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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Pecheux, F. (1970). Contribution à l'étude in vivo d'un RNA rapidement marqué associé au DNA chez HeLa: technique d'isolement d'un complexe DNA-RNA au cours du cycle cellulaire (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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J^OJo-ZS
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
FACULTE DES SCIENCES
Laboratoire de Biophysique et Radiobiologie
CONTRIBUTION A L'ETUDE IN VIVO D'UN RNA
RAPIDEMENT MAROUE ASSOCIE AU DNA
CHEZ HeLa : TECHNIOUE D'ISOLEMENT D'UN COMPLEXE
DNA - RNA AU COURS DU CYCLE CELLULAIRE
Mémoire présenté pour l'obtention du grade de
Docteur en Sciences Zoologiques
F
rançoise
PECHEUX
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté des Sciences
Laboratoire de Biophysique et Radiobiologie
CONTRIBUTION A L'ETUDE IN VIVO D'UN RNA RAPIDEMENT MARQUE ASSOCIE AU DNA CHEZ HeLa : TECHNIQUE D'ISOLEMENT D'UN COMPLEXE DNA-RNA AU COURS DU CYCLE
CELLULAIRE
Mémoire présenté pour l'obtention du grade de Docteur en Sciences Zoologiques
T 3ii
(Up.l.
Françoise PECHEUX
C
-4
)
Toute notre gratitude s'adresse à Monsieur le Professeur M. ERRERA, qui nous permit d'entreprendre ce travail et le dirigea avec enthousiasme.
Nos remerciements les plus vifs s'adressent également aux chercheurs de son laboratoire et, plus particulièrement, à
M. BRUNFAUT, C. CRIFO et Y. SCHLUSSELBERG-JOLY.
Nous remercions enfin Monsieur R, LEGAS, qui nous procura les cellules de HeLa, ainsi que Messieurs F. PATTYN et E. STRUYF, qui nous aidèrent dans la présentation de ce travail.
r;
ERRATA
pmp
P . 24 20 ligne , Jones et al 1966
P . 26 S®"’® ligne , Fuschs 1964 P . 28 I 1) Chamberlin et Berg
P . 30 avant derniere ligne : peut ne pas,^plutôt que ne peut pas,,
P 32 7®^® ligne Levis et al 1967 a) b)
P . 46 20®"^® ligne , Stubblefield 1966
P . 47 3^'^'^ ligne avant la fin ^ Alexander et Lett 1960 omp
P . 48 9 ligne ^ Young et Hodas
ABREVIATIONS
AN acides nucléiques
ATP adénosine triphosphate
Arac cytosine arabinoside
B. subtilis Bacillus subtilis
cpm coup par minute
DNA acide désoxyribonucléique
DO densité optique
EDTA acide éthylène diamine tétraacétique ou versène
E.coli Escherichia coli
FUdR Fluorodéoxyuridine
DTP guanosine triphosphate
HN^ HU
gaz de moutarde azotée hydroxyurée IM index mitotique lac lactose F micron [J.C microcurie Mc mitomycine
PDA acide perchlorique
polyg acide polyguanilique
poIyU acide polyuridilique
poly dG acide polydéoxyguanilique
poly dA acide polydéoxyadénilique
poly dD acide polydéoxycytidilique
PM poids molaire
RNA acide ribonucléique
RNAm acide ribonucléique messager
RNAs acides ribonucléiques solubles
RNAr acides ribonucléiques ribosomiaux
D-RNA RNA dont la composition en bases est semblable celle du DNA
RNase ribonucléase
S Svedberg
SDS dodecyl sulfate de sodium
TCA acide trichloracétique
trp tryptophane
TABLE DES MATIERES
RESUME BUT
INTRODUCTION
I . Généralités : synthèse protéique
A . La transcription 1. Fixation de la RNApolymérase sur le DNA - RNApolymérase et sa structure •
- Formation d'un complexe DNA - RNApolymérase 2 . Initiation de la synthèse de RNA
3 . Polymérisation de la chaîne de RNA - Polarité de la transcription - Asymétrie de la transcription B . Mécanismes de régulation de la transcription
1 . Râle du génome
2 . Périodicité de la transcription
3 . Relation entre transcription et traduction
‘ - Rôle des ribosomes sur l'initiation
- Rôle des ribosomes sur l'élongation - Ribosomes et inactivation du RNAm C . Complexe DNA - RNA , sa structure et sa composition
1 . Complexe in vitro 2 . Complexe in vivo
3 . Propriétés générales d'un complexe DNA - RNA D . RNA rapidement marqué dans les cellules de Mammifères
1 . Flétérogéinitè du RNA
2 . Lieu de synthèse des RNA rapidement marqués 3 , Nature des RNA rapidement marqués
- RNA messagers
- RNA ribosomiaux
E . Différences entre les Procaryotes et les Eucaryotes
1 . Le génôme des Eucaryotes contient un grand nombre de bases répétées
3 . Une partie des RNA rapidement marqués chez les Eucaryotes ne se reti’ouve pas dans le cytoplasme
F . Hypothèse de mécanisme de régulation chez les Eucaryotes
II . Synchronisation des cellules de Mammifères A . Introduction
B . Les différentes méthodes de synchronisation
'1 . Sélection des cellules en mitose
2 . Synchronisation par blocage métabolique
3 . Synchronisation par des inhibiteurs spécifiques de la synthèse de DNA
MATERIELS ET METHODES I . Culture des cellules
1 . Cellules de Hela 2 . Milieu de culture 3 . Condition de culture II . Synchronisation des cellules
1 . Sélection des cellules en mitose
2 . Synchronisation par choc hypothermique
3 . Synchronisation par des inhibiteurs spécifiques de la synthèse de DNA
- Par la FUdR
- Par un simple excès de TdR - Par un double excès de TdR III . Marquage des cellules
IV . Autoradiographie
1 . Fixation des cellules sur lamelles 2 . Emulsion des lames
3 . Coloration
VI . Extraction et séparation des acides nucléiques 1 . Extraction
2 . Séparation des acides nucléiques
a) sur colonne de MAK suivie d'un gradient de Cs^SO b) Lysat cellulaire centrifugé en gradient de Cs^SO c) Hydroxyapatite
VII . Gradient de Saccharose
VIII. Contrôles permettant de nous assurer l'existence d'un " complexe " IX . Traitements enzymatiques
a] RNase pancréatique b) Pronase
X , Dosages des acides nucléiques
1 . Dosage Ogur - Rosen
2 . Dosage calorimétrique des pentoses
XI . Mesures 1 , Densité optique
2 . Radioactivité
3 . Concentration des solutés 4 , Index mitotique
5 . Comptage cellulaire 6 . Degré de synchronisation
7 . Détermination des différentes étapes du cycle cellulaire
RESULTATS EXPERIMENTAUX
I , Mise au point d'une méthode de purification des acides nucléiques A . Purification des ac^e^ ni^léiques _par MAK et^Cs^SO^
- Discussion - Conclusion
B . E_x^a£tion préparative_ dj ujn comp^e)^ " par cen-^ifugatiph
d'un JLysat cellulaire en gracient cés£um_ 1 . En Cs^SO^
2 . En CsCl - Discussion - Conclusion
C . Purification compl^émentaire _d ' uri " _comgle2<e '|_is_su ^ ' uj] gradient de ^sCl par chromatographie sur cplonne J^ydroxyapatite
