Le télencéphale

Au début du stade bourgeon caudal chez le xénope, le cerveau se divise

antéropostérieurement en trois vésicules primaires : le prosencéphale, le mésencéphale et le

rhombencéphale. A mesure que l'organogenèse progresse, le prosencéphale et le

rhombencéphale se subdivisent respectivement en télencéphale et diencéphale d'xme part et en

métencéphale et myélencéphale d'autre part. Le mésencéphale ne génère pas d'autre vésicule.

Le plan de base du cerveau de vertébré avec ses 5 vésicules fondamentales est alors constitué

(Fig.8).

2.4.1. Mécanismes moléculaires contrôlant la mise en place du télencéphale

Bien que le modèle en deux étapes (activation - transformation) de Nieuwkoop soit

suffisant pour expliquer comment le système nerveux central est subdivisé en ses principales

régions (prosencéphale, mésencéphale, rhombencéphale et moelle épinière), il n’explique pas

comment le prosencéphale est lui même sous-régionalisé. En fait, lors de la mise en place du

télencéphale, l’inhibition de la voie de signalisation des BMPs est notamment associée à une

inhibition des voies de signalisation Wnt et Nodal.

Les voies de signalisation provenant de l’ANB (Anterior Neural Boundary),

correspondant à la rangée de cellules la plus antérieure du neurectoderme, permettent

l’expression de gènes du télencéphale (Houart et al., 2002). En effet, plusieurs gènes exprimés

dans l’ANB codent pour des protéines sécrétées impliquées dans la régionalisation antérieure

de la plaque neurale. Chez le poisson zèbre, une des protéines sécrétées responsable de

l’activité de l’ANB est Tic (Houart et al., 2002), un membre de la famille des sFRP (secreted

frizzled Related Protein). Les protéines de la famille des sFRP agissent comme des

antagonistes de Wnt (Uren et al., 2000). Des cellules exprimant Tic peuvent par exemple

restaurer une identité télencéphalique dans des embryons ne possédant pas d’ANB. Tic est

également capable d’induire l’expression de gènes télencéphaliques dans des territoires de la

plaque neurale normalement destinés à devenir du diencéphale ou du mésencéphale.

L’établissement de l’identité télencéphalique requiert donc une suppression locale de

l’activité des Wnt. Cela a également été montré dans des embryons de poisson zèbre mutants

masterblind (mbf^). Ceux-ci portent une mutation dans une des protéines de la voie de

signalisation Wnt, et ne possèdent pas de télencéphale (Heisenberg et al., 2001; van de Water

S. et al., 2001). Il en va de même chez des poissons zèbres mutants pour Tcf3, un répresseur

transcriptionnel des gènes cibles de Wnt (Kim et al., 2000). D’autres études chez le poulet et

la grenouille ont également montré que le télencéphale est établi dans un domaine de faible

10-Prosencéphale

Diencéphale

Pallium

médian MP

Hippocampe

f

Telencéphale

Pallium (dorsal)

Pallium Pallium

dorsal DP latéral LP

Isocortex Cortex

olfactif et une

partie de

l’amygdala

Pallium ventral

VP

Claustrum et

l’autre partie de

l’amygdala

Subpallium (ventral)

Eminescence Eminescence

ganglionique ganglionique

latérale médiane

I I

Striatum Pallidium

Introduction

activité de Wnt (Kiecker and Niehrs, 2001; Lupo et al., 2002; Nordstrom et al., 2002). De

même, chez la souris, l’absence de Six3 dans le prosencéphale en développement conduit à

une augmentation locale de l’activité Wnt causant la perte des tissus télencéphaliques

(Lagutin et al., 2003).

L’inhibition de la voie de signalisation Nodal est également nécessaire au développement

du prosencéphale (Piccolo et al., 1999). L’étude d’embryons de poisson zèbre déficients pour

Nodal confirme que la voie de signalisation Nodal empêche le développement du

télencéphale. En effet, des poissons mutants pour Nodal présentent un prosencéphale élargi

(Gritsman et al., 1999).

