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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Moers, V. (2008). Contribution à l'étude de la fonction des facteurs BTBD6 et DMRT5 au cours du développement embryonnaire (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Sciences biologiques, Bruxelles.

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DBM 00714 Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences

Département de Biologie Moléculaire Laboratoire d’Embryologie Moléculaire

Directeur de thèse : Eric Bellefroid

Contribution à Tétude de la fonction des facteurs BTBD6 et DMRT5 au cours du

développement embryonnaire

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences

Virginie MOERS

Année académique 2008-2009

Université Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences

Département de Biologie Moléculaire Laboratoire d’Embryologie Moléculaire

Directeur de thèse : Eric Bellefroid

Contribution à l’étude de la fonction des facteurs BTBD6 et DMRT5 au cours du

développement embryonnaire

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences

Virginie MOERS

Année académique 2008-2009

Contribution à l’étude de la fonction des facteurs BTBD6 et DMRT5 au cours du développement

embryonnaire

Thèse présentée en soutenance privée le 21 novembre 2008 et en soutenance publique le 12 décembre 2008 devant le jury composé des membres suivants :

Pr. E. Pays Université

Dr. A. Marini Université

Dr. E. Bellefroid Université Dr. C. Gueydan Université Pr. P. Vanderhaeghen Université Pr. C. S

pirer Université

Pr. M. Perron Université

Libre de Bruxelles Libre de Bruxelles Libre de Bruxelles Libre de Bruxelles Libre de Bruxelles Libre de Bruxelles

Paris-Sud (Orsay, France)

Président Secrétaire

Directeur de thèse Expert de la Faculté Expert de la Faculté Président du comité d’accompagnement Expert extérieur

Virginie Moers

Laboratoire d’Embryologie Moléculaire

Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires (IBMM) Faculté des Sciences

Université Libre de Bruxelles

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier le Professeur Eric Bellefroid pour m’avoir accueillie dans son laboratoire ainsi que pour m’avoir encadrée et soutenue tout au long de cette thèse.

J’aimerais également remercier les collaborateurs extérieurs qui ont participé à ce travail.

Merci à Bassem Hassan, Jiekun et Iris (Laboratory of Neurogenetics, KUL, VIB) pour leur accueil et leur aide lors de mon initiation au monde de la drosophile.

Merci à Pierre Vanderhaeghen et Mélanie (IRIBHM, Erasme) pour leur accueil chaleureux et leur aide.

Merci à Yasuo Hitoyoshi (CNRS, Observatoire Océanologique, Villefranche-sur-Mer) pour sa collaboration et ses hybridations in situ sur ciona.

Merci à Odile Bronchain et Albert (Université Paris-Sud, Orsay, France) pour l’accueil chaleureux au sein de leur laboratoire et pour leur aide lors de mes premières injections d’embryons deX.tropicalis.

Un tout grand merci à Jean-Christophe Marine et Tino (Gent, VIB) pour leur aide, leur travail et leur patiente lors de l’invalidation de DmrtS chez la souris.

Merci à Annouck (KUL, VIB) pour son aide lors des manips de délocalisation.

Mes sincères remerciements vont également aux différents organismes ayant financé ce travail, à savoir le « Fonds pour la Formation à la Recherche dans l’Industrie et l’Agriculture » (FRIA) et le « pôle d’attraction interuniversitaire » (PAI).

Merci aux membres du jury pour leur relecture de ma thèse et leurs nombreux conseils.

Je remercie également très chaleureusement tous les membres du laboratoire d’Embryologie Moléculaire.

Un tout grand merci à Sadia pour sa serviabilité et sa bonne humeur. Peur importe le problème, tu as toujours la bonne solution !

Merci à Jacob pour son soutien discret mais indéniable ! Encore un grand merci pour ton aide dans la finalisation du « fameux » papier BTBD.

Merci à Massimo pour ses nombreux conseils et ses longues discussions au bureau.

Merci à Isabelle pour le travail remarquable qu’elle a déjà effectué sur la souris knockout DmrtS.

Merci à Stephen et Damien pour leur participation au projet DmrtS.

Merci à Louis pour son aide lors des injections. Sans toi je n’aurais jamais pu

« dompter » les tropicalis !

Merci à Fred pour son encadrement au cours de mon mémoire. Merci pour ton travail sur BTBD6 sans lequel les résultats plus récents n’auraient pu exister.

Enfin, merci à tout les membres du laboratoire passés ou présents : Claude, Vincent, Kaki, Flavio, Gilles, Sarah, Marion, Aline, Emmanuelle, Jessica, Rym, Xi et Souhila.

Merci aux membres des différents laboratoires de l’IBMM qui m’ont fourni une assistance technique ou matérielle. Un merci particulier à Pierre et Pascale du laboratoire de Biologie du développement qui ont toujours été présents pour un petit service ou pour répondre à mes questions. Un tout grand merci également à Bruno André et tous les membres de son laboratoire qui m’ont toujours accueillie avec la plus grande gentillesse.

Merci à Eisa et Morgane pour leur soutien et nos petites soirées entre filles !

Merci à la famille de Sylvain pour leur soutien et leurs encouragements. Merci de m’avoir accueillie parmi vous avec autant de gentillesse et de simplicité.

Je remercie mes parents de m’avoir toujours donné la possibilité et les moyens de faire ce que je voulais faire. Merci de m’avoir toujours encouragée et soutenue dans mes choix même si vous n’étiez pas certains que ce soient les bons !

Merci à toi, Sylvain, d’être toujours là pour m’épauler, pour ta compréhension, ta

patience et ton amour ! Merci de me donner toujours de nouveaux buts et de tout faire pour

que je les atteigne. Merci de m’avoir inlassablement fait répéter le moindre séminaire, d’avoir

lu et relu ma thèse et de résoudre tous mes « petits soucis » (mais des montagnes

insurmontables pour moi !) qui sont à ta portée.

ABREVIATIONS...1

INTRODUCTION...1

1. Les modèles animaux utilisés en biologie du développement... 1

1.1. Le xénope et la souris, deux organismes modèles majeurs chez les vertébrés... 1

1.1.1. Généralités... 1

1.1.2. Le développement embryonnaire du xénope et de la souris... 3

1.2. La drosophile, un organisme modèle incontournable chez les invertébrés... 5

1.2.1. Généralités...5

1.2.2. Le cycle de reproduction de la drosophile...5

2. Le développement du système nerveux... 6

2.1. Mécanismes moléculaires impliqués lors de l’induction neurale... 6

2.2. Mécanismes moléculaires contrôlant la régionalisation antéropostérieure du tissu neural... 7

2.3. Le contrôle de la neurogenèse chez le xénope...8

2.3.1. La neurogenèse primaire... 8

2.3.2. La cascade d’activation des gènes proneuraux et le mécanisme d’inhibition latérale...8

2.4. Le télencéphale... 10

2.4.1. Mécanismes moléculaires contrôlant la mise en place du télencéphale...10

2.4.2. Régionalisation dorso-ventrale du télencéphale... 11

3. Induction et spécifîcation des placodes...12

3.1. Gènes qui spécifient la destinée d’ectoderme préplacodal... 12

3.2. Voies de signalisations responsables de la formation de l’ectoderme préplacodal... 13

3.2.1. Rôle de la voie de signalisation BMP...13

3.2.2. Rôle de la signalisation antéro-postérieure... 14

4. Les protéines à domaine BTB-POZ... 15

4.1. Le domaine BTB-POZ... 15

4.2. Différentes catégories de protéines à domaine BTB-POZ...15

4.2.1. Protéines BTB-POZ possédant des domaines associés permettant la liaison à T ADN... 15

4.2.2. Protéines BTB-POZ possédant d’autres types, ou aucun autre motif de fonction connue associé, et dont certaines interagissent avec Tubiquitine ligase E3, Cullin-3... 16

a) Protéines BTB-POZ à motif Kelch... 17

b) Protéines BTB-POZ possédant d’autres domaines associés... 18

c) Protéines BTB-POZ ne possédant pas d’autre domaine conservé de fonction connue associé... 18