- Discussion
sirG
D . Conclusions _3^én^al_es et r^sum^ de_l^ 1 _ partie
II , Synchronisation des cellules de Hela A . Synchronisay.on par choc_hypothermigue
- Discussion - Conclusion
B . Arrêt de la synthèse _de DNA _par _des_inlTibi'^eu^ ^écifigue_s 1 . Par la FUdR
- Discussion et conclusion 2 , Par un simple excès de TdR
- Discussion - Conclusion
3 . Par un double excès de TdR
- Discussion sur les deux dernières méthodes de synchronisation utilisées
GmG
c . Conclusions générales et résum^de_1^2 _ gartie_
III . Mét! abolisme des acides nucléiques au cours du cycle cellulaire A . Syi^hronisÿiqn parjjn _simple_exc_ès i^e TdR _
1 , Autoradiographie • - Conclusion
2 . Hydrolyse rapide au PCA - Discussion
- Conclusion
B . Synchronisation ^ar_un double e^ès_de TdR 1 . Cultures asynchrones 2 . Cultures synchrones
- Hydrolyse rapide au PCA
- Centrifugation d'un lysat cellulaire en Cs^SO^
,emB
IV
_ . Discussion de la 3"""'“ partie
10
1 . Détermination des différentes étapes du cycle cellulaire 2 . Détermination du degré de synchronisation
3 . Synthèse du RNA au cours du cycle cellulaire
D . Conclusions générales et résumé de la 3^"^^ partie
101
, Isolement d'un " complexe " à partir de cellules Hela synchrones et asynchronesi 1^
10
10
-Afcisolement par MAK et Cs^SO^
1 , Cellules synchronisées par un simple excès de TdR - Conclusion
2 . Cellules synchronisées par un double excès de TdR - Conclusion
B . Première étape d'extraction d'un_" comp_le>Æ "_P^ centrifugation I’..- d'un lysat cellulaire dans un gradient de césium_après synchronisation
par un double excès de TdR_ • - Discussion
èmB
C . Conclusions gé_nérale£ si^ la_4 _ partie
V . Annexe ; Certaines catactéristiques du " complexe " isolé par chromatonraphie sur colonne colonne d'hydroxyapatite après centrifugation d'un Ivsat cellulaire dans un gradient de césium
A . Isolement d'un RNA rapidement marqué conjointement au DNA et résistance d'un "complexe " éventuel: à de hautes forces ioniques
B . Résistance de la structure au BDS C . Résistance du " complexe " à la RNase
D . De l'instabilité du"complexe"observée sur colonne d'hydroxyapatite - Discussion
- Conclusion
: E . De l'intervention probable d'une protéine dans la composition d'un " complexe "
1 . Actions enzymatiques 2 . Action de la température
. Conclusions générales et récapitulation de la 5 partie
RECAPITULATION ET CONCLUSIONS GENERALES
RESUME
Dans le but d'apporter une contribution à l'étude des
mécanismes de la transcription et de sa régulation, nous avons tenté de purifier un "complexe DNA-RNA" stable à partir de cellules de HeLa, au cours du cycle cellulaire.
Notre premier souci fut de rechercher une méthode de
purification suffisamment douce, de façon à isoler un "complexe" dans un état aussi voisin que possible de son état naturel.
Ensuite, nous avons mis au point une technique de
synchronisation des cellules. Cela nous a donné l'occasion d'étudier le métabolisme cellulaire des acides nucléiques, ainsi que celui du "complexe DNA-RNA" durant une portion du cycle.
Par la combinaison des deux procédés, nous avons puilfié, en phase , une quantité relativement élevée de RNA rapidement marqué associé, à du DNA ayant incorporé un minimum de précurseur radioactif.
BUT DU TRAVAIL
La réplication d'une cellule animale est un processus cyclique faisant intervenir l'expression ordonnée de l'information génétique spécifique de chacune des étapes.
L'achèvement de ce processus est que les chromatides sont répliquées et distribuées avec précision dans les cellules-filles, assurant la continuité génétique et phénotypique.
Tandis que les expériences faites à l'aide d'inhibiteurs dans les cultures cellulaires démontrent que les réactions conduisant à la réplication sont programmées par le système génétique, les observations de croissance'et d'interaction cellulaire dans les cultures d'organes révèlent que l'expression de ces gènes est aussi contrôlée par des facteurs de l'environnement externe, tels que le milieu nutritionnel et les hormones.
Il en résulte que les cellules d'un organisme de mammifère vivant ont une durée de cycle cellulaire variable : certaines cellules se répliquent toutes les dix à douze heures, tandis que d'autres
attendent des jours, sinon plus, parfois même elles ne se répliquent pas L'interrelation de ces contrôles respectifs est la présence de plusieurs types de cellules au sein d'un même organe, dont la
réplication est balancée de telle façon que l'ensemble de ces cellules constitue un organe fonctionnel.
Une perturbation de ces différents contrôles entraîne des états pathologiques tels que le cancer et des anomalies de développement
Quoiqu'il soit clairement évident que les mécanismes de contrôle de croissance doivent agir au sein des cellules d'un
3
4
INTRODUCTION
I. GENERALITES : SYNTHESE PROTEIQUE
La séquence d'acides aminés d'une protéine particulière est
déterminée par la séquence nucléotidique d'un segment spécifique de DNA. L'expression de l'information génétique se résoud en deux phases : la transcription et la traduction.
A. La transcription
Le DNA est transcrit en RNA intermédiaire, le RNAm ayant une séquence nucléotidique semblable à l'une des chaînes du DNA, et complé mentaire de l'autre qui sert de modèle.
Nos efforts se sont concentrés sur cette première étape de la synthèse protéique. En effet, comme beaucoup de mécanismes de régulation ont lieu pendant la transcription, il pourrait être intéressant d'isoler un complexe de transcription, de préciser la nature du RNA transcrit et les relations entre le RNA et le DNA au moment de la réaction.
La synthèse du RNA sur le DNA se déroule de la façon suivante (Anthony et al, 1966);
1ère étape : association : DNA + RNA pn1ymérasn --- * DNA-RNA polymérase 2ème étape ; initiation : DNA-RNA polymérase + purine nucléotide
*■*"*•"> DNA-RNA polymérase - purine
3ème étape : polymérisation ; DNA - RNA polymérase - purine + XTP
---^DNA - RNA polymérase - oligoribonucléotide + PF 1
5
Il est plus que probable que ces trois étapes soient coordonnées, mais,pour la clarté de l'exposé, nous les avons traitées séparément.