2.4.2. Régionalisation dorso-ventrale du télencéphale

Chez tous les vertébrés, le télencéphale en développement est subdivisé en un territoire

ventral et dorsal, respectivement appelé subpallium et pallium. Le pallium est subdivisé en

quatre régions qui donneront dans le cerveau adulte : le pallium médian (MP, futur

hippocampe), le pallium dorsal (DP, ou isocortex), le pallium latéral (LP, futur cortex olfactif

et une partie de l’amygdala) et le pallium ventral (VP, le claustrum et l’autre partie de

l’amygdala). Le subpallium comprend deux subdivisions : les éminences ganglioniques

latérales et médianes (Ige et mge) qui donneront respectivement le striatum et le pallidum

(Fig.9).

Les régions dorsales et ventrales du télencéphale peuvent être distinguées par différents

profils d’expression de gènes. De plus, des analyses génétiques montrent que ces gènes

participent à la spécification et à l’identité des territoires télencéphaliques dans lesquels ils

sont exprimés, et peuvent donc être considérés comme des gènes clefs de la régionalisation.

En effet, leur inactivation chez les mammifères conduit à une altération des principales

subdivisions du prosencéphale (Schuurmans and Guillemot, 2002; Bachy et al., 2002). Par

exemple, les gènes Emx qui sont exprimés dans le télencéphale dorsal affectent le

développement du cortex (Yoshida et al., 1997). De plus, il a été montré que Emx2 est une

cible transcriptionnelle directe des voies de signalisation Wnt et BMP dans le télencéphale

dorsal (Theil et al., 2002). Les voies de signalisation BMP et Wnt ne sont donc pas

uniquement nécessaires à l’établissement initial des destinées antérieures, mais jouent

également un rôle important plus tard au cours de la mise en place des différentes

subdivisions du prosencéphale. Au contraire, les gènes Dix sont restreints au télencéphale

ventral, et leur perte de fonction cause des défauts au niveau du striatum (Anderson et al.,

1997). De même, la perte de fonction de Nkx2.1 conduit à une transformation dorso-ventrale

-B

^ nruni plate

0 neural crest

©PPE

O cpidermis

Figure 10 : (A) Représentation schématique, sur un embryon de xénope au stade 16, des 4

domaines ectodermiques : la plaque neurale (bleu), la crête neurale (vert clair), le PPE (vert

foncé) et l’épiderme (jaune). (B) Hybridation in situ montrant le profil d’expression de sixl

exprimé dans tout le PPE. (Moody, 1987)

Figure 11 : Représentation schématique des différentes placodes sur un embryon de

xénope au stade bourgeon caudal. (Schlosser and Northcutt, 2000)

Introduction

du pallidum (Sussel et al., 1999). Chez les souris Pax6'^\ la bordure pallio-subpalliale est

déplacée dorsalement, et le subpallium est élargi aux dépends du pallium (Bishop et al., 2000;

Toresson et al., 2000; Yun et al., 2001). Nkx2.1 et Pax6 sont donc également des régulateurs

essentiels du pallidum et du pallium, et ont pour fonction la spécification des subdivisions

télencéphaliques.

La subdivision du télencéphale par l’expression régionalisée de différents facteurs de

transcription est suivie par la différenciation de plusieurs types de neurones dans chacune de

ces subdivisions. Dans le télencéphale ventral, les neurones sont de type GABA-ergiques (y-

amino butyric acid) et sont caractérisés par l’expression des protéines Dlx5, Dlx6, Nkx2.1,

Lhx6 et Lhx7 (Grigoriou et al., 1998; Puelles et al., 2000; Wilson and Rubenstein, 2000;

Marin et al., 2000). Le cortex cérébral quant à lui comporte des neurones glutamatergiques

provenant de progéniteurs télencéphaliques dorsaux. Ces neurones expriment Tbrl ainsi que

plusieurs protéines bHLH telles que NeuroD, NeuroD2, Math2 et MathS (Fode et al., 2000;

Pleasure et al., 2000).