4.3. Caractérisation du gène XBTBD6 codant pour une protéine à domaine BTB- POZ (F. Bury)... 19

5. La famille des gènes Dmrt...20

5.1. Introduction... 20

5.2. Fonction des DMRT au cours de l’embryogenèse...22

5.2A. Dmrtl est requis pour la différentiation des gonades mâles... 22

5.2.2. Dmrtl est impliqué dans l’asymétrie gauche-droite des embryons ainsi que dans le développement des muscles...23

5.2.3. Dmrt4 présente une activité différente chez la souris et la grenouille...24

5.2.4. DmrtJ est essentiel à la fertilité du mâle... 25

5.3. DmrtS est exprimé dans le cerveau et l’appareil reproductem chez le poisson zèbre...25

PARTIE I ETUDE DE LA FONCTION DU FACTEUR BTBD6 AU COURS DU DÉVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE... 27

BUT ET STRATÉGIE...28

RÉSULTATS...29

1. Etude de la fonction du facteur XBTBD6 chez le xénope... 29

1.1. La sous-expression ds XBTBD6 inhibe l’expression de marqueurs neuronaux tardifs... 29

1.2. La sous-expression de XBTBD6 affecte la somitogenèse... 31

2. Etude de la fonction du gène lute de drosophile...31

2.1. Etude de l’expression de lute chez la drosophile...31

2.2. Les drosophiles mutantes homozygotes lute/lute sont létales... 32

2.3. La perte de fonction de lute affecte le développement neuronal tardif et la croissance axonale... 32

DISCUSSION ET PERSPECTIVES... 35

1. XBTBD6 est requis pour la différenciation neuronale et la somitogenèse... 35

2. Lute est requis pour le développement neuronal tardif et la migration axonale...36

PARTIE II IDENTIFICATION ET ÉTUDE DE LA RÉGULATION ET DE LA FONCTION DU FACTEUR DMRT5 AU COURS DU DÉVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE... 38

BUT ET STRATÉGIE...39

RÉSULTATS...40

1. Identification de clones d’ADNc DmrtS chez le xénope, la souris, le poulet et l’ascidie...40

2. Etude de l’expression du gène DmrtS au cours de l’embryogenèse chez le xénope, la souris et le poulet...41

3. Etude de l’expression de l’homologue de Dmrt4/S chez l’embryon d’ascidie... 43

4. Régulation de l’expression précoce du gène DmrtS chez l’embryon de xénope...44

5. Etude du rôle du facteur de transcription Dmrt5 au cours de l’embryogenèse chez le xénope... 45

6. Etude de la fonction du gène mDmrtS chez l’embryon de souris...47

DISCUSSION ET PERSPECTIVES...50

1. Le gène XDmrtS codant pour un membre de la famille des facteurs de transcription à doigts à zinc de type DM présente un profil d’expression semblable chez tous les vertébrés au cours de l’embryogenèse... 50

2. Etude du rôle du facteur Dmrt5 au cours de l’embryogenèse précoce des

vertébrés...52

ANNEXE I. MATERIEL ET METHODES... I 1. Manipulations d’ADN... I 1.1. Préparation, purification et analyse des ADN plasmidiques...I 1.2. Plasmides utilisés... I

1.2.1. Plasmides utilisés comme modèles lors des transcriptions in vitro de

sondes ARN destinées aux expériences d’hybridations in situ... II 1.2.2. Plasmides utilisés comme modèles pour les transcriptions in vitro

d’ARNm...III 1.3. Analyse des ADN génomiques par Southern blotting... III 1.3.1. Préparation des ADN et traitement du gel...III 1.3.2. Synthèse de la sonde ADN radioactive...III 1.3.3. Hybridation de la sonde et détection... IV 2. Criblage d’une bibliothèque construite dans le phage X.ZAP... IV

2.1. Préparation des plages de lyse... FV 2.2. Transfert de l’ADN phagique... FV 2.3. Synthèse d’une sonde ADN radioactive...V 2.4. Criblage de la bibliothèque...V 2.5. Excision in vivo de l’ADN du phage A.ZAP...VI 3. Criblage d’une bibliothèque d’ADN génomique de souris... VI 3.1. Synthèse d’une sonde ADN radioactive... VI 3.2. Criblage de la bibliothèque... VI 4. Transcription et traduction in vitro... VU 4.1. Transcription des sondes ARN antisens marquées non radioactivement... VII 4.2. Transcription d’ARNm synthétiques... VII 4.3. Transcription - traduction couplées in vitro...VIII 5. Oligos morpholinos antisens...VIII 6. Obtention et manipulation d’embryons...VIII 6.1. Obtention des embryons de A', laevis... VIII 6.1.1. Induction de la ponte... VIII 6.1.2. Dissection des testicules... IX 6.1.3. Fécondation in vitro et culture des embryons... IX 6.2. Obtention des embryons de X.tropicalis par fécondation in vivo...IX 6.3. Manipulation des embryons de Z laevis

XX. tropicalis... X 6.3.1. Micro-injection... X 6.3.2. Manipulation des embryons et dissection de calottes animales...XI 6.3.3. Fixation et révélation de l’activité enzymatique de la p-galactosidase...XI 6.4. Obtention et manipulation d’embryons de poulet et de drosophile... XI 7. Hybridations in situ sur embryons entiers... XII

7.1. Hybridation in situ simple ou double en couleur visible sur embryons de

xénope, de poulet et de souris... XII

7.2. Hybridation in situ simple en coulem visible sur embryons de drosophile... XIII

7.3. Hybridation in situ sur sections au cryostat d’embryons de souris...XV

8. Immunohistochimie... XVI

8.1. Immunohistochimie sur embryons entiers de xénope...XVI

8.2. Immunohistochimie sur embryons entiers de drosophile... XVI

8.3. Immunohistochimie sur cellules... XVII

9. Sections d’embryons...XVII

10. TUNEL... XVIII

11. RT-PCR sur les ARN totaux d’embryons de xénope...XVIII

12. Expérience de retard de migration sur gel (EMSA)...XVIII

13. Préparation, purification et analyse des protéines... XIX

13.1. Extraction de protéines... XIX

13.2. Immunoprécipitation...XIX

13.3. Analyse par Western Blot...XX

14. Bioinformatique... XX

ANNEXE II. BIBLIOGRAPHIE...I

ANNEXE III. PUBLICATION... 1

Abréviations

ADN Acide désoxyribonucléique

ADNc ADN complémentaire

AES Enhancer of split

ANB Anterior neural boundary ANR Anterior neural ridge

AP (tampon) Alkaline phosphatase buffer

ARN Acide ribonucléique

ARNm ARN messager

BBP BTB-BACK-PHR

BCL-6 yFl Binding protein isoform B bHLH Basic hélice-boucle-hélice BMB Boeringher Mannheim Blocking BMP Bone morphogenetic protein

BR-C Broad complex

BTB-POZ Bric a brac Tramtrack Broad Complex POx virus and Zinc Finger bZip Basic leucin zipper

Cellules ES Embryormic stem cells (cellules souches embryonnaires) C-terminal Carboxy-terminal

DEPC Diethyl pyrocarbonate

Dex Dexaméthasone

DKKl Dickkopf homolog 1

DMRT Doublesex and mab-3 Related transcription factor

DP Pallium dorsal

DSX Doublesex

DTA Diphtheria toxin A

DTT Dithiothreitol

dUTP Deoxyuridine triphosphate E(spl) Enhancer of split

El Enzyme d’activation de l’ubiquitination E2 Enzyme de conjugaison de l’ubiquitination E3 Enzyme de ligation de l’ubiquitination EBF EBF3 (early B-cell factor 3)

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (acide éthylène-diamine-tétraacétique) EMSA Electrophoretic mobility shift assays

Ep.keratin Epidermal keratin EST Expressed Sequence Tag

FGFs Fibroblast growth factor (facteur de croissance des fibroblastes) FITC Fluorescein isothiocyanate