Des expérimentateurs sont d'ailleurs parvenus à les distinguer les unes des autres (wiaitra et al, 1966 ; Akira, Ishichama et Hurwitz, 1969). Pour chacune des étapes, nous avons relevé la spécificité et la sélectivité du mécanisme de la transcription.
1. Fixation de la RNA polymérase sur le DNA
a) RNA polymérase et sa structure
Il découle de l'ensemble des travaux réalisés in vitro sur du matériel isolé à partir d'organismes inférieurs que la RNA polymérase est formée de plusieurs sous-unités.
Cette structure complexe semble assurer la sélectivité de la transcription et, de ce fait, intervient dans la régulation de la transcription.
Plusieurs auteurs (Fuchs et al, 1964 ; Stevens et al, 1966) ont remarqué que, pour des forces ioniques croissantes, la RNA polymérase se dissocie de façon réversible. Les produits de cette dissociation sont, d'apres Richardson (1966)^ Pettitjohn et Kamiya (1967), des monomères dont le coéfficient de sédimentation varie de 1DS à 13B, tandis que la RNA polymérase à l'état natif aurait un coéfficient de sédimentation de IBS à 26S. Ces résultats sont confirmés par les travaux de So et al (1967),ainsi que ceux de Kitano et Kameyama (l96P).
Les variations continuellement observées dans la mesure du coéfficient de sédimentation en fonction de la force ionique sont vraisemblablement une manifestation d'une réaction d'équilibre entre les différentes formes de cet enzyme. Déterminer laquelle est l'unité
6
il serait intéressant de connaître le mécanisme par lequel la sélectivité de la transcription se déroule,
So et al (1967) notent que la dissociation de la RNA polymérase en deux monomères augmente de deux fois la vitesse de synthèse initiale et de dix fois la quantité de RNA transcrit sur du DNA,
Plusieurs observations permettent de suggérer que l'unité 13S est l'unité fonctionnelle de la RNA polymérase : la liaison de cet enzyme aux polynucléotides favorise sa dissociation sous la forme 13S (Stevens et al, 1966 ; Bremer et Stent, 1967 ; Smith et al, 1967 ; Anthony et Goldthwait, 1970).
Des RNA polymérases plus petites que 13S ne sont pas actives. Burgess (1968, 1969) a poussé la dissociation d'une RNA polymérase d'E.coli par l'usage de déprotéinisants tels que l'urée ou les détergents, et chromatographie sur phospho cellulose. Selon cet
auteur, la forme 13S de la RNA polymérase serait composée de 4 sous-unités lui conférant un poids moléculaire de 400,000. L'une des unités est le facteur £T ; protéine très labile capable de stimuler l'initiation de la synthèse de RNA et d'augmenter le nombre de RNA initié. Cet auteur confirme les travaux de Darlix et al (1969), qui ont utilisé un DNA de phage et une RNA polymérase d'E.coli purifiée par chromatographie sur colonne de phosphocellulose.
Ce facteur stimulerait la synthèse de RNA à l'étape de l'initiation avant l'achèvement de la première liaison phosphodiester
(Dunn et Bautz, 1969).
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D'après Bautz (1969), le facteur 0* est important et jouerait un râle dans la sélection de la transcription des gènes. Par exemple, l'addition de cette protéine dans un système contenant le DNA de phage et la RNA polymérase d'E.coli ne stimule que la synthèse des RNA "précoces" du phage ; par contre, en son absence, les chaînes de RNA initiés le sont sur des sites quelconques de la molécule de DNA de phage T^. Sur du DNA à double fibre du bactériophage fd, en présence de RNA polymérase d'E.coli, Sugiura et Okamoto (1970) aboutissent aux mêmes conclusions.
b) Formation d'un complexe DNA - RNA polymérase
L'initiation de la synthèse de RNA par la RNA polymérase sur le DNA est un processus très spécifique. Il est donc intéressant de comprendre ce mécanisme, en particulier, comment la RNA polymérase reconnaît les sites du DNA sur lesquels cette transcription commen ce.
Une des étapes nécessaires à la transcription est l'interaction entre l'enzyme et le DNA en relation avec le milieu réactionnel.
Caractéristiques de la liaison RNA polymérase sur le modèle Les observations faites sur des systèmes d'organismes inférieurs concernant cette liaison sont tirées de méthodes se basant sur le fait que la RNA polymérase peut former, in vitro, un complexe stable avec le DNA, séparable des enzymes libres par centrifugation, électrophorèse, ou filtration sur membrane de phosphocellulose
(Crawford et al, 1965 ; Berg et al, 1965 ; Fox et al, 1965 ; Richardson, 1966; Sternberg et Stevens, 1966 ; Jones et Berg, 1966],
La fixation de la RNA polymérase d'E.coli sur le DNA de phage est très rapide : Richardson (1966) et Jones et Berg (l966) l'estiment à 15 secondes après l'adjonction de l'enzyme dans la
8
A un pH optimal de B, ce complexe est sensible aux forces ioniques : à une concentration de NaCl ou de KCl dépassant 0,3 M, sa constante de dissociation est élevée, et on ne peut le déceler
(Berg et al, 1965 ; Jones et Berg, 196S).
Re1ation DNA - RNA polymérase dans la formation du comptexe Kitano et Kameyama (l9S9) ont observé au microscope
électronique la liaison de la RNA polymérase d'E.coli sur son DNA.
L'enzyme,dont le coéfficient de sédimentation est de 22S,a une structure cylindrique hexagonale un peu différente de ce qu'observe Fuchs et al
[19S4], ou cylindrique rectangulaire quand elle se fixe sur le DNA.
Sa structure se modifie donc, lors de l'interaction , renforçant ainsi sa liaison.
Il n'est pas nécessaire d'avoir un groupe terminal 3'DH pour la fixation de la RNA polymérase sur le modèle, ainsi que l'avaient supposé Berg et al (1965), puisque la forme circulaire du DNA 0X174 peut servir de modèle à la synthèse de RNA (Hayashi et al, 1964 a) b) ;
Sinsheimer et Lawrence, 1964).
D'après Stead et Jones (l967), la liaison de la RNA polymérase sur le modèle dépend non seulement de la RNA polymérase, comme il a été démontré plus haut, mais aussi de la structure du modèle. En
effet, des études de compétition entre le DNA fl (dNA à 1 brin) et le DNA
(DNA à 2 brins), en présence de la RNA polymérase d'E.coli, suggèrent que l'affinité de l'enzyme par site est trois fois plus grande pour le DNA fl (Richardson, 1969).
9
Des expériences utilisant du DNA dénaturé ou des polydéoxyribonucléotides synthétiques ont permis de déterminer le rôle de la structure secondaire du modèle dans la fixation de la RNA polymérase.
Wood et Berg, 1964 ; Maitra et Hurwitz, 1965 ; Berg et al, 1965 ; Stead et Jones, 1967 observent que la quantité d'enzymes associés au DNA
s'élève si le DNA est dénaturé.