3. Induction et spécification des placodes

Lors de la gastrulation, l’ectoderme embryonnaire est séparé en plusieurs domaines qui

auront des destinées différentes. Il s’agit de la plaque neurale, de la crête neurale, de

l’ectoderme préplacodal (PPE), et de l’épiderme. Les placodes dérivent toutes du PPE qui

entoure la partie antérieure de la plaque neurale (Fig. 1 OA). Dans la région antérieure du PPE

un sous-domaine appelé ANR (Anterior Neural Ridge), à partir duquel se développent les

placodes olfactives et certains tissus du prosencéphale, peut être défini. Plusieurs types de

placodes peuvent être distinguées : adénohypophysaires, olfactives, cristallines, « profundal »,

trigéminales, épibranchiales, hypobranchiales, les placodes de la ligne latérale et les placodes

otiques (Fig.ll). La plupart de ces placodes sont présentes chez tous les vertébrés. Cependant,

les placodes hypobranchiales ne se retrouvent que chez les amphibiens. De plus, à l’exception

des placodes adénohypophysaires et cristallines, toutes les placodes sont neurogéniques.

3.1. Gènes qui spécifient la destinée d’ectoderme préplacodal

Un grand nombre de facteurs de transcription sont exprimés dans les différentes

placodes, cependant, seules deux familles de gènes {six et eyà) sont exprimées dans tout le

PPE et ce dès le début de sa formation (Fig.lOB). Plusieurs études récentes ont montré que les

gènes six et eya sont nécessaires à la spécification du PPE.

12-Figure 12 : Les frontières entre les 4 domaines ectodermiques peuvent être formées par

des interactions de répressions mutuelles. La colonne de gauche montre des hybridations in

situ sur des embryons de xénope avec des ARNm pour ker, sixl, foxD3 et sox2 qui sont

respectivement des marqueurs de l’épiderme, du PPE, de la crête neurale et de la plaque

neurale. Zic2 et dlx6, deux gènes de bordure y sont également présentés. La colonne de droite

résume les expériences qui ont démontré que sixl peut maintenir une destinée préplacodale en

réprimant et en étant réprimé par les gènes exprimés dans les autres domaines (Moody, 1987).

Introduction

Les gènes six codent pour des facteurs de transcription à homéodomaine qui lient

directement l’ADN. Chez les vertébrés, ils sont groupés en trois sous-familles : sixl/2, six4/5

et six3/6 sur base de variations de séquences. Sixl/2 et six4/5 mais pas six3/6 présentent une

expression dans tout le PPE. Les facteurs de transcription Six peuvent fonctionner à la fois

comme activateurs ou répresseurs transcriptionnels en fonction des co-facteurs avec lesquels

ils interagissent. Sixl joue un rôle central dans le développement du PPE et des placodes.

Chez le xénope, des expériences de sous-expression par l’injection de morpholinos bloquant

la traduction de sixl conduisent à la perte de l’expression des marqueurs du PPE, ainsi qu’à

une augmentation des marqueurs adjacents de l’épiderme {Ep.keratin) et de la crête neurale

(foxD3) (Bmgmann et al., 2004). L’injection d’ARNm codant pour Sixl augmente quant à

elle le domaine d’expression de marqueurs du PPE (soxll, eyd) et réprime les domaines

d’expression de l’épiderme et de la crête neurale. La surexpression du gène sixl promeut donc

l’expression des gènes du PPE aux dépends des gènes de l’épiderme et de la crête neurale

(Fig.l2).