GSK3 Glycogen synthase kinase 3

hCG Hormone gonadotropine chorionique humaine HIC Hypermethylated In Cancer

IGF Insulin-like growth factor),

IRIBHM Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie humaine et moléculaire Lge Eminence ganglionique latérale

LP Pallium latéral

MAPK Mbl MBS MEMFA Mge MO MOPS MP MR N-CoR Ngnr NRP/B N-terminal PBS PCR PHR PLZF PMSF PPE PVDF Rb RING Robo RT-PCR SDS-PAGE

Mitogen Activated Protein Kinase Masterblind

Modified bath saline

MOPS - EGTA - MGS04 - Formaldéhyde Eminence ganglionique médiane

Morpholino aligo-nucléotide

3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Palium médian

Modified Ringer’s solution Nuclear Receptor Corepressors Neurogénine

Nuclear restricted Protein Brain Amino-terminal

Phosphate bufFered saline Polymerase chain reaction PAM-Highwire-RPM-1

Promyelocytic leukemia Zinc Finger Phenylmethylsulphonyl fluoride Ectoderme préplacodal

Poly vinylidine fifluoride Rétinoblastome protein Really interesting new gene Roundabouts

Reverse transcriptase - polymerase chain reaction

Sodium Dodecyl Sulfate (Laurylsulfate de sodium) - polyacrylamide gel electrophoresis

sFRP Shh SMRT Su(H) TBST TdT TGF TRIS Tri TTk TUNEL VP Wnt XMYTl XNLK

Secreted frizzled related protein Sonic hedgehog

Silencing eidator for retinoid and thyroid hormone receptor Suppressor of Hairless

Tris-Buffered Saline Tween-20

Terminaldesoxynucolotidyl transferase Transforming grow factor

T ampon tris(hydroxyméthyl)aminométhane Trithorax-like

Tramtrack

Terminal desoxynucleotidy transferase mediated dUTP nick end labeling Pallium ventral

Wg (wingless, en français « sans aile ») et Int (intégration site) Xenopus Myelin transcription factor I

Xenopus nemo like kinase

Introduction

Introduction

Introduction

1. Les modèles animaux utilisés en biologie du développement

L’étude des mécanismes moléculaires contrôlant le développement embryonnaire nécessite en partie le recours à l’expérimentation animale. Un nombre restreint d’espèces sont utilisées en biologie du développement pour comprendre le développement embryonnaire.

Ces organismes sont désignés « organismes modèles », leur étude devant permettre de mieux comprendre le développement animal en général, y compris celui de l’homme. Les espèces modèles ont été choisies parce qu’elles présentent certains avantages expérimentaux. Chez les vertébrés, les modèles « classiques » sont le poisson zèbre, le poulet/caille, la souris et le xénope. Chez les invertébrés, ces sont le nématode et la drosophile.

1.1. Le xénope et la souris, deux organismes modèles majeurs chez les vertébrés

1.1.1. Généralités

Le genre Xenopus comprend une quinzaine d’espèces d’amphibiens anoures, exclusivement aquatiques, dont deux sont couramment utilisées dans les laboratoires : Xenopus laevis et Xenopus tropicalis. Ces deux espèces présentent de nombreux avantages : un élevage en laboratoire relativement aisé, la possibilité d’obtenir un grand nombre d’embryons qui sont par ailleurs facilement manipulables en raison de leur grande taille et d’un développement externe permettant l’observation des différentes étapes de l’embryogenèse. Enfin, la fécondation peut se faire in vitro en appliquant à la surface des œufs des fragments de biopsie testiculaire. X.laevis est l’espèce la plus répandue en laboratoire du fait de sa robustesse et de la grande taille de ses œufs. Cependant, cette espèce ne se prête pas aux études génétiques car elle est tétraploïde et présente un temps de génération relativement long (un an). C’est pour ces raisons que de plus en plus de laboratoires utilisent X. tropicalis, une espèce très proche de X. laevis, plus fragile, mais diploïde et mature sexuellement en quatre mois (Hirsch et al., 2002; Satou et al., 2005).

Le xénope est un modèle de choix pour les biologistes du développement étudiant les étapes précoces du développement des vertébrés. En effet, de nombreuses techniques sont disponibles pour étudier son développement embryonnaire. Les expériences d’hybridation in situ ou d’immunohistochimie sur embryons permettent de visualiser l’expression des gènes au

-1 -

Introduction

cours du temps. L’étude de leurs fonctions peut être abordée par des expériences de surexpression via la micro-injection d’ARNm. Des expériences de sous-expression peuvent également être réalisées via la micro-injection d’oligos morpholinos antisens qui, s’ils sont choisis au niveau de l’ATG initiateur de la traduction, bloquent la traduction d’im ARNm cible, ou encore, par la surproduction de formes tronquées de protéines fonctionnant comme

« dominants négatifs ». De plus, plusieurs techniques rapides et efficaces de transgenèse ont été développées chez le xénope (Kroll and Amaya, 1996; Allen and Weeks, 2005; Pan et al., 2006). La transgenèse permet notamment d’étudier la régulation transcriptionnelle des gènes in vivo ainsi que d’exprimer un gène d’intérêt de manière contrôlée spatialement et temporellement. En outre, des biopuces à ADN, de même qu’un grand nombre d’EST (Expressed Sequence Tag) sont disponibles pour Xlaevis et Xtropicalis. Le génome de Xenopus tropicalis est totalement séquencé.

La souris. Mus musculus est, en tant que mammifère, un des modèles animaux les plus proches de l’espèce humaine pour l’étude du développement. Malgré l’inaccessibilité des embryons post-implantation, la souris avec son cycle de développement court (9 semaines), constitue un modèle de choix pour les approches génétiques du développement. La souris a en effet joué un rôle primordial dans le développement de la génétique des mammifères, grâce notamment à l’existence d’une grande variété de lignées consanguines. De nombreuses mutations, survenues spontanément ou induites par des agents mutagènes, ont également fourni de précieux modèles pour l’étude des pathologies humaines. Actuellement, l’évolution des techniques nous permet de modifier le génome de la souris soit en ajoutant in vitro un ou plusieurs gènes, soit en invalidant un gène préalablement ciblé. C’est le cas de la technique du

« knockout », qui permet de remplacer par recombinaison homologue dans le génome un gène sauvage par une version mutée de celui-ci. Lors de l’utilisation de cette technique, différents problèmes peuvent être rencontrés. D’une part, les souris invalidées peuvent ne présenter aucime anormalité perceptible. C’est généralement le cas lorsqu’il existe dans le génome d’autres gènes présentant des fonctions similaires ou chevauchantes. Ce problème de redondance est très commun chez les vertébrés de par l’existence de nombreuses familles multigéniques. D’autre part, le phénotype des souris « knockout » peut être tellement sévère que les embryons meurent à des stades très précoces de leur développement empêchant ainsi l’analyse des fonctions ultérieures du gène. Une solution pour résoudre ce problème est de générer une souris « knockout » conditionnelle c'est-à-dire, ime souris où la modification génétique désirée ne se produit que dans un seul tissu ou organe. Le système conditioimel le

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Figure 1 : Cycle de vie de l’amphibien Xenopus laevis. Les stades de développement de X.laevis sont définis par les tables de Nieuwkoop et Faber. Le développement embryonnaire du xénope est subdivisé en différentes phases définies notamment sur base de critères morphologiques : la fécondation, le clivage, la gastrulation, la neurulation et l’organogenèse.

Après la période d’organogenèse, un à deux mois s’écoulent avant que le têtard n’entame sa

métamorphose pour former im xénope adulte. Ce dernier est mature sexuellement à l’age d’un

an. Les photographies montrent : en haut, un embryon au stade blastula (indication d’échelle :

0,5 mm); au milieu un têtard au stade 45 (indication d’échelle 1 mm) et en bas une grenouille

adulte (indication d’échelle 1 cm).