L'ensemble de ces résultats fait supposer que la
transoription par la RNA polymérase d'un DNA à une seule fibre est moins spéoifique que celle d'un DNA à double hélice et que certains sites de fixation de la RNA polymréase sur le modèle à une seule fibre ou dénaturé seraient donc accessibles,alors qu'ils ne le sont pas sur un DNA natif (Frederick et al, 1969].
Spécificité de la liaison DNA -_RNA polymérase
Des expériences réalisées in vitro sur des organismes inférieurs prouvent que, d'une part, le signal d'initiation est déterminé uniquement par le DNA et la RNA polymérase et, d'autre part, que la
str'ucture du DNA et la transcription sont en étroite corrélation. Un argument supplémentaire de la sélectivité de la transcription par la RNA polymérase découle de la mesure de séquence nucléotidique à l'extrémité 5' phosphate de chacune des chaînes de RNA.
Lors de la transcription, elles commencent principalement ou exclusivement par des bases puriques. En effet, la proportion de
guanosine et d'adénosine à l'extrémité des chaînes transcrites est très élevée. Dans la plupart des cas, moins de 15% des chaînes sont initiées- par une pyrimidine (Maitra et al, 1966].
Puisque la RNA polymérase semble capable de reconnaître les signaux spécifiques déterminant son point d'attache sur le DNA, il serait intéressant de déterminer ces signaux.
Il se pourrait que l'enzyme reconnaisse des séquences nucléotidiques particulières et spécifiques de l'initiation.
Par l'étude de la synthèse de RNA sur des DNA préparés synthétiquement, tels que polydG ; dC polydA : dT et poly(A-G) : d(T-C), il apparaît que la RNA polymérase reconnaît préférentiellement des
séquences nucléotidiques pyrimidiques (Chamberlin et Berg, 1962 ;
Chamberlin et al, 1963). D'autre part, elle s'associe plus solidement au polydC et polydT qu'aux polydA ou polydG (jones et Berg, 1966).
Du DNA de phages, de bactéries, et de vertébrés supérieurs, contient des séquences riches en pyrimidines interagissant avec des
polyribonucléotides (Opara, Kubinska et al, 1964 ; Szybalski et al, 1966 ; Kubinski et al, 1966 ; Szybalski, 1969}. Cette propriété a permis ainsi la séparation des deijx fibres de DNA dans un gradient de chlorure de
césium : la chaîne riche en cytidine s'associe avec un polyG qui l'alourdira lors de la centrifugation. Il est possible, dès lors, d'observer une
corrélation entre ces régions pyrimidiques et la transcription. Ainsi, les fibres de DNA ou les fragments contenant les régions pyrimidiques forment des hybrides avec le RNA synthétisé, tandis que leurs compléments contenant des purines ne le font pas (Summers et Szybalski, 1968 a}}.
Summers et Szybalski (1968 a) b} } notent , au cours
d'expériences sur le DNA de phage T^, que le polyG par ses sites de liaison avec le modèle, lui confère une structure hélicoïdale différente. Ils expliquent ce phénomène par les forces d'empilement entre les purines accumulées sur une des chaînes provoquant dans le DNA une modification de sa configuration. Cette hypothèse est appuyée par des études de
DNA natif, constitué d'un ensemble de cytidines (ou de thymidines) sur une chaîne, et de guanosines (ou d'adénosines) sur l'autre, pourrait avoir une structure différente du restant de DNA constitué d'un mélange de
nucléotides.
De tels sites pourraient être des points de reconnaissance et des entités de régulation de synthèse.
Il serait intéressant d'isoler les régions de DNA permettant l'association avec la RNA polymérase et de déterminer les particularités sur la séquence nucléotidique dans de telles régions. Une des méthodes serait de digérer, par la DNase, les régions de DNA non liées à la RNA polymérase et d'isoler les régions résistantes à la RNase, associées à l'enzyme. Malheureusement, cette expérience s'est révélée sans succès, car la réaction produisant le complexe enzyme - DNA est réversible (Blattner et Thomas, 1967).
En ajoutant les nucléotides triphosphates, la réaction d'élongation commence immédiatement et fausse les résultats.
On pourrait supposer que les séquences riches en pyrimidines sont aussi nombreuses que les unités de transcription et constituent des segments de ponctuation, des lieux d'initiation de transcription et que, non seulement la structure secondaire du modèle, mais encore sa structure primaire, interviennent dans la signalisation de la transcription de RNA in vivo.
12
De plus, il est possible de séparer et d'isoler les deux moitiés de DNA du phage X. Approximativement 79/o à 80% du RNA synthétisé par la RNA polymérase d'E.coli peuvent s'hybrider avec la moitié de la chaîne de DNA portant les gènes des RNA "précoces", c'est- à-dire la partie "droite" de la molécule [riche en A-T) [Khesin et al,
1962 ; Naono et Gros, 1966 ; Cohen et al, 1967 ; Snyder et Geidushek, 1968), Il se pourrait que, in vivo, la synthèse de RNA
"tardifs" se fasse grâce à l'apparition d'une nouvelle RNA polymérase,
un facteur altérant la spécificité de la RNA polymérase de l'hôte ou encore, un enzyme qui permet la reconnaissance des gènes de RNA "tardifs" par la RNA polymérase de l'hôte [Snyder et Geidushek, 1968].
c) Modèle proposé pour le mécanisme de la transcription par la RNA polymérase
L'une des premières questions au sujet du mécanisme d'action de la RNA polymérase est la suivante ; comment l'enzyme peut-il utiliser une double hélice de DNA comme modèle ?
Pendant la synthèse de RNA, la structure du modèle est conservée, contrairement à ce qui se passe lors de la réplication
[Geidusheck et al, 1961 ; Chamberlin et al, 1963], Chamberlin et Berg (1964) supposent que les fibres de DNA sont écartées sur une courte région pour permettre à la RNA polymérase d'en utiliser une des fibres.
Durant la transcription, l'enzyme se déplace vers les nucléotides adjacents, écartant les fibres l'une de l'autre, tandis que la double hélice se
referme derrière lui.
13
Chamberlin et Berg (19S4), ainsi que Sinsheimer et Lawrence (l964), montrent qu'un hybride DNA-RNA peut servir de modèle à une synthèse de RNA in vitro.
Puisque la transcription peut se réaliser sur un DNA monofibre et sur un hybride DNA-RNA, ces auteurs en conclurent que la transcription d'un DNA à double fibre peut se dérouler suivant le même modèle.
En conclusion de ce chapitre, la sélectivité de la formation d'un complexe DNA-RNA polymérase se fait par la présence du
facteur
(J
de la RNA polymérase, en fonction de la structure primaireet secondaire du DNA.
2. Initiation de la synthèse de RNA
La relation existant entre la fixation de la RNA polymérase au DNA et l'initiation de la transcription n'est pas connue.
Cependant, ce sont des phénomènes bien distincts, puisqu'ils sont séparables par des procédés biochimiques. Ainsi, Maitra (1966)
a pu bloquer, in vitro, la transcription du RNA sur le DNA par un
antibiotique, tel que 1'actinomycine, sans empêcher la liaison de la RNA polymérase sur son modèle.