Les gènes eya codent quant à eux pour des facteurs qui agissent comme des co­

activateurs transcriptionnels des gènes six. Tous les gènes eya à l’exception de eya3 sont

largement exprimés dans les placodes (Schlosser, 2006), et chez le xénope et le poisson zèbre,

le domaine d’expression du gène eyal est très similaire à celui de sixl.

3.2. Voies de signalisations responsables de la formation de l’ectoderme

préplacodal

Puisque la crête neurale et les placodes dérivent toutes les deux de l’ectoderme qui

entoure la plaque neurale, et que ces deux tissus contribuent au système nerveux périphérique,

il a été suggéré que les placodes puissent être induites par des mécanismes similaires à ceux

induisant la crête neurale.

3.2.1. Rôle de la voie de signalisation BMP

Une concentration graduelle en BMP régionalise l’ectoderme en différents sous

domaines, l’épiderme se formant à de fortes concentrations en BMP, la plaque neurale à de

faibles concentrations, et la crête neurale à des niveaux intermédiaires. Le PPE se développant

entre la crête neurale et l’épiderme, il se formerait également à une concentration

intermédiaire en BMP. En effet, l’injection d’ARNm codant pour les antagonistes de BMP,

Noggin et Cerbems, induit l’expression de sixl dans des expiants animaux de xénope

(Bmgmann et al., 2004). La voie de signalisation des BMP doit donc être réduite dans

-Introduction

l’ectoderme embryonnaire pour que l’expression des gènes du PPE soit possible. De plus,

lorsque des expiants sont mis en culture en présence de différentes concentrations en Noggin,

six] et eyal sont fortement exprimés à de faibles concentrations. Par contre, leur expression

diminue fortement lorsque la concentration en Noggin augmente, que ce soit à un niveau

intermédiaire qui induit les gènes de la crête neurale, ou encore à un niveau plus élevé qui

induit les gènes de la plaque neurale (Brugmann et al., 2004). Les gènes qui sont

caractéristiques de la plaque neurale, de la crête neurale et du PPE sont donc induits dans des

expiants ectodermiques à différentes concentrations en antagonistes de BMP.

3.2.2. Rôle de la signalisation antéro-postérieure

Bien que les gènes sixl et eyal soient induits dans des expiants de calottes animales en

réponse à une concentration appropriée en antagonistes de BMP, en embryons cela n’est

possible que si un axe secondaire antéro-postérieur est induit par une expression ectopique de

Noggin ou de Chordin. L’induction du PPE est donc liée à la formation d’un axe antéro­

postérieur (Brugmann et al., 2004; Ahrens and Schlosser, 2005). De plus, l’induction de la

crête neurale, qui est positionnée en bordure de la plaque neurale, à l’exception de sa région la

plus antérieure, nécessite les mêmes voies de signalisation que celles qui établissent la

postériorisation de la plaque neurale (FGF, Wnt et acide rétinoïque). De ce fait, il est possible

que le PPE, exclusivement localisé à la bordure antérieure de la plaque neurale soit

négativement régulé par ces signaux postériorisants. En effet, il a été démontré à la fois en

expiants de calottes animales et en embryons, que la répression des voies de signalisation Wnt

ou FGF étend le domaine d’expression de sixl. Inversement, l’activation des signalisations

Wnt ou FGF diminue son domaine d’expression (Brugmann et al., 2004). En conclusion, alors

que l’induction de la crête neurale requiert des signaux postériorisants, le PPE, quant à lui ne

se développe qu’en l’absence de ces signaux. Cette différence de réponse de la crête neurale

et du PPE aux signaux postériorisants explique pourquoi la crête neurale ne se forme jamais

dans la partie la plus antérieure de la tête, et pourquoi les placodes ne se retrouvent jamais

dans le tronc.