Introduction

plus couramment utilisé est le système « cre-lox ». Cre est une enzyme de recombinaison capable d’exciser des segments d’ADN flanqués de séquences d’ADN de 34 paires de bases désignées loxP. Dans ce système, deux lignées de souris doivent être générées. La première est une lignée dans laquelle le gène d’intérêt ou un exon essentiel de celui-ci est entouré de sites loxP. La seconde est une lignée transgénique dans laquelle l’enzyme de recombinaison Cre est exprimée sous la dépendance d’un promoteur spécifique d’un tissu. Lorsque ces deux lignées de souris sont croisées entre elles, le gène d’intérêt sera excisé dans la descendance, mais uniquement dans les tissus exprimant la Cre.

1.1.2. Le développement embryonnaire du xénope et de la souris

Le développement embryonnaire des vertébrés est subdivisé en différentes phases comparables chez tous les vertébrés, et définies notamment sur base de critères morphologiques. Ces différentes phases sont : la fécondation, le clivage, la gastrulation, la neurulation et l’organogenèse.

Chez le xénope, le zygote subit après la fécondation une série de divisions mitotiques sans accroissement de volume. Cette phase de clivage est suivie par l’apparition d’une cavité au sein de l’embryon, appelée blastocœle, qui définit le stade blastula (stade 8-9). Les différents stades de développement du xénope sont désignés par l’usage des tables de Nieuwkoop et Faber (Nieuwkoop and Faber, 1967). A ce stade, les différents feuillets primordiaux : ectoderme, mésoderme et endoderme sont déjà spécifiés. Les cellules du pôle animal forment l’ectoderme qui donnera naissance à l’épiderme et au système nerveux. Les cellules situées dans la région équatoriale correspondent au mésoderme d’où dériveront les muscles, le tissu conjonctif et les systèmes urogénital et vasculaire. Les cellules du pôle végétatif, quant à elles, constituent l’endoderme qui est à l’origine des systèmes respiratoire et digestif

Au cours de la gastrulation, un ensemble de mouvements cellulaires coordonnés remanient les blastomères de la blastula assurant la mise en place de la structure typique en trois feuillets primordiaux, avec l’ectoderme externe, l’endoderme interne et le mésoderme pris en sandwich entre l’ectoderme et l’endoderme. La gastrulation débute au stade 10, lorsqu’un groupe de cellules endodermiques situées à la limite du mésoderme présomptif dorsal, s’invaginent dans l’embryon, provoquant l’apparition d’une encoche, dite lèvre blastoporale. L’encoche s’allonge alors latéralement pour rapidement former un cercle complet, le blastopore. Au cours de la gastrulation, les tissus s’invaginent au niveau du

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Figure 2 : Cycle de développement de la souris. Les photographies montrent : en haut, un

zygote juste avant la première division (indication d’échelle : 10 pm); au milieu une vue

antérieure d’un embryon 8 jours après la fécondation (indication d’échelle 1 mm) et en bas un

embryon 14 jours après la fécondation.

Introduction

blastopore circulaire, l’invagination étant plus importante du côté dorsal que du côté ventral.

Au cours de cette invagination, les cellules du pôle animal s’étalent progressivement pour recouvrir l’ensemble de la surface de l’embryon. Les cellules du mésoderme se séparent de l’endoderme et forment une couche distincte entre l’ectoderme et l’endoderme. Les cellules du mésoderme dorsal subissent un processus actif d’intercalation cellulaire appelé extension convergente qui contribue à la fermeture progressive du blastocœle et à l’allongement de l’embryon. Une nouvelle cavité remplace le blastocœle : l’archentéron correspondant au tube digestif primitif. En fin de gastrulation, l’embryon possède un véritable axe antéro-postérieur qui s’étend du bord antérieur du mésoderme au blastopore résiduel.

Au cours de la neurulation, l’ébauche du système nerveux se met en place dans la partie dorsale de l’ectoderme de l’embryon. Elle débute au stade 13 avec l’épaississement de l’ectoderme dorsal qui formera la plaque neurale. Les bords de celle-ci se soulèvent et se rejoignent, formant ainsi le tube neural. En fin de neurulation, aux stades 20-22, les principales structures recoimaissables sont le tube neural, la corde, les somites, l’intestin primitif et le mésoderme latéral.

Au stade bourgeon caudal, débute la phase d’organogenèse durant laquelle le système nerveux central se divise en trois vésicules, prosencéphale, mésencéphale et rhombencéphale, qui formeront par la suite les cinq lobes du cerveau. Les vésicules otiques, optiques, les arcs branchiaux, le rein embryoïmaire, le cœur et le tube digestif et ses glandes aimexes apparaissent également. Le système circulatoire se met en place et les cellules pigmentées se différencient.

Après la phase d’organogenèse, le têtard de X. laevis se métamorphose (environ 2-3 mois après la fécondation) donnant une forme adulte strictement aquatique (Fig. 1).

Chez la souris, la rencontre des gamètes a lieu dans l’oviducte où se produisent également les divisions précédant l’implantation du blastocyste dans la paroi de l’utérus (5 jours après la fécondation). La gastrulation et l’organogenèse se font ensuite sur une période de 7 jours environ, et les 6 jours qui restent avant la naissance sont avant tout une période de croissance. Après la gastrulation, l’embryon entreprend une rotation complexe au cours de laquelle il s’enroule dans ses membranes extra-embryonnaires. Les différents stades du développement de la souris sont caractérisés en «jours embryormaires » (E). Les souris s’accouplant dans le noir, l’âge des embryons est généralement exprimé en jours et demi (Fig.2).

-4-

Figure 3 : Cycle de reproduction de Drosophila melanogaster. Après la segmentation et la

gastrulation, le corps de l’embryon se segmente, et à l’éclosion, la larve libérée est capable de

se nourrir. Elle grandit, subit 2 mues et forme ensuite une pupe qui se métamorphose en une

mouche adulte. La photographie du haut montre un ovule de Drosophila, avec les

spermatozoïdes qui entrent par le micorpyle; les filaments sur la face dorsale sont des stmctures

extra-embryonnaires. La photographie du milieu présente une larve de deuxième stade et celle

du bas, une pupe. Indication d’échelle: 0,1 mm.

Introduction

1.2. La drosophile, un organisme modèle incontournable chez les invertébrés

1.2.1. Généralités

La drosophile, Drosophila melanogaster, ou encore « mouche du vinaigre » est un diptère très étudié en biologie du développement. En effet, la richesse des études génétiques sur le développement de la drosophile associée à la facilité de combiner manipulations génétiques et microchirurgie, a fait de cette petite mouche l’un des modèles de développement les mieux compris. Cet organisme modèle présente de nombreux avantages : petite taille, élevage facile en laboratoire, temps de génération court (2 à 3 semaines), grand nombre d’embryons (les femelles peuvent pondre jusqu’à 500 œufs en 10 jours), développement externe et génome relativement simple ne présentant que 4 chromosomes (3 autosomiques et un sexuel). Enfin, des méthodes de transformation génétique efficaces sont disponibles basées sur l’utilisation d’un élément transposable apparaissant naturellement dans certaines lignées de drosophile, l’élément P. Ces éléments P peuvent s’insérer presque n’importe où sur un chromosome et peuvent également se déplacer d’un site chromosomique à un autre au sein de la lignée germinale. Pour cela, l’élément P nécessite une transposase qui régule et catalyse son excision. La transposase coupe au niveau de dexix sites de reconnaissance dans l’ADN, et réintroduit aléatoirement le fragment d’ADN ainsi excisé dans le génome. Les éléments P sont donc utilisés pour introduire un gène intéressant dans la lignée germinale de Drosophile.

Ils sont également efficacement utilisés en tant que mutagènes. En effet, leur insertion en de multiples positions du génome peut provoquer des mutations de séquences codantes.

1.2.2. Le cycle de reproduction de la drosophile

Malgré la diversité des développements des différents types d’invertébrés, on retrouve des caractéristiques communes non seulement à l’ensemble des invertébrés, mais aussi aux vertébrés ; c’est le cas de la segmentation, de la formation d’une blastula, et de la gastrulation.