De plus, le même auteur a démontré que, si la transcription débute par une base purique, le nucléotide immédiatement adjacent, dans la chaîne de RNA croissant, n'est pas nécessairement une purine.
14
Si la configuration de la RNA polymérase, ainsi que la
structure primaire et secondaire du modèle, interviennent dans la formation d'un complexe DNA--RNA polymérase, en l'absence de nucléosides triphosphates, la liaison ne serait pas stable et il se produirait une réaction d'échange entre les modèles et les RNA polymérases (Sternberg et Stevens, 1966 ; Stevens et al, 1966} se traduisant par une absence de synthèse de RNA
(Chamberlin et Berg, 1964), mais, dès l'initiation de la transcription,
l'association enzyme-DNA augmente (Fox et al, 1965 ; Stead et Jones, 1967}.
D'après Anthony et al (1966}, il faudrait une chaîne de plus de deux nucléotides pour stabiliser le complexe.
Des expériences réalisées par Bremer et Mueller (lE?69} confirment le râle des nucléosides triphosphates dans la sélectivité de la transcription en modifiant la stabilité du complexe et, de ce fait, mettent en évidence l'hétérogénéité des RNA polymérases. En suivant la synthèse du RNA dans le milieu réactionnel contenant de la RNA polymérase d'E.coli, le modèle et les quatre nucléosides triphosphates comme substrat à différentes concentrations, ces auteurs observent plusieurs RNA polymérases différant par leur comportement et dont l'activité dépend de la concentration des substrats : la concentration optimale variant d'une RNA polymérase à l'autre. Pour une concentration insuffisante de nucléosides triphosphates, il n'y aura pas de synthèse de RNA et, par conséquent, détachement de l'enzyme. Il se peut que, en présence de RNA synthétisé, la double hélice de DNA s'ouvre et l'enzyme se fixe mieux.
L'ensemble de ces travaux permettrait de suggérer que l'initiation de la synthèse de RNA stabilise l'association enzyme - DNA
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3. Polymérisation de la chaîne de RNA
Polarité de la transcription .
La sélectivité de la transcription est déterminée également par l'expression polaire de l'information génétique ; elle a été mise en évidence sur des systèmes bactériens. Elle commence au promoteur de l'opéron (Jacob et Monod, 1961 ; Ames et Martin, 1964 ; Alpers et
Tomkins, 1965 ; Ippen et al, 1968).
La polarité chimique de la transcription chez E.coli est telle que la synthèse de la chaîne commence par un groupe 5' terminal du RNA nouvellement synthétisé et se termine par un groupe 3' (Maitra et Hurwitz, 1965 ; Bremer et al, 1965). La copie se déroule le long des paires de bases antiparallèlement à la chaîne de DNA transcrite.
Asymétrie de la transcription
La sélectivité de la synthèse de RNA sur un DNA s'établit non seulement au niveau de la fixation de la RNA polymérase sur le modèle et de leur structure respective, mais encore dans l'asymétrie de la
transcription ; c'est-à-dire, la transcription d'un RNA sur une des chaînes du DNA.
Summers et Szybalsk), en 1968, ont pu mettre en évidence, in vivo, l'asymétrie de la transcription : un RNA marqué à l'uridine tritiée et isolé à partir d'E.coli à différents moments après infection par un phage ne s'hybride qu'avec une chaîne du DNA dénaturé, la plus lourde et la plus riche en bases pyrimidiques, celle capable de
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De plus, un Rl'JA synthétisé in vivo ne s'hybride pas avec le RNA synthétisé in vitro sur le même DNA servant de modèle (Sautz, 1963 ; Geidushek, 1968).
L'asymétrie a également été observée in vitro : lorsque la forme réplicative d'un DNA de phage 0174 est utilisée par une RNA polymérase d'E.coli, seule une des chaînes du modèle est transcrite
(Hayashi, 1964 a} b) ).
Par contre, dans certaines expériences plus anciennes, les deux chaînes du modèle avaient permis la synthèse de RNA in vitro
(Weiss et Nakanoto, 1961 ; Geidusheck et al, 1961).
Par des expériences réalisées in vitro sur du DNA traité aux ultrasons, Geidusheck et al (l964) et Colvill et al (l965) ont donné une explication à ces différences : les résultats suggèrent que la
structure secondaire du modèle doit être parfaitement intègre pour obtenir une transcription asymétrique telle qu'elle se produit in vivo.
Ces constatations constituent une des raisons pour lesquelles nous avons préféré travailler in vivo.
Si la transcription est asymétrique, deux RNAm différents ne se synthétisent pas nécessairement sur la même chaîne de DNA, En effet, elle correspond bien à la distribution asymétrique des régions riches en bases pyrimidiques. Ainsi, dans le phage X, la transcription procède sur les deux fibres de DNA, sur les régions riches en bases pyrimidiques (Taylor et al, 1967).
Kourilsky (1968) a décrit la synthèse de cinq espèces de
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4. Terminaison de la chaîne de RNA
Le fait que le RNA trouvé dans les cellules est le produit de transcription d'unités génétiques du DNA suggère qu'il peut y avoir des mécanismes spécifiques de terminaison de la transcription des molécules de RNA comme il y en a pour l'initiation.
Il se peut que ce soit des sites reconnaissables par la RNA polymérase. D'après Richardson (1970), à partir d'un système in vitro formé par du DNA ou T^, de la RNA polymérase d'E.coli et en présence de KCl 0,2 M, il semblerait que la RNA polymérase est capable de terminer la synthèse de RNA, de se dissocier du modèle et de réinitier une nouvelle chaîne de RNA.
Cependant, des expériences moins récentes montrent que les molécules de RNA synthétisée in vitro atteignent une taille largement supérieure à celle des RNA synthétisés in vivo sur le même matériel.
Ainsi, par exemple, la taille du RNA isolé in vitro après vingt minutes de réaction a un coéfficient de sédimentation de 25S [Bremer et Konrad, 1964). In vivo, dans les mêmes conditions de marquage, son coéfficient de sédimentation est de 14S (Asano, 1965].
Cette constatation suggère que la RNA polymérase ne reconnaît pas les sites de terminaison de la transcription.
Ces différences pourraient résulter d'une dégradation du RNA synthétisé in vivo au cours de la purification.
Il est possible également qu'il y ait un phénomène de dégradation naturel, inexistant dans le système in vitro.
En 1969, Roberts rapporte l'isolement et la purification
d'un facteur protéique (le facteur ) à partir d'E.coli permettant
la terminaison et la relâchement des molécules de RNA synthétisées in vitro sur un DNA de phage X. Les expériences montrent qu'il réprime la
synthèse des sites spécifiques du modèle.
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Produit par le gène N de la carte génétique du phage X, il peut s'associer en un site spécifique du DNA, empêchant ainsi la progression de la RNA polymérase ; ou s'associer à l'enzyme et agir
au moment où celle-ci atteint un point de terminaison ; ou encore profiter d'un changement de configuration de la RNA polymérase au point de
terminaison, interagir avec l'enzyme, permettant ainsi l'arrêt et la libréation du RNA.