14-Introduction

4. Les protéines à domaine BTB-POZ

4.1. Le domaine BTB-POZ

Le domaine BTB-POZ (Bric a brac Tramtrack Broad complex POx virus and Zinc

finger) est un domaine hydrophobe de 120 acides aminés présent à l’extrémité amino­

terminale d’un grand nombre de protéines participant à une variété de processus biologiques

différents tels que la régulation transcriptionnelle, la structure de la chromatine, l’organisation

du cytosquelette et la formation de canaux pour certains ions (Aravind and Koonin, 1999). Ce

domaine est formé d’une succession de stmctures en feuillet^ et en hélices a, et permet des

interactions entre protéines. Ces interactions peuvent être des homodimérisations, ou des

hétérodimérisations avec des protéines contenant elles aussi un domaine BTB-POZ (Collins et

al., 2001).

Le domaine BTB-POZ a été découvert lors de la comparaison des gènes Tramtrack (ttk) et

BR-C de drosophile. Le gène ttk code pour deux répresseurs transcriptionnels à doigts de zinc

p69 et p88, qui ne different que par leur domaine de liaison à TADN et qui sont requis pour le

développement embryonnaire ainsi que pour la détermination de la destinée des cellules de

l’œil. BR-C est quant à lui un gène intervenant dans la métamorphose. Il code pour quatre

protéines partageant une extrémité amino-terminale commune qui correspond à la région de

similarité avec les protéines TTK. Ce domaine a été par la suite retrouvé dans toute une série

de protéines depuis la levure jusqu’aux mammifères et est donc hautement conservé au cours

de l’évolution.

4.2. Différentes catégories de protéines à domaine BTB-POZ

Les domaines BTB/POZ sont généralement trouvés en copie unique associés à d’autres

domaines conservés. En fonction des différents domaines associés, les protéines BTB/POZ

peuvent être classées en plusieurs catégories. Pour chacime de ces catégories, nous décrivons

ici quelques imes des protéines les mieux caractérisées afin d’illustrer la diversité

fonctionnelle des membres de cette famille.

4.2.1. Protéines BTB-POZ possédant des domaines associés permettant la liaison

à TADN

La première classe comprend les protéines liant TADN. Pour la plupart, il s’agit de

facteurs de transcription possédant un motif de liaison à TADN de type doigt à zinc C

2

H

2

.

Chez l’homme, 5 à 10% des protéines à doigt à zinc, qui constituent la plus grande famille de

15-Figure 13 : Représentation schématique de la cascade d’ubiquitination d’un substrat. Une

molécule d’ubiquitine est liée de manière covalente à une protéine du substrat par rm

mécanisme mettant en jeu trois enzymes : une enzyme d’activation de l’ubiquitine El, une

enzyme de conjugaison de l’ubiquitine E2 et une enzyme de ligation de l’ubiquitine E3.

L’action successive de cet ensemble d’enzymes permet la génération d’une chaîne de plusieurs

molécules d’ubiquitine liées à la protéine substrat.

Introduction

facteurs liant l'ADN, possèdent un domaine BTB/POZ. Dans un grand nombre de cas, le

domaine BTB/POZ permet la formation d’homodimères et/ou d’hétérodimères. De plus,

celui-ci interagit dans certains cas avec des corépresseurs et peut donc être directement

impliqué dans la répression transcriptiormelle. C’est par exemple le cas du facteur de

transcription PLZF (Promyelocytic Leukemia Zinc Finger), impliqué dans l’hématopoïèse et

le développement du système nerveux (Bama et al., 2002; Ivins et al., 2003), et du proto­

oncogène BCL-6 (yFl Binding Protein isoform B). Ces deux protéines peuvent interagir avec

les corépresseurs SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid hormone receptor) et

N-CoR (Nuclear Receptor Corepresssors) (Hong et al., 1997; David et al., 1998; Ahmad et al.,

2003), et ainsi recruter des protéines à activité histone déacétylase qui induisent des

changements locaux dans la structure de la chromatine et inhibent la transcription de gènes

cibles. Cependant, cette propriété n’est pas générale puisque certains facteurs de transcription

