IV. RÉSULTATS
IV.3. Orientation de EF dans des liposomes d’asolectine
IV.3.2. Site de fixation de l’ATP
Afin que EF puisse exercer son activité catalytique, deux sites essentiels doivent être
correctement orientés ; il s’agit du site de fixation de la calmoduline et du site de fixation de l’ATP.
Les expériences présentées précédemment montrent que le site de fixation de la calmoduline est, dans
60% des cas, correctement orienté dans des liposomes d’asolectine lorsque le rapport PA63:EF est de
7:1. Nous avons donc voulu vérifier si, dans les mêmes conditions, le site de fixation de l’ATP est
également orienté vers l’intérieur des liposomes d’asolectine. Dans cette optique, nous avons utilisé,
de la même manière que le complexe ASD-CaM, du 5-azido-ATP (a-^^P) qui est une molécule
pratiquement identique à l’ATP si ce n’est qu’elle possède les propriétés d’être radioactive et
photoactivable (Figure IV. 12.).
Comme dans le cas du complexe CaM-SASD, l’idée est de comparer deux échantillons de
protéoliposomes contenant le 5-azido-ATP (a-’^P) ; l’un étant traité avec du détergent afin de rendre
tous les sites de fixation de l’ATP accessibles et l’autre étant photoactivé sans ajouter de détergent. La
Figure IV.14. : Autoradiographie d’un gel d’électrophorèse SDS-PAGE 12 %
Marquage de EF par le 5-azido-ATP (a-^^P) avec les rapports PA63:EF de 1:1 et 7:1
Piste 1 : lipos PA63/EF (1/1) + 5-azido-ATP (a-^^P)
Piste 2 : lipos PA63/EF (1/1) + détergent + 5-azido-ATP (a-^^P)
Piste 3 : lipos PA63/EF (7/1) + 5-azido-ATP (a-^^P)
Piste 4 : lipos PA63/EF (7/1) + détergent + 5-azido-ATP (a-^^p)
Les graphes présentés ci-dessous sont le résultat des densitométries effectuées selon le protocole décrit
dans Matériels et Méthodes
Méthode A. pistes 1 et 2 Méthode B. pistes 1 et 2 Méthode C. pistes 1 et 2
A .
3
21
0 0 24
6 O OAprès soustraction des aires
correspondant au bruit de fond (X-Y), la
tache de la piste 2 correspond à une aire
d’une intensité de 2,05 tandis que la tache
de la piste 1 à une intensité de 1,37 soit 67
Vo de l'intensité de la tache de la piste 2
Après tracé d’une ligne de base
correspondant au bruit de fond, la tache de
la piste 2 correspond à une aire d’une
intensité de 1,99 tandis que la tache de la
piste 1 à une intensité de 1,31 soit 69 % de
l'intensité de la tache de la piste 2
Les boites définies
dans la piste 1
présentent des
intensités respectives
de 2,11 pour la tache
et 0,79 pour le bruit
de fond. Dans la piste
2, les intensités sont
de 3,54 et de 1,66.
Donc, après
soustraction, la tache
de la piste 2
correspond à une
intensité de 1,88 et
celle de la piste 1 à
une intensité de 1,33
soit 71 % de
l'intensité de la tache
de la piste 2
comparaison des deux échantillons nous permettra alors de déterminer le pourcentage de molécules de
EF ayant orienté leur site de fixation de l’ATP vers l’intérieur des liposomes d’asolectine.
IV.3.2.1. Spécificité du marquage de EF par le 5-azido-ATP
Comme dans le cas du marquage par le complexe ASD-CaM, nous avons tout d’abord vérifié
la spécificité du marquage de EF par le 5-azido-ATP (a-^^P). EF a été reconstitué, en présence de
PA63 (rapport PA63:EF de 1:1) dans des liposomes d’asolectine puis un détergent non ionique a été
ajouté à la solution (Triton X-100, 1% final). L’échantillon a lors été séparé en deux. Dans un cas, le
5-azido-ATP (a-^^P) a été ajouté et photoactivé après une heure d’incubation à 37°C. Dans le second
cas, le 5-azido-ATP (a-^^P) a été ajouté puis, après 1 heure d’incubation, un excès d’ATP (100 X) non
marqué a été ajouté à l’échantillon. Après une heure supplémentaire d’incubation, l’échantillon a été
photoactivé par illumination sous une lampe UV. Après électrophorèse, le gel a été placé en cassette
afin d’effectuer une autoradiographie.
La densitométrie nous indique une diminution de plus de 95 % du marquage de EF (Figure
IV. 13), ce qui signifie donc que le marquage de EF est bien situé au niveau de son site de fixation de
l’ATP.
IV.3.2.2. Orientation du site de fixation de l’ATP
Comme dans le cas du marquage de EF par le ['^^I]ASD-CaM, deux rapports PA63/EF ont été
testés. Le marquage de EF seul dans des liposomes d’asolectine n’a pas été effectué puisque nous
avons démontré que, bien qu’il puisse interagir avec la membrane, EF seul n’était pas capable, dans
nos conditions de travail, de traverser la membrane lipidique de liposomes d’asolectine.
Afin d’effectuer une expérience dans les conditions de translocation, des protéoliposomes
contenant PA63 et EF aux rapports molaires 7/1 et 1/1 ont donc été incubés pendant une heure à 37°C
en présence de 5-azido-ATP (a-^^P). Après avoir séparé les échantillons en deux et ajouté un détergent
dans un des deux échantillons, le 5-azido-ATP (a-^^P) a été photoactivé. Les échantillons ont alors été
déposés sur un gel d’électrophorèse et, après migration, une autoradiographie a été effectuée (Figure
IV. 14.). Après développement de l’autoradiographie, une densitométrie a été effectuée sur les taches
observées ; les résultats sont repris dans le tableau ci-dessous (Tableau II), les paramètres utilisés pour
la densitométrie sont les mêmes que dans le cas du marquage de EF par la ['^^I]ASD-CaM.
Méthode A. pistes 3 et 4
(Figure IV.14.)
3 2 1 0 C N I 4X.
4 3 2 1 U(
2 4Y.
Après soustraction des aires
correspondant au bruit de fond (X-Y), la
tache de la piste 4 correspond à une aire
d’une intensité de 2,25 tandis que la tache
de la piste 3 à une intensité de 0,82 soit 36
% de l'intensité de la tache de la piste 4
Après soustraction des aires
correspondant au bruit de fond (X-Y),
la tache de la piste 2 correspond à une
aire d’une intensité de 2,22 tandis que
la tache de la piste 1 à une intensité de
1,15 soit 52 % de l’intensité de la tache
de la piste 2
Méthode B. pistes 3 et 4
(Figure FV.14.)
3 2 1 0 0 2 4 6 8X.
0 2 4 6 8Y.
Après tracé d’une ligne de base
correspondant au bruit de fond, la tache
de la piste 4 correspond à une aire d’une
intensité de 2,16 tandis que la tache de la
piste 3 à une intensité de 0,74 soit 34 % de
l’intensité de la tache de la piste 4
Méthode C. pistes 3 et 4
(Figure IV.14.)
Les boites définies dans
la piste 3 présentent des
intensités respectives de
1,27 pour la tache et
0,41 pour le bruit de
fond. Dans la piste 4, les
intensités sont de 3,28 et
de 0,82. Donc, après
soustraction, la tache de
la piste 4 correspond à
une intensité de 2,46 et
celle de la piste 3 à une
intensité de 0,67 soit 35
% de l’intensité de la
tache de la piste 4
Figure IV.15. : Autoradiographie d’un gel d’électrophorèse SDS-
PAGE 12 %. Marquage de de EF par le 5-azido-ATP (a-^^p) en
utilisant le rapport PA63:EF de 7:3
Piste 1 : lipos PA63/EF (7/3) + 5-azido-ATP (a-^^P)
Piste 2 : lipos PA63/EF (7/3) + détergent + 5-azido-ATP (a-^^P)
Les graphes présentés ci-dessous sont le résultat des
densitométries effectuées selon le protocole décrit dans Matériels
et Méthodes
Méthode B. Méthode C.
4 3 2 1 0 0 2 4 6 8X.
Après tracé d’une ligne de base
correspondant au bruit de fond, la tache
de la piste 2 correspond à une aire d’une
intensité de 2,54 tandis que la tache de
la piste 1 à une intensité de 1,24 soit 49
%del 'intensité de la tache de la piste 2
Les boites définies
dans la piste 1
présentent des
intensités respectives
de 2,32 pour la tache
et 1,21 pour le bruit de
fond. Dans la piste 2,
les intensités sont de
3,91 et de 1,81. Donc,
après soustraction, la
tache de la piste 2
correspond à une
intensité de 2,10 et
celle de la piste I à
une intensité de 1,10
soit 52 % de l'intensité
de la tache de la piste
2
Rapport PA63:EF 1:1 7:1
PA63 + EF 70 ± 2 % 35 ±2%
PA63 + EF + Triton X-100 100% 100%
Tableau II. : Pourcentages d’accessibilité du site de fixation de l’ATP de EF reconstitué dans des liposomes
d’asolectine en présence de PA63 (moyenne de 3 expériences indépendantes). Les pourcentages sont le résultat
d’une mesure de densitométrie afin de mesurer l’intensité du marquage du site de fixation de la CaM de EF par
une CaM radioactive photoactivable. La densitométrie a été effectuée sur les taches de l’autoradiographie
reprise Figure IV. 13. ; le 100 % représente les conditions où toutes les molécules de EF sont marquées,
c’est-à-dire en présence de détergent
Comme dans le cas du marquage de EF par le ['^^I]ASD-CaM, la translocation de EF vers
l’intérieur des liposomes d’asolectine est plus efficace lorsque EF est reconstitué en présence de PA63
avec un rapport molaire de 7/1. En effet, au rapport 1/1, 70% des sites de fixation de l’ATP de EF sont
marqués en absence de détergent ; ce qui signifie donc qu’ils sont orientés vers l’extérieur des
liposomes et que donc, seulement 30% des molécules de EF exposent leur site de fixation de l’ATP
vers l’intérieur de ceux-ci. Par contre, dans le cas du rapport 7/1, seulement 35% des sites de fixation
de l’ATP sont accessibles en absence de détergent ; ce qui signifie que 65% des molécules de EF
reconstituées exposent leur site de fixation de l’ATP vers l’intérieur des liposomes d’asolectine.
Les résulats obtenus par la localisation du site de fixation de l’ATP de EF confirment donc
ceux obtenus par la localisation du site de fixation de la calmoduline. Avec notre méthode de
reconstitution et en utilisant un rapport molaire PA63/EF de 7/1, entre 65 et 70% des molécules de EF
exposent, vers l’intérieur des liposomes leurs sites de fixation de l’ATP et de la calmoduline.
Récemment, une étude publiée par Mogridge et ses collaborateurs a fait état de la
stoechiomiétrie 7:3 pour les complexes PA/EF et PA/LF (Mogridge et al., 2002). En effet, il a été
démontré que EF/LF ne pouvaient se lier à PA63 que lorsque celui-ci se trouvait sous une forme au
moins dimérique et que, par ailleurs, une fois liée à ce dimère, la molécule de EF/LF empêchait la
liaison d’une seconde molécule de EF/LF à ce dernier. Par conséquent, l’heptamère de PA63 étant
constitué de « 3 dimères et demi », un maximum de 3 molécules de EF/LF pourraient se fixer sur
chaque heptamère de PA63. Nous avons donc testé cette stoechiométrie 7:3 pour notre système avec le
5-azido-ATP (a-^^P). Le résultat obtenu indique que le taux de translocation est pratiquement aussi
efficace que dans le cas de la stoechiométrie 7:1. En effet, le résultat de la densitométrie effectuée sur
l’autoradiographie (Figure IV. 15) nous indique qu’environ 50 % des molécules de EF ont leur site de
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