Stent [1964) suppose que les ribosomes peuvent catalyser le relâchement des molécules de RNA synthétisées sur le DNA. Ce
problème sera soulevé dans le troisième chapitre de l'introduction concernant les mécanismes de régulation de la synthèse du RNA.
.Résumé
Les résultats de fixation de l'enzyme sur le DNA, l'initiation et la polymérisation du RNA analysés dans des expériences in vitro et in vivo ont été comparés, par Bremer et Bruner (l9S8) et Summers et Szybalski
[196B), en utilisant comme matériel du DNA de phage natif ou dénaturé et de la RNA polymérase d'E.coli. Ils nous permettent de résumer les arguments précités.
- La RNA polymérase reconnaît,in vitro,les mêmes sites de liaison qu'in vivo - La RNA polymérase se fixe sur un nombre de sites restreint d'un DNA
natif, tandis que sur un DNA dénaturé la quantité de RNA synthétisé est plus élevée ; dans ce dernier, la configuration du DNA en monofibre rend les régions pyrimidiques plus accessibles que dans le DNA natif. - La synthèse de RNA se fait sur la même chaîne in vitro qu'in vivo.
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En conclusion, les expériences réalisées in vitro mettent en
évidence la sélectivité de la transcription due à une étroite corrélation entre la RNA polymérase, le modèle et la présence de nucléotides
triphosphates dans le milieu réactionnel. Elle est manifestée tant par la lecture de certaines portions du modèle seulement que par son asymétrie. Cependant, comme nous l'avons indiqué plus haut, elle requiert une
certaine intégrité du matériel, et, de plus, certains mécanismes de régulation pourraient nous échapper dans ce type d'expérience.
L'ensemble de ces constatations nous ont incités à travailler préférentiellement in vivo.
B. Mécanismes de régulation de la transcription
La quantité d'un RNA déterminé présent dans un système cellulaire est régulée d'une manière très précise en vue de son usage métabolique dans la cellule. Cette régulation se situe aussi bien au niveau de la synthèse qu'au niveau de sa terminaison.
Cette régulation se manifeste par l'action du génome, de la RNA polymérase et des ribosomes.
1. Râle du génome dans le mécanisme de la synthèse de RNA
Jacob et Monod (1961) ont déterminé sur les systèmes bactériens la structure et le mode de fonctionnement de l'unité opérationnelle :
- l'opéron, constitué d'un opérateur, d'un gène de régulation et de gènes de structure, est l'unité génétique de l'expression coordonnée.
- le gène de régulation situe à gauche de l'opérateur, sur la carte
génétique, contrôle la production d'une protéine de structure, au niveau de la transcription ;
- l'opérateur est la portion de DNA servant de site de reconnaissance du répresseur émis par le gène de régulation contrôlant la transcription ; - les gènes de structure codent chacun la structure d'une pro.téine.
Dans un système inductible, le gène de régulation forme une protéine agissant au niveau de l'opérateur, mais dont l'effet serait levé par le métabolite inducteur.
Dans un système répressible, le produit du gène de régulation, ou aporépresseur inactif, serait activé par un métabolite corépresseur.
En 1964, Jacob et ses collaborateurs suggèrent l'existence d'un site supplémentaire localisé entre l'opérateur et les premiers gènes de structure : le promoteur. En 1960, Ippen et ses collaborateurs situent ce promoteur entre l'opérateur et le gène de régulation et
supposent qu'il est l'initiateur de la transcription. SzybalskX, en 1966, émet l'hypothèse que le promoteur correspond aux régions pyrimidiques sur lesquelles se fixe la RNA polymérase. D'après ces auteurs, le
répresseur actif, en se liant à l'opérateur, n'empêcherait pas la liaison de la RNA polymérase sur le promoteur, mais bloquerait sa progression vers le gène de structure de l'opéron, dans le cas de l'opéron lac chez E.coli.
Périodicité de la transcription
Plusieurs auteurs ont détermine une périodicité dans la
transcription. Les premiers résultats sont obtenus sur des microorganismes.
Au cours du cycle cellulaire
Halvorson et al, en 1964, ont pu voir,par analyse chromato- graphique sur colonne de MAK, que les particularités distinguant les différents RNA synthétisés, se retrouvent périodiquement au cours des cycles cellulaires.
Tandis que Rudner et al (1964) observent chez E.coli K12 (Hfr.H) que la vitesse de synthèse et la composition en bases des RNA dénotent une alternance (rythmique) qui se répète au cours des cycles cellulaires.
Quant à Cutler et Evans (l96S), ils ont essayé de déterminer si l'ordre de transcription est séquentiel par une expérience devenue classique. Des cultures de levure synchronisées sont incubées pendant le même laps de temps dans de la 5 BUdR radioactive à différents moments durant le cycle cellulaire. Les fragments lourds de DNA sont isolés de chacune de ces cultures par centrifugation dans un gradient de césium.
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Dans une série d'expériences parallèles, le RNA est marqué au P durant les,memes intervalles. Des hybridations entre RNA marqué et les
fragments lourds de DNA permettent aux auteurs de conclure qu'au cours du cycle cellulaire certaines régions du génome sont transcrites plus activement que d'autres à des moments caractéristiques.
L'ensemble de ces expériences impliquent qu'il existe un "ordre" dans la synthèse des classes de RNA dans les microorganismes.
Au niveau d'un même opéron
D'après des expériences récentes, il semblerait que la.
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temporelles précises. Baker et Yanofsky (196S), Imamoto (196S), Ito et Imamoto (19S8) donnent un schéma représentant l'initiation de la transcription de l'opéron trp de E.coli K12, Ils synchronisent la transcription de cet opéron en l'inhibant pendant 10 à 12 minutes par une faible concentration de tryptophane (le temps de la transcription durant de 6 à 10 minutes) dans des cultures préincubées dans un milieu minimal. Le temps 0 de la transcription synchronisée correspond à la dérépression du système par un analogue du tryptophane ; l'acide indol-3- proprionique. Au cours du temps suivant la synchronisation, on ajoute , du tryptophane au milieu; le RNA transcrit, marqué à l'uridine tritiée est extrait et hybridé à des segments de phage 080 (A, A-C, D-E et A-E) transducteur de l'opéron tryptophane.
,Les résultats indiquent que 2,5 à 4,5 minutes après la
synchronisation, le second traitement au tryptophane empêche un deuxième cycle de transcription; 3,5 à 7,5 minutes après la synchronisation, un
second traitement au tryptophane empêche un troisième cycle de transcription.
Schéma de la transcription de l'opéron trp chez E.coli La RNA polymérase commence le premier cycle et la transcription du premier gène E dure environ 2,5 minutes après la dérépression.
Une seconde RNA polymérase entreprend le deuxième cycle de
transcription lorsque le premier enzyme est à la fin du gène D, c'est-à-dire 4,5 minutes après la dérépression.