à domaine BTB-POZ tels que HIC (Hypermethylated In Cancer) et yFBP-B agissent comme

répresseurs transcriptionnels sans pour autant interagir avec des corépresseurs. Enfin, des

travaux complémentaires sur PLZF et BCL-6 ont montré que des mutations de résidus

d’acides aminés dans les domaines BTB-POZ de ces protéines entraînent l’inhibition de leur

activité transcriptionnelle. L’intégrité du domaine BTB-POZ serait donc nécessaire au

maintien des fonctions protéiques (Melnick et al., 2002). A l’inverse de PLZF ou BCL6, la

protéine GAGA codée par le gène Trithorax-like (Tri) est quant à elle un activateur requis

pour l’expression normale de nombreux gènes homéotiques contrôlant le développement

(Shimojima et al., 2003).

Toutes les protéines à domaine BTB/POZ liant l’ADN ne comportent pas un domaine à

doigt à zinc C

2

H

2

. C’est notamment le cas de la protéine BACH2 de mammifère qui possède

un motif de liaison à l’ADN de type « basic leucine zipper » (bZip) à son extrémité carboxy­

terminale. BACH2 fonctionne comme un facteur de transcription répresseur spécifique des

lymphocytes B et des neurones.

4.2.2. Protéines BTB-POZ possédant d’autres types, ou aucun autre motif de

fonction connue associé, et dont certaines interagissent avec l’ubiquitine

ligase E3, Cullin-3

L’ubiquitination joue un rôle dans la voie de signalisation permettant de contrôler la

dégradation des protéines par le protéasome 26S, mais apporte également à la cellule un

moyen important de contrôle des différents processus biologiques. L’ubiquitination des

protéines est un processus complexe fortement régulé, et contrôlé dans le temps. L’ubiquitine

16-MATH

Keich

^ ^~HUbWub)

Substrat

MEL26 MEI1

Keap1 Nrf2 protéasome 26S

Figure 14 : Représentation schématique du complexe d’ubiquitination de type BTB-

Cullin-3.

Introduction

est liée à sa protéine cible par un mécanisme en trois étapes qui requiert l’action constitutive

de 3 types d’enzymes : les enzymes d’activation (El), les enzymes de conjugaison (E2) et les

enzymes de ligation (E3) (Fig. 13). Dans le cas des protéines E3 à domaine RING (Really

Interesting New Gene), l’enzyme E3 fonctionne comme un « adaptateur » en positionnant

l’enzyme E2 à proximité de son substrat. Dans le cadre de ce travail, nous nous intéresserons

aux complexes de type BTB-Cullin-3, dans lesquels la protéine ubiquitine ligase E3 à

domaine RING est de type Cullin-3 et interagit avec une protéine adaptatrice contenant un

domaine de type BTB-POZ. Dans ces complexes, la protéine adaptatrice à domaine BTB-

POZ combine en une seule protéine, d’une part la fonction de protéine de liaison à

l’ubiquitine ligase E3 via le domaine BTB-POZ et d’autre part la fonction adaptatrice de

reconnaissance spécifique du substrat. La plupart de ces protéines possèdent en effet des

domaines d’interaction protéine-protéine tels que les motifs Kelch ou MATH (Stogios et al.,

2005) (Fig.l4).

a) Protéines BTB-POZ à motif Kelch

Les protéines de cette classe ont leur domaine BTB-POZ amino-terminal lié à un

domaine de type Kelch, un motif répété quatre à sept fois en tandem et constitué d’une

séquence de 50 acides aminés contenant un doublet de glycine et des résidus tryptophane et

tyrosine strictement conservés (Xue and Cooley, 1993).

Un exemple de protéine BTB-Kelch servant d’adaptateur spécifique au sein des

ubiquitines ligases E3 de la famille Cullin-3 est la protéine KLHL12 connue pour réguler

négativement la voie de signalisation Wnt. En effet, KLHL12 recrute Dishevelled, un

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