Le cycle de vie de la drosophile dure environ 2 semaines à 25°C. Après une phase d’embryogenèse et d’organogenèse de 24 heures, l’œuf donne naissance à une larve de premier stade. Cette larve se nourrit et accroît sa masse corporelle en passant par deux stades larvaires supplémentaires séparés par des mues. Les premier, deuxième et troisième stades larvaires durent respectivement 24, 24 et 48 heures. À la fin du troisième stade larvaire, la larve cesse de s'alimenter, s'immobilise et forme une nymphe, appelée pupe. C'est pendant la phase pupale qu'intervient la métamorphose au cours de laquelle la plupart des tissus larvaires

-5-

Gastrula pigmentée

Gastrula non pigmentée

antérieure

blastopore

NEURULATION

Figure 4 : Représentation schématique des expériences de transplantation de Spemann et

Mangold. La lèvre dorsale du blastopore d’un embryon de xénope pigmenté au stade gastrula

est greffée sur la partie ventrale d’un autre embryon albinos au même stade. L’embryon hôte

développe un deuxième axe dorsal complet avec une polarité antéro-postérieure et dorso-

ventrale correcte.

Introduction

sont lysés. C’est également durant cette phase que les tissus adultes se développent à partir de petites structures appelées disques imaginaux et déterminées depuis la fin de l'embryogenèse.

La phase pupale dure environ 5 jours et s'achève avec l'éclosion d'un insecte adulte (Fig. 3).

2. Le développement du système nerveux

2.1. Mécanismes moléculaires impliqués lors de l’induction neurale

Spemann et Mangold (1924) ont montré chez le xénope, que la greffe de la lèvre dorsale du blastopore dans la partie ventrale d'une jeune gastmla conduisait à la formation d'un second axe embryonnaire complet contenant un tube neural parfaitement organisé. Les cellules constituant le tube neural surnuméraire sont toutes issues de l'ectoderme ventral de l'hôte. Les cellules ectodermiques de la jeune gastrula ont donc été induites en cellules neurales par le mésoderme dorsal greffé (Fig.4).

La recherche des signaux moléculaires responsables de cette induction du système nerveux a conduit à un modèle d’induction neurale « par défaut ». En effet, contrairement à ce que l’on pensait initialement, les molécules inductrices provenant de l’organisateur n’agissent pas directement sur les cellules qui formeront le tissu nerveux, mais en bloquant des molécules qui instruisent activement les cellules de l’ectoderme à se différencier en épiderme (Hemmati-Brivanlou and Melton, 1992; Hemmati-Brivanlou et al., 1994; Hemmati-Brivanlou and Melton, 1994). La protéine BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4), qui fait partie de la super-famille des protéines de type TGPp (Transforming Grow Factor-P) est le facteur induisant les cellules de l’ectoderme à se différencier en épiderme. BMP4 est exprimé initialement dans tout l’ectoderme, et la perte de fonction de ce gène par micro-injection d’ARNm codant pour une forme dominant négative du récepteur BMP4 provoque la différenciation des cellules en cellules neurales (Xu et al., 1995).

Via différentes approches, plusieurs protéines sécrétées produites spécifiquement dans l’organisateur et jouant un rôle crucial dans l’induction neurale ont été identifiées. Parmi celles-ci, citons les protéines Noggin (Lamb et al., 1993), Chordin (Sasai et al., 1994), Follistatin (Hemmati-Brivanlou et al., 1994), Cerberus (Bouwmeester et al., 1996) et Xnr3 (Hansen et al., 1997). Bien que ne présentant aucune similitude de séquences entre elles, ces molécules induisent la différenciation des cellules de l’ectoderme dorsal en cellules neurales de la même façon, c'est-à-dire, en liant les BMPs et en bloquant leur interaction avec leurs récepteurs. Récemment, il a été montré que d’autres voies de signalisation sont également impliquées dans la formation initiale du tissu neural. Les signaux FGF et IGF contribueraient

-6-

Introduction

à la formation du tissu neural en activant la voie MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) qui phosphoryle Smadl, un effecteur clef de la voie de transduction des BMPs, au niveau de sa région centrale, entraînant son ubiquitination et sa dégradation (Pera et al., 2003; De Robertis and Kuroda, 2004; Fuentealba et al., 2007). La protéine kinase GSK3 (Glycogen Synthase Kinase 3), l’enzyme clef de la voie de signalisation Wnt, phosphoryle également la région centrale de Smadl, induisant également sa dégradation (Fuentealba et al., 2007).

2.2. Mécanismes moléculaires contrôlant la régionalisation antéropostérieure du tissu neural

La régionalisation antéropostérieure du tissu neural a lieu au même moment que l’induction neurale. Et tout comme l’induction neurale, elle nécessite une combinaison de différents facteurs. L’inhibition des BMP par chordin, noggin et follistatin induit du tissu neural antérieur (de type prosencéphale), mais pas de tissu postérieur tels que le mésencéphale, le rhombencéphale ou la moelle épinière (Harland, 2000).

Afin d’expliquer comment la régionalisation antéropostérieure neurale est établie, Nieuwkoop (1952) a proposé un mécanisme permettant la formation du tissu neural postérieur, par des signaux provenant du mésoderme, en deux étapes. Lors de la première étape, appelée étape d’activation, des signaux neuralisants induisent uniquement du tissu neural antérieur. Ensuite, un second signal, ou signal postériorisant, convertit ce tissu neuralisé en du tissu neural plus postérieur. Cette deuxième étape est appelée étape de transformation. Trois facteurs peuvent être impliqués dans le développement du système nerveux postérieur: FGF, Wnt et l’acide rétinoïque (Cox and Hemmati-Brivanlou, 1995;

Lamb and Harland, 1995; McGrew et al., 1995; Lumsden and Krumlauf, 1996; Blumberg et al., 1997; Holowacz and Sokol, 1999; Kudoh et al., 2002).

Plus récemment, il a été montré chez le xénope, que la mise en place de l’axe antéropostérieur de la plaque neurale est également régulée par un gradient de signalisation Wnt/p-cathénine (Kiecker and Niehrs, 2001; Nordstrom et al., 2002). Dans l’embryon, ce gradient est élevé postérieurement, et faible antérieurement, suite à la présence de domaines d’expression de Wnt et d’inhibiteiuï de Wnt respectivement postérieurs et antérieurs. La source antérieure des antagonistes de Wnt est formée au niveau de l’endomésoderme antérieur avec l’expression de cerberus (Bouwmeester et al., 1996), sFRP (Leyns et al., 1997; Wang et al., 1997) et Dkkl (Glinka et al., 1998). Trois arguments supportent la théorie selon laquelle les antagonistes de Wnt jouent un rôle central lors de la spécification antérieure.

Premièrement, la co-expression des antagonistes de Wnt et Bmp induit la formation d’une tête

-7-

A

Plaque neurale Repliement de la plaque neurale

Formation du tube neural

Neurones sensoriels

B

Neurones sensoriels

Neurones intennédiaires

Neurones moteurs

Figure 5 : La neurogenèse primaire. (A) Représentation schématique de la formation du tube neural. Au sein de la plaque neurale ouverte se définissent trois domaines proneuraux où naissent les trois types de neurones primaires : les neurones moteurs (en rouge), les neurones intermédiaires (en vert) et les neurones sensoriels (en bleu). Au cours de la neurulation, la plaque neurale converge en son axe médian pour former, après fermeture, le tube neural. (B) Hybridation in situ avec le marqueur des neurones primaires N-tubuline.

Figure 6 : Représentation schématique de la cascade d’activation des gènes proneuraux

sous le contrôle de l’inhibition latérale. Le gène XNgnr-1 est le premier gène exprimé dans

les cellules progénitrices neurales qui sont destinées à devenir des neurones. Il induit

l’expression en cascade de gènes codant pour des protéines de types bHLH ou non bHLH, et

qui permettront la différentiation neuronale. Dans d’autres cellules, cette cascade d’activation

est inhibée par la voie de signalisation Notch (inhibition latérale).