Une troisième polymérase commence un troisième cycle lors de la fin de lecture de l'opéron par le premier enzyme,soit 9,5 minutes, environ, après la dérépression, le second enzyme se trouvant en fin de D.
Promoter Genes Operator| £ Tryp-operon }...|| Sites of délétion tenninl i i * AE5 AE8 AD28 AD molécules 1 < ■ i 1 f 1 ! 1 5 AC4 AB7 '^ -■J.U.X& ' ' ' ' ---Trorg- ■--- ■ . 1U i; ® ^ ' 7; .• '0S~^ ' . ® ' il. i.U. 1 t i 1 t 1 1 i 1 t 1 1 1 1 1 0 12 3 4 1 1 1 1 1 5 6 7 6 9 Schéma de la transcription de l'opéron trp chez E.coli, d'après Imamoto (196S]
Connaissant le coefficient de sédimentation du RNAm transcrit sur l'opéron entier, qui est de 33S, les auteurs en ont tiré le nombre de nucléotides, soit 6.700. Le nombre de nucléotides entre deux RNA
polymérases étant de 2.400 à 3.000, les auteurs en ont conclu que la vitesse de transcription était de 1.200 nucléotides par minute.
La périodicité de l'initiation n'est pas encore bien expliquée. Des mécanismes possibles comprenant l'inhibition du répresseur, des
modifications du promoteur ou de l'opérateur, l'activation de la RNA polymérase et la coordination de la traduction et de la transcription pourraient y jouer un râle.
Que la traduction intervienne dans la régulation de la
3. Relation entre transcription et traduction
Rôle des ribosomes sur la vitesse d'initiation
D'après Stent (1964) et Shin (1966) a.b., la vitesse de synthèse de RNAm peut être réglée par son utilisation. Ils postulent que le RNAm se décroche de son modèle par la présence des autres cons tituants du système protéique.
La transcription et la traduction seraient donc coordonnées ( Miller ; Beatty, 1970). L'association du RNA naissant au DNA ne ferait intervenir qu'une faible quantité de bases (Chamberlin et Berg, 1964), laissant la portion restante de RNA, libre et accessible à d'autres intéractions. Cette hypothèse est soutenue par le fait que dans le
complexe entre le RNA nouvellement synthétisé et le DNA de phage 0X174 à double chaîne, la portion résistante à la RNAse correspond à la termi naison de la chaîne en voie de croissance (Hayashi, 1965)^ Elle est également défendue par la formation.in vivo d'un complexe RNA polymerase -DNA - ribosomes (Byrne, 1964), réaction qui dépend de la synthèse de RNA (Revel et al, 1968 aj,b.). Ceci suggérerait la synthèse et l'utili sation simultanée du RNAm, d'autant plus que la direction de la transcrip tion est la même que celle de la traduction (ihacti; 1965, 1966).
Ces travaux permettent d'envisager que les ribosomes parti cipent activement à la séparation du RNAm du modèle (Byrne, 1964; Wood, 1964; Zillig, 1964; Bremer, 1965; Jones et al, 1968), et peut-être à l'initiation de la transcription.
Bautz (l967) propose un modèle de régulation de vitesse
P = RNA polymerase
■ 0 = opérateur
Modèle de régulation de vitesse de l'ini tiation de la trans cription par les ri bosomes. Bautz (1967)
Plusieurs auteurs démontrent , par des expériences in vitro, que la vitesse d'initiation de la synthèse de RNA serait stimulée par une pro téine agissant sur la sous-unité 30S des ribosomes actifs, appelée facteur C. (Shin, 1966 a.b.; Revel, 1967; 1968 a.b.; Brown, 1968 a.b.).
Râle des ribosomes sur la vitesse d'élongation du RNA messager
Des expérimentateurs notent qu'in vivo, la vitesse d'élongation pour les chaînes de RNA croissantes, diminuerait pour atteindre un plateau 30 à 60 minutes plus tard (Krakow, 1966; So et al, 1967). D'après ces auteurs, cette diminution serait due à une inhibition provoquée par la présence du RNA nouvellement synthétisé. En effet, ceci est démontré par des expériences in vitro, dans lesquelles la vitesse de synthèse de RNA est mesurée, en présence de RNase, par l'apparition de pyrophosphates. Il semble donc, que la RNase .. lève l'inhibition (Krakow, 1956; Maitra,
Cependant, dans des expériences in \/itro, pour qu'un RNA exogène puisse inhiber la synthèse de RNA, il faut qu'il soit placé
dans le milieu réactionnel avant le début de la synthèse (lissière, 1963). D'autre part, cette inhibition n'est pas directement proportionnelle à la taille du RNA synthétisé (Bremer, 1967; Fuschs, 1967),
Donc, il semble qu'un mécanisme particulier, lié à la production d'un RNA, permette l'inhibition de l'activité de la RNA polymérase et que cette inactivation soit un processus faisant intervenir le RNA.
Pour Geindushek (l969), il y aurait une autre hypothèse pour expliquer ce phénomène : la fixation des ribosomes sur le RNAm, très proche de la RNA polymérase, l'envelopperait et paralyserait, en quelque sorte, son cheminement le long de la chaîne du DNA.
Ribosomes et inactivation du RNA messager
Le mécanisme d'inactivation du RNAm pourrait être la dégradation de celui-ci. De nombreuses expériences prouvent que l'inactivation du messager se produit à l'extrémité 5' de la molécule, et a la même pola rité que la traduction et la transcription (Morse, 1968; 1969^; 1969j^), Morse et al (l96S), ainsi que Ita et Imamoto (1968), montrent que le RNAm du tryptophane d'E. coli est fonctionnellement inactif à son extrémité 5' avant que le RNA polymérase n'ait achevé la transcription de l'opéron. L'explication est la suivante ; les ribosomes se fixant près de
la RNA polymérase, permettent une traduction immédiate. Ils protégeraient le RNAm d'une dégradation se faisant dans le sens 5'--- ^3' de la molécule. Les ribosomes étant passés, une dégradation du RNAm libéré, commencerait immédiatement,
Des expériences réalisées in vitro par Castles et Singer (1969), prouvent que les ribosomes protègent le polyLi de la dégradation exonucléo- tidiquB par la polymucléotide phosphorylase et la RNase II.
Ces observation se sont faites surtout sur des organismes
C. Complexe DNA-RNA, sa structure et sa composition
Des expériences réalisées in vitro ont permis de confirmer dans une certaine mesure, l’existence d'un complexe intermédiaire "stable" formé lors de la tanscription d'un RNA sur un DNA, Cependant, les carac téristiques de tels complexes dépendent du DNA servant de modèle à cette synthèse. En effet, plusieurs types de complexes ont été obtenus dans des expériences réalisées tant in vitro qu'in vivo sur divers matériels et dans des conditions expérimentales différentes.
I, Complexes in vitro
1] Trois possibilités de structure et de composition
d'un complexe DNA-RNA sont retenues. D'après Chamberlin et Elberg
(1964), en incubant un DNA de phage 0X174 à une seule chaîne, en présence d'une RNA polymérase d'E, coli et des quatre nucléotides triphophates, il y aurait formation d'un complexe DNA-RNA stable , se situant sur un
gradient de densité de sulfate de césium, au même endroit qu'un hybride artificiel ( Ç. = 1,505) et possédant la même température de fusion. Les courbes de température de fusion indiquent qu'il n'est constitué que . d'une fibre de RNA et d'une fibre de DNA formant une double hélice, comparable à celle du DNA. L'auteur n'a pas cherché à savoir s'il y avait une protéine associée aux deux acides nucléiques. Le RNA libre ne commence à apparaître dans le milieu de synthèse que lorsque, dans l'hybride, les proportions de chacun des acides nulcéiques sont égales
(Bassel, 1964), D'après Chamberlin et Berg (l964), il n'est pas possible d'imaginer un complexe stable à partir d'un DNA à double fibre,
2) Des auteurs tels que Bremer et Konrad (l964) affirment
au contraire que le RNA synthétisé par la RNA polymérase d'une double hélice .de DNA comme modèle, peut être isolé comme un complexe stable. D'après Richardson (l966) un DNA de phage T à double fibre en présence
7
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triphosphates, produirait un ccftplexe "stable" formé d'une région de chaîne à double hélice du DNA, une chaîne de RNA et de protéines en l'occurence, la RNA polymérase. En effet, pour une force ionique
élevée . , cette structure présentant un seul pic dans un
gradient de saccharose, se dissocie en deux pics, en présence de SDS 0,2%, l'un correspondant au DNA de phage l'autre au RNA.
3) D'après Hayashi (l96S) ab, il y aurait formation
d'un complexe stable au cours de la transcription d'un RNA sur un DNA de phage 0X174 sous sa forme réplicative (RF), Cette structure serait résistante à la RNase et se déplacerait le long du DNA, Elle serait formée d'une double hélice de DNA et d'une chaîne de RNA, Sa position dans un gradient de densité se situerait entre le DNA de phage 0X174 (RF) et le DNA une seule fibre.
Ces structures proposées pour les systèmes in vitro peuvent l'être, dans une certaine mesure, pour les systèmes in vivo.
2. Complexes in vivo
1) Pour Konrad et Stent (l964), travaillant sur un
complexe naturel à partir du système phage - E. coli semblable à celui de Spiegelman et al (l9Sl], de même que Bremer et Konrad (1964], le RNA naissant serait associé à l'une des chaînes du DNA par l'intermédiaire d'une protéine. Des travaux effectués sur des organismes pluricelluliares indi quent l'existence d'un complexe DNA-RNA dont la structure contiendrait aussi une protéine (Bonner et al, 1961; Mead, 1964). Pour Swingle et
Cole (l966) qui ont travaillé sur le foie de rat, la trypsine détruit cette protéine, libérant ainsi les deux acides nulcéiques que l'on peut séparer sur une colonne de Sephadex,
2) L'hybride proposé par Schulman et Bonner (l962),
structure hélicoïdale, constituée de deux fibres de DNA et d'une fibre de RNA.
Deux expériences sont menées parallèlement : dans la première, servant de témoin, la courbe de température de fusion est drés- sée en soumettant le complexe à des températures croissantes, '
Dans la seconde, le complexe dénaturé est traité à la RNase pancréatique renaturé, et sa courbe de température de fusion est déterminée comme dans le témoin. La temérature de fusion est plus élevée que dans la première expérience, impliquant que le DNA est renaturé, le RNA ayant été digéré par la RNase.
Certaines restrictions doivent être apportées dans les expériences de Schulman et Bonner ' 1962 et Swingel et Dole, 1966 : toutes leurs données sont uniquement basées sur des mesures de densité optique.
. Des expériences comparatives réalisées par Hayashi, en 1966 sur un complexe formé d'une part in vitro, à partir de DNA de phage 0X174 (RF), de RNA polymérase extraite à ;partir d'E.coli et des quatre nucléoSides triphosphates, et d'autre part, in vivo à partir d'E.coli, 5 minutes après infection par du phage 0X174, donnent des résultats rigoureusement identiques quant à la structure du complexe formé de deux fibres de DNA et d'une fibre de RNA, la taille et le poids moléculaire du RNA nouvellement synthétisé. Dans des résultats ultérieurs, ce même auteur a prouvé l'absence de protéine intervenant dans la structure de ce complexe (Hayashi et Hayashi, 1968).
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En résumé, deux structures de complexe obtenues in \/ivo sont à retenir ; l'un proposé par Bremer et Konrad (l964) et dont la stabilité dépend de l'intégrité de la RNA polymérase, l'autre par
Hayashi (1966,1968) et qui est constitué de deux fibres de DNA dont l'une formerait un hybride avec le RNA naissant, et dépourvu de protéine.
Ce complexe-ci, parfaitement stable, même en présence de déprotéinisant ou dans un gradient de césium, serait partiellement résistant à la RNase,
Ces deux modèles ne sont pas incompatibles l'un avec l'autre. Il est vraisemblable que la différence de stabilité de ces deux types de complexe soit due au fait que, dans le premier cas, le DNA est linéaire et dans l'autre cas, il est circulaire, La réassociation des deux fibres circulaires est peut-être plus difficile que dans le cas du DNA linéaire, et par conséquent, le RNA naissant resterait plus longtemps et plus solidement fixé au DNA, sous forme d'hybride.
Il est possible que le complexe d'Hayashi soit incomplet et que la RNA polymérase intervenant dans sa structure soit,éliminée au cour: des procédés de purification. De même, il se peut que le RNA naissant du système de Bremer et Konrad, soit hybridé au modèle, mais qu'étant donné la structure de celui-ci, il s'en décroche plus facilement, sauf dans la région du DNA associée à la RNA polymérase (Richardson, 1969) ,
Le RNA transcrit peut former un hybride avec une des chaînes du DNA lui servant de modèle. Récemment, des complexes DNA-RNA formés par la RNA polymérase d'E,coli sur un DNA monofibre fl ont été
étudiés par diffraction aux rayons X; cette analyse montre que ces hybrides sont en double hélice dans laquelle une des chaînes est antiparallèle à l'autre (wiilman, 1967),
3, Propriétés générales d'un complexe DNA-RNA
Les résultats obtenus par de nombreux auteurs, nous ont orientés et servis de critères dans notre travail,
a) Brunfaut et al, en 1967, observent qu'il existe un
32
b) D'autre part, la composition én bases de ce RIMA
rapidement marqué révèle qu'il est de type AU.
c) Et qu'il est essentiellement nucléaire (Perry, 1960 ;
Perry et al, 1961 a) b} ; Srinivasan, 1963 ; Sidebottom et Harris, 1969).
d) Et de faible poids moléculaire : lorsqu'il est isolé
d'un système in vivo, tel que des cellules de HeLa en couche monocellulaire, son coéfficient de sédimentation est de 4S à 6S (Krsmanovic, 1965 ;
1967 a) b) ).
e) Ce RNA rapidement marqué peut être isolé, après deux déