEIYEQVHSKGLYV 660 PESRSILLHGPSKGVELRNDSEGFIHEFGHAVDDYAGYLLDKNQSDLVTNSKKFIDIFKE 720 EGSNLTSYGRTNEAEFFAEAFRLMHSTDHAERLKVQKNAPKTFQFINDQIKFIINS 776

Figure 1.9. : Séquence de la protéine LF délétée de son peptide signal. LFj.j est représenté en bleu. Les

résidus impliqués dans la liaison de LF à PA63 sont en caractères rouges.

lier LF

et la transloquer vers l’intérieur de la cellule (Zhang et al., 2001). Par ailleurs, il a été démontré qu’une préparation cellulaire enrichie en furine (70% de pureté) était capable de cliver PA83 in vitro (Molloy et al., 1992). De plus, des études réalisées sur cellules avec des mutants de PA ont permis de montrer que la furine ne nécessitait que les Arg en position - 4 et - 1 pour être efficace (Molloy et al., 1992 ; Klimpel et al., 1992 ; Gordon et al., 1995).

Cependant, des études réalisées avec des souches cellulaires déficientes pour la furine suggèrent que d’autres protéases pourraient jouer un rôle similaire à celui de la furine car ces souches déficientes restent sensibles à l’anthrax (Gordon et al., 1995). La protéase PACE4, qui ressemble fortement à la furine quant à sa séquence cible, a alors été étudiée pour son rôle dans l’activation de PA (Gordon et al., 1997). Par opposition à la furine qui est principalement membranaire (majoritairement au niveau du Golgi et un peu au niveau de la membrane plasmique), PACE4 est une protéase soluble. En utilisant des cellules déficientes pour la furine et en les transfectant avec le gène codant pour PACE4, les auteurs ont pu démontrer que PACE4 pouvait cliver efficacement PA lorsque celui-ci était situé en surface des cellules (Gordon et al., 1997). PACE4 serait dès lors produite par les cellules transfectées et secrétée dans le milieu extracellulaire ; une concentration de molécules de protéases dans le milieu permettrait alors un clivage efficace de PA (Gordon et al., 1997).

Ces résultats indiquent donc que, bien que présente en très petite quantité au niveau de la membrane plasmique et du sérum, la furine joue principalement le rôle d’activateur de PA83 en le clivant au niveau de la séquence Arg-Lys-Lys-Arg-Ser'^*. Mais, en cas de déficience en furine, PACE4 est également capable d’activer PA83. Les recherches futures permettront d’établir si d’autres protéases sont également capables d’accomplir cette activation.

1.4.3. Liaison de LF et/ou EF à PA63

1.4.3.1. Domaine d’interaction de LF avec PA63

Le site de fixation de LF à PA63 a pu être localisé grâce à des expériences de mutagenèse impliquant l’insertion d’une séquence de 12 nucléotides à divers endroits du gène de LF (Quinn et al., 1991). Après expression du gène dans une souche avirulente de B. anthracis et purification, 14 protéines mutées stables ont chacune été testées, d’une part, in vitro afin de savoir si elles étaient toujours capables de se lier à PA63 et, d’autre part, sur des macrophages afin de vérifier leur toxicité.

Ces expériences ont permis de démontrer que les 4 insertions situées au niveau des 250 aeides aminés

N-terminaux de LF rendaient impossible la liaison entre LF et PA63 alors que les 4 mutations situées

dans la partie C-terminale de LF affectaient la toxicité de la protéine sans empêcher la liaison de l.F à

PA63. Ces résultats indiquent done que le domaine de liaison de LF à PA63 est situé au niveau de son

extrémité N-terminale alors que son domaine eatalytique est sans doute situé dans son extrémité C-

terminale (Quinn et al., 1991).

Figure I.IO. : A. Représentation tridimensionnelle de LF et, en particulier, en rouge et jaune, sa région N- terminale (résidus 28-263). Les régions colorées de LFj^ représentent les conservations de séquence avec EF avec en rouge les résidus conservés et en jaune, les non-conservés.

B. Les résidus en couleur sont les résidus pour lesquels une mutation en alanine a été effectuée pour tester la liaison de LF à la cellule. Les résidus en vert présentent un phénotype sauvage, ceux en mauve induisent une liaison réduite tandis que ceux en rouge provoquent un effet dramatique sur la liaison de LF à la PA63. Ces résultats sont repris dans le schéma présenté Figure 1.11. (Lacy et al 2002)

s S

€ e ü*

Sound LF^

(firaotion of wilil'tirpe)

Figure 1.11. : Résultats des expériences sur cellules de liaison des différents mutants de LFj^ à PA63 .Ces

données représentent la fraction des molécules des mutants-alanine de LF^j liés spécifiquement à PA63 sur les

cellules par rapport à celle observée pour le LF^ sauvage (résidus 28-263). (Lacy et al 2002)

Ces résultats ont été affinés par les travaux réalisés par Arora et ses collaborateurs (Arora et al., 1993). Au cours de précédents travaux, les auteurs avaient utilisé le système PA63/LF comme système de transport afin de faire pénétrer l’exotoxine A de Pseudomonas dans des cellules eucaryotes. Ils avaient alors pu démontrer que des protéines de fusion constituées de LF et du domaine d’ADP-ribosylation de l’exotoxine A de Pseudomonas étaient, en présence de PA63, particulièrement toxiques pour des cellules eucaryotes suite à l’action de l’exotoxine A (Arora et al., 1992). L’entièreté du domaine catalytique de LF n’étant sans doute pas nécessaire à faire pénétrer l’exotoxine A, d’autres protéines de fusion ont été réalisées en utilisant cette fois différents mutants de délétion de LF. 11 a ainsi été démontré que la protéine de fusion était capable de se lier à PA63 si le domaine de l’exotoxine A était fusionné aux résidus 1-254 de LF (LF

) mais pas si la protéine de fusion ne contenait que les résidus 1-198 de LF, suggérant ainsi un rôle essentiel pour les acides aminés situés entre les résidus 198 et 254 (Arora et al., 1993). Par ailleurs, il a également été démontré que les résidus histidine situés dans la région 1-254 (LF

) jouaient un rôle important dans la liaison de LF à PA63 (Arora, 1997) (Figure I.9.). En effet, la modification de ces résidus His avec le DEPC, un agent qui modifie les histidines, résulte en une perte de la liaison de LF à PA63 et de la toxicité de la toxine léthale. Par la suite, des expériences de mutagenèse dirigées réalisées sur les 9 résidus histidine concernés ont permis de démontrer que l’histidine 42 jouait un rôle critique dans le maintien d’une conformation de LF capable de se lier à PA63 et que l’histidine 35 jouait également un rôle essentiel dans la liaison de LF à PA63 (Arora, 1997).

Récemment, sur base d’une comparaison des séquences et des structures de EF et LF, un groupe a étudié l’importance d’un cluster de 7 résidus conservés dans les deux séquences et situés en surface des protéines (Lacy et al., 2002) (Figure I.IO.A.). Ce cluster est formé par l’intersection de deux hélices a et d’une tyrosine appartenant à une troisième hélice et pourrait donc, au vu de sa position et de sa conservation, jouer un rôle dans la liaison de LF et EF à PA63. Les mutations en Ala des résidus Asp 182, Asp 187, Leu 188, Tyr 223, His 229, Leu 235 et Tyr 236 réduisent significativement la liaison de LF à PA63 avec une perte totale de liaison pour les mutations H229A et Y236A (Figures I.IO.B. et 1.11.). Les mutations des résidus homologues de EF (Asp 169, Asp 174, Leu 175, Tyr 214, His 220, Leu 226 et Tyr 227) produisent la même perte de liaison de EF à PA63 (Lacy et al., 2002). Cette poche conservée située en surface des protéines LF et EF pourrait donc bien être leur site de laison à PA63 (Lacy et al., 2002).

En résumé, les 254 résidus NH 2 -terminaux de LF jouent donc un rôle critique dans la liaison

de la protéine à PA63, et, en particulier, une petite « poche » de 7 résidus située à l’intersection de

deux hélices a et qui est conservée au niveau de EF.