Introduction

ectopique comprenant un système nerveux central antérieur, alors que les antagonistes de Bmp seuls induisent vmiquement des stmctures du tronc (Glinka et al., 1997; Glinka et al., 1998). Deuxièmement, la surexpression d’inhibiteurs de Wnt dans des embryons de xénope et de poisson zèbre induit la formation d’un prosencéphale et d’une tête hypertrophiée (Glinka et al., 1997; Leyns et al., 1997; Wang et al., 1997; Glinka et al., 1998; Deardorff et al., 1998;

Fekany-Lee et al., 2000; Hashimoto et al., 2000; Shinya et al., 2000). Enfin, troisièmement, des études de perte de fonction ont montré que les inhibiteurs de Wnt sont nécessaires pour la formation des structures neurales antérieures. L’inactivation de l’antagoniste de Wnt, Dickkopfl (Dkkl) dans des embryons de xénope (Glinka et al., 1998), ou la délétion du gène Dkkl chez la souris (Mukhopadhyay et al., 2001) conduit à la formation d’embryons microcéphaliques.

2.3. Le contrôle de la neurogenèse chez le xénope

Au stade neurula, le tissu neural forme la plaque neurale au sein de laquelle aura lieu la neurogenèse. Celle-ci se déroule en deux phases. La première phase, qui commence dès la fin de la gastrulation, donne naissance aux neurones primaires nécessaires à la coordination des mouvements natatoires du têtard. La seconde phase prend place plus tardivement, approximativement au stade 46, et donne naissance à des neurones secondaires qui contribueront au système nerveux de l’adulte et remplaceront en grande partie les neurones primaires.

2.3.1. La neurogenèse primaire

A la fin de la gastrulation, un certain nombre de cellules du neurectoderme cessent de se diviser et commencent à se différencier en neurones primaires. Ces neurones apparaissent en pointillés dans trois bandes longitudinales et symétriques de part et d’autre de la ligne dorsale médiane de la plaque neurale. Les bandes médianes, intermédiaires et latérales de neurones correspondent respectivement aux neurones moteurs, intemeurones et neurones sensoriels (Chitnis and Kintner, 1995; Chitnis et al., 1995) (Fig.5).

2.3.2. La cascade d’activation des gènes proneuraux et le mécanisme d’inhibition latérale

Au cours de la neurogenèse, un certain nombre de cellules pluripotentes du neurectoderme commencent à se différencier en neurones suite à l’activation de l’expression de gènes appelés «gènes proneuraux». Les gènes proneuraux tels que XNgnr-1 (Xenopus

-8-

A

précurseurs neuronaux inhibition latérale différentiation cellulaire

indifférenciés neurones (rouge)

et cellules gliales (vert)

B

X-Nrgn-l

i

XDelta

ICD

i

ICD

7"

Cytoplasme

Cytoplasme

Noyau ICD

E(spl)R XSu(H)

________________________

E(spl)R

X-Nrgn-l

Figure 7 : L’inhibition latérale. (A) Représentation schématique du mécanisme d’inhibition latérale. Au sein d’un groupe de précurseurs neuronaux non différenciés, une cellule entre dans le processus de différenciation neuronale. L’expression des gènes proneuraux est activée et le mécanisme d’inhibition latérale médié par la voie de signalisation Notch est déclenché.

L’inhibition latérale permet donc d’établir autour d’un neurone différencié un ensemble de

cellules maintenues à l’état indifférencié. (B) Représentation schématique de la voie de

signalisation Notch.

Introduction

Neurogenin related-1) et Xashl, codent pour des facteurs de transcription à domaine de liaison à l’ADN de type bHLH (basic hélice-boucle-hélice) (Lee et al., 1995; Kim et al., 1997;

Takebayashi et al., 1997; Kanekar et al., 1997; Ma et al., 1998). Ces gènes activent l’expression d’autres gènes codant pour des facteurs de transcription bHLH (NeuroD, Ebf2, Ebf3,...) (Lee et al., 1995; Dubois et al., 1998; Pozzoli et al., 2001) ou des protéines à doigts à zinc (XMytl,XNKL,...) (Belleffoid et al., 1996; Lamar et al., 2001) impliqués dans la progression de la différenciation des cellules progénitrices neurales en neurones. Les gènes proneuraux inhibent également leur propre expression dans les cellules adjacentes, empêchant celles-ci de se différencier via un processus appelé « inhibition latérale » (Fig.6). Cette inhibition est due à l’activation par les facteurs proneuraux de l’expression du gène XDelta-1 (Chitnis and Kintner, 1996) codant pour une protéine transmembranaire fonctionnant comme ligand pour le récepteur Notch (Coffman et al., 1990). L’interaction du ligand Delta-1 et du récepteur Notch-1 entraîne le clivage du domaine intracellulaire de Notch-1 (Notch/ICD) (De Strooper B. et al., 1999). Le peptide Notch/ICD est alors transloqué dans le noyau où il interagit avec le facteur de transcription à doigts à zinc Su(H) (Suppressor of Hairless) (Wettstein et al., 1997). En l’absence du peptide Notch/ICD, le facteur Su(H) est associé à un complexe répresseur transcriptionnel (Kao et al., 1998). L’interaction entre Notch/ICD et Su(H) transforme ce dernier en un activateur transcriptionnel induisant l’expression des gènes de la famille E(spl) (Enhancer of Split) (Wettstein et al., 1997). Ces gènes codent pour des facteurs de transcription bHLH répresseurs qui inhibent la transcription du gène Ngnr-1. La cascade d’activation des gènes proneuraux dans la cellule est donc bloquée, et la différenciation neuronale inhibée. Les cellules dont la différenciation en neurones primaires est inhibée donneront plus tardivement au cours du développement des cellules gliales ou des neurones secondaires (Fig.7). Des expériences de surexpression par micro-injection d’ARNm suivies d’une analyse par hybridation in situ des embryons injectés montrent que l’injection d’une forme mutante constitutivement active de Notch-1, correspondant au domaine intracellulaire du récepteur XNotch-1 (Notch/ICD), bloque de manière drastique la neurogenèse (Wettstein et al., 1997). Inversement, l’injection d’un peptide correspondant à une forme tronquée de XDelta-1 (XDelta-1 ^*“) qui agit comme un mutant dominant négatif, augmente le nombre de neurones dans les domaines proneuraux (Chitnis et al., 1995).

-9-

’mlcule Mique

Mésencéphale Mésencéphale

My^encéphale 1 /

IBsxîDg)^ [I)3xnjip6iD senxiM

jeune

Figure 8 : Représentation schématique du plan de base du cerveau de vertébré.

Introduction

2.4. Le télencéphale

Au début du stade bourgeon caudal chez le xénope, le cerveau se divise antéropostérieurement en trois vésicules primaires : le prosencéphale, le mésencéphale et le rhombencéphale. A mesure que l'organogenèse progresse, le prosencéphale et le rhombencéphale se subdivisent respectivement en télencéphale et diencéphale d'xme part et en métencéphale et myélencéphale d'autre part. Le mésencéphale ne génère pas d'autre vésicule.

Le plan de base du cerveau de vertébré avec ses 5 vésicules fondamentales est alors constitué (Fig.8).

2.4.1. Mécanismes moléculaires contrôlant la mise en place du télencéphale Bien que le modèle en deux étapes (activation - transformation) de Nieuwkoop soit suffisant pour expliquer comment le système nerveux central est subdivisé en ses principales régions (prosencéphale, mésencéphale, rhombencéphale et moelle épinière), il n’explique pas comment le prosencéphale est lui même sous-régionalisé. En fait, lors de la mise en place du télencéphale, l’inhibition de la voie de signalisation des BMPs est notamment associée à une inhibition des voies de signalisation Wnt et Nodal.

Les voies de signalisation provenant de l’ANB (Anterior Neural Boundary), correspondant à la rangée de cellules la plus antérieure du neurectoderme, permettent l’expression de gènes du télencéphale (Houart et al., 2002). En effet, plusieurs gènes exprimés dans l’ANB codent pour des protéines sécrétées impliquées dans la régionalisation antérieure de la plaque neurale. Chez le poisson zèbre, une des protéines sécrétées responsable de l’activité de l’ANB est Tic (Houart et al., 2002), un membre de la famille des sFRP (secreted frizzled Related Protein). Les protéines de la famille des sFRP agissent comme des antagonistes de Wnt (Uren et al., 2000). Des cellules exprimant Tic peuvent par exemple restaurer une identité télencéphalique dans des embryons ne possédant pas d’ANB. Tic est également capable d’induire l’expression de gènes télencéphaliques dans des territoires de la plaque neurale normalement destinés à devenir du diencéphale ou du mésencéphale.

L’établissement de l’identité télencéphalique requiert donc une suppression locale de l’activité des Wnt. Cela a également été montré dans des embryons de poisson zèbre mutants masterblind (mbf^). Ceux-ci portent une mutation dans une des protéines de la voie de signalisation Wnt, et ne possèdent pas de télencéphale (Heisenberg et al., 2001; van de Water S. et al., 2001). Il en va de même chez des poissons zèbres mutants pour Tcf3, un répresseur transcriptionnel des gènes cibles de Wnt (Kim et al., 2000). D’autres études chez le poulet et la grenouille ont également montré que le télencéphale est établi dans un domaine de faible

- 10-

Prosencéphale

Diencéphale

Pallium médian MP

Hippocampe

f

Telencéphale

Pallium (dorsal)

Pallium Pallium dorsal DP latéral LP

Isocortex Cortex olfactif et une

partie de l’amygdala

Pallium ventral VP

Claustrum et l’autre partie de

l’amygdala

Subpallium (ventral)

Eminescence Eminescence ganglionique ganglionique

latérale médiane

I I

Striatum Pallidium

Figure 9 : Récapitulatif des différentes subdivisions du prosencéphale.

Introduction

activité de Wnt (Kiecker and Niehrs, 2001; Lupo et al., 2002; Nordstrom et al., 2002). De même, chez la souris, l’absence de Six3 dans le prosencéphale en développement conduit à une augmentation locale de l’activité Wnt causant la perte des tissus télencéphaliques (Lagutin et al., 2003).

L’inhibition de la voie de signalisation Nodal est également nécessaire au développement du prosencéphale (Piccolo et al., 1999). L’étude d’embryons de poisson zèbre déficients pour Nodal confirme que la voie de signalisation Nodal empêche le développement du télencéphale. En effet, des poissons mutants pour Nodal présentent un prosencéphale élargi (Gritsman et al., 1999).

2.4.2. Régionalisation dorso-ventrale du télencéphale

Chez tous les vertébrés, le télencéphale en développement est subdivisé en un territoire ventral et dorsal, respectivement appelé subpallium et pallium. Le pallium est subdivisé en quatre régions qui donneront dans le cerveau adulte : le pallium médian (MP, futur hippocampe), le pallium dorsal (DP, ou isocortex), le pallium latéral (LP, futur cortex olfactif et une partie de l’amygdala) et le pallium ventral (VP, le claustrum et l’autre partie de l’amygdala). Le subpallium comprend deux subdivisions : les éminences ganglioniques latérales et médianes (Ige et mge) qui donneront respectivement le striatum et le pallidum (Fig.9).

Les régions dorsales et ventrales du télencéphale peuvent être distinguées par différents profils d’expression de gènes. De plus, des analyses génétiques montrent que ces gènes participent à la spécification et à l’identité des territoires télencéphaliques dans lesquels ils sont exprimés, et peuvent donc être considérés comme des gènes clefs de la régionalisation.

En effet, leur inactivation chez les mammifères conduit à une altération des principales subdivisions du prosencéphale (Schuurmans and Guillemot, 2002; Bachy et al., 2002). Par exemple, les gènes Emx qui sont exprimés dans le télencéphale dorsal affectent le développement du cortex (Yoshida et al., 1997). De plus, il a été montré que Emx2 est une cible transcriptionnelle directe des voies de signalisation Wnt et BMP dans le télencéphale dorsal (Theil et al., 2002). Les voies de signalisation BMP et Wnt ne sont donc pas uniquement nécessaires à l’établissement initial des destinées antérieures, mais jouent également un rôle important plus tard au cours de la mise en place des différentes subdivisions du prosencéphale. Au contraire, les gènes Dix sont restreints au télencéphale ventral, et leur perte de fonction cause des défauts au niveau du striatum (Anderson et al., 1997). De même, la perte de fonction de Nkx2.1 conduit à une transformation dorso-ventrale

- 11 -

B

^ nruni plate 0 neural crest

©PPE O cpidermis

Figure 10 : (A) Représentation schématique, sur un embryon de xénope au stade 16, des 4 domaines ectodermiques : la plaque neurale (bleu), la crête neurale (vert clair), le PPE (vert foncé) et l’épiderme (jaune). (B) Hybridation in situ montrant le profil d’expression de sixl exprimé dans tout le PPE. (Moody, 1987)

Figure 11 : Représentation schématique des différentes placodes sur un embryon de

xénope au stade bourgeon caudal. (Schlosser and Northcutt, 2000)

Introduction

du pallidum (Sussel et al., 1999). Chez les souris Pax6'^\ la bordure pallio-subpalliale est déplacée dorsalement, et le subpallium est élargi aux dépends du pallium (Bishop et al., 2000;

Toresson et al., 2000; Yun et al., 2001). Nkx2.1 et Pax6 sont donc également des régulateurs essentiels du pallidum et du pallium, et ont pour fonction la spécification des subdivisions télencéphaliques.

La subdivision du télencéphale par l’expression régionalisée de différents facteurs de transcription est suivie par la différenciation de plusieurs types de neurones dans chacune de ces subdivisions. Dans le télencéphale ventral, les neurones sont de type GABA-ergiques (y- amino butyric acid) et sont caractérisés par l’expression des protéines Dlx5, Dlx6, Nkx2.1, Lhx6 et Lhx7 (Grigoriou et al., 1998; Puelles et al., 2000; Wilson and Rubenstein, 2000;

Marin et al., 2000). Le cortex cérébral quant à lui comporte des neurones glutamatergiques provenant de progéniteurs télencéphaliques dorsaux. Ces neurones expriment Tbrl ainsi que plusieurs protéines bHLH telles que NeuroD, NeuroD2, Math2 et MathS (Fode et al., 2000;

Pleasure et al., 2000).

3. Induction et spécification des placodes

Lors de la gastrulation, l’ectoderme embryonnaire est séparé en plusieurs domaines qui auront des destinées différentes. Il s’agit de la plaque neurale, de la crête neurale, de l’ectoderme préplacodal (PPE), et de l’épiderme. Les placodes dérivent toutes du PPE qui entoure la partie antérieure de la plaque neurale (Fig. 1 OA). Dans la région antérieure du PPE un sous-domaine appelé ANR (Anterior Neural Ridge), à partir duquel se développent les placodes olfactives et certains tissus du prosencéphale, peut être défini. Plusieurs types de placodes peuvent être distinguées : adénohypophysaires, olfactives, cristallines, « profundal », trigéminales, épibranchiales, hypobranchiales, les placodes de la ligne latérale et les placodes otiques (Fig.ll). La plupart de ces placodes sont présentes chez tous les vertébrés. Cependant, les placodes hypobranchiales ne se retrouvent que chez les amphibiens. De plus, à l’exception des placodes adénohypophysaires et cristallines, toutes les placodes sont neurogéniques.

3.1. Gènes qui spécifient la destinée d’ectoderme préplacodal

Un grand nombre de facteurs de transcription sont exprimés dans les différentes placodes, cependant, seules deux familles de gènes {six et eyà) sont exprimées dans tout le PPE et ce dès le début de sa formation (Fig.lOB). Plusieurs études récentes ont montré que les gènes six et eya sont nécessaires à la spécification du PPE.

- 12-

Figure 12 : Les frontières entre les 4 domaines ectodermiques peuvent être formées par

des interactions de répressions mutuelles. La colonne de gauche montre des hybridations in

situ sur des embryons de xénope avec des ARNm pour ker, sixl, foxD3 et sox2 qui sont

respectivement des marqueurs de l’épiderme, du PPE, de la crête neurale et de la plaque

neurale. Zic2 et dlx6, deux gènes de bordure y sont également présentés. La colonne de droite

résume les expériences qui ont démontré que sixl peut maintenir une destinée préplacodale en

réprimant et en étant réprimé par les gènes exprimés dans les autres domaines (Moody, 1987).

Introduction

Les gènes six codent pour des facteurs de transcription à homéodomaine qui lient directement l’ADN. Chez les vertébrés, ils sont groupés en trois sous-familles : sixl/2, six4/5 et six3/6 sur base de variations de séquences. Sixl/2 et six4/5 mais pas six3/6 présentent une expression dans tout le PPE. Les facteurs de transcription Six peuvent fonctionner à la fois comme activateurs ou répresseurs transcriptionnels en fonction des co-facteurs avec lesquels ils interagissent. Sixl joue un rôle central dans le développement du PPE et des placodes.

Chez le xénope, des expériences de sous-expression par l’injection de morpholinos bloquant la traduction de sixl conduisent à la perte de l’expression des marqueurs du PPE, ainsi qu’à une augmentation des marqueurs adjacents de l’épiderme {Ep.keratin) et de la crête neurale (foxD3) (Bmgmann et al., 2004). L’injection d’ARNm codant pour Sixl augmente quant à elle le domaine d’expression de marqueurs du PPE (soxll, eyd) et réprime les domaines d’expression de l’épiderme et de la crête neurale. La surexpression du gène sixl promeut donc l’expression des gènes du PPE aux dépends des gènes de l’épiderme et de la crête neurale (Fig.l2).

Les gènes eya codent quant à eux pour des facteurs qui agissent comme des co­

activateurs transcriptionnels des gènes six. Tous les gènes eya à l’exception de eya3 sont largement exprimés dans les placodes (Schlosser, 2006), et chez le xénope et le poisson zèbre, le domaine d’expression du gène eyal est très similaire à celui de sixl.

3.2. Voies de signalisations responsables de la formation de l’ectoderme préplacodal

Puisque la crête neurale et les placodes dérivent toutes les deux de l’ectoderme qui entoure la plaque neurale, et que ces deux tissus contribuent au système nerveux périphérique, il a été suggéré que les placodes puissent être induites par des mécanismes similaires à ceux induisant la crête neurale.

3.2.1. Rôle de la voie de signalisation BMP

Une concentration graduelle en BMP régionalise l’ectoderme en différents sous domaines, l’épiderme se formant à de fortes concentrations en BMP, la plaque neurale à de faibles concentrations, et la crête neurale à des niveaux intermédiaires. Le PPE se développant entre la crête neurale et l’épiderme, il se formerait également à une concentration intermédiaire en BMP. En effet, l’injection d’ARNm codant pour les antagonistes de BMP, Noggin et Cerbems, induit l’expression de sixl dans des expiants animaux de xénope (Bmgmann et al., 2004). La voie de signalisation des BMP doit donc être réduite dans

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Introduction

l’ectoderme embryonnaire pour que l’expression des gènes du PPE soit possible. De plus, lorsque des expiants sont mis en culture en présence de différentes concentrations en Noggin, six] et eyal sont fortement exprimés à de faibles concentrations. Par contre, leur expression diminue fortement lorsque la concentration en Noggin augmente, que ce soit à un niveau intermédiaire qui induit les gènes de la crête neurale, ou encore à un niveau plus élevé qui induit les gènes de la plaque neurale (Brugmann et al., 2004). Les gènes qui sont caractéristiques de la plaque neurale, de la crête neurale et du PPE sont donc induits dans des expiants ectodermiques à différentes concentrations en antagonistes de BMP.

3.2.2. Rôle de la signalisation antéro-postérieure

Bien que les gènes sixl et eyal soient induits dans des expiants de calottes animales en réponse à une concentration appropriée en antagonistes de BMP, en embryons cela n’est possible que si un axe secondaire antéro-postérieur est induit par une expression ectopique de Noggin ou de Chordin. L’induction du PPE est donc liée à la formation d’un axe antéro­

postérieur (Brugmann et al., 2004; Ahrens and Schlosser, 2005). De plus, l’induction de la crête neurale, qui est positionnée en bordure de la plaque neurale, à l’exception de sa région la plus antérieure, nécessite les mêmes voies de signalisation que celles qui établissent la postériorisation de la plaque neurale (FGF, Wnt et acide rétinoïque). De ce fait, il est possible que le PPE, exclusivement localisé à la bordure antérieure de la plaque neurale soit négativement régulé par ces signaux postériorisants. En effet, il a été démontré à la fois en expiants de calottes animales et en embryons, que la répression des voies de signalisation Wnt ou FGF étend le domaine d’expression de sixl. Inversement, l’activation des signalisations Wnt ou FGF diminue son domaine d’expression (Brugmann et al., 2004). En conclusion, alors que l’induction de la crête neurale requiert des signaux postériorisants, le PPE, quant à lui ne se développe qu’en l’absence de ces signaux. Cette différence de réponse de la crête neurale et du PPE aux signaux postériorisants explique pourquoi la crête neurale ne se forme jamais dans la partie la plus antérieure de la tête, et pourquoi les placodes ne se retrouvent jamais dans le tronc.

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Introduction

4. Les protéines à domaine BTB-POZ

4.1. Le domaine BTB-POZ

Le domaine BTB-POZ (Bric a brac Tramtrack Broad complex POx virus and Zinc finger) est un domaine hydrophobe de 120 acides aminés présent à l’extrémité amino­

terminale d’un grand nombre de protéines participant à une variété de processus biologiques différents tels que la régulation transcriptionnelle, la structure de la chromatine, l’organisation du cytosquelette et la formation de canaux pour certains ions (Aravind and Koonin, 1999). Ce domaine est formé d’une succession de stmctures en feuillet^ et en hélices a, et permet des interactions entre protéines. Ces interactions peuvent être des homodimérisations, ou des hétérodimérisations avec des protéines contenant elles aussi un domaine BTB-POZ (Collins et al., 2001).

Le domaine BTB-POZ a été découvert lors de la comparaison des gènes Tramtrack (ttk) et BR-C de drosophile. Le gène ttk code pour deux répresseurs transcriptionnels à doigts de zinc p69 et p88, qui ne different que par leur domaine de liaison à TADN et qui sont requis pour le développement embryonnaire ainsi que pour la détermination de la destinée des cellules de l’œil. BR-C est quant à lui un gène intervenant dans la métamorphose. Il code pour quatre protéines partageant une extrémité amino-terminale commune qui correspond à la région de similarité avec les protéines TTK. Ce domaine a été par la suite retrouvé dans toute une série de protéines depuis la levure jusqu’aux mammifères et est donc hautement conservé au cours de l’évolution.

4.2. Différentes catégories de protéines à domaine BTB-POZ

Les domaines BTB/POZ sont généralement trouvés en copie unique associés à d’autres domaines conservés. En fonction des différents domaines associés, les protéines BTB/POZ peuvent être classées en plusieurs catégories. Pour chacime de ces catégories, nous décrivons ici quelques imes des protéines les mieux caractérisées afin d’illustrer la diversité fonctionnelle des membres de cette famille.

4.2.1. Protéines BTB-POZ possédant des domaines associés permettant la liaison à TADN

La première classe comprend les protéines liant TADN. Pour la plupart, il s’agit de facteurs de transcription possédant un motif de liaison à TADN de type doigt à zinc C

H

. Chez l’homme, 5 à 10% des protéines à doigt à zinc, qui constituent la plus grande famille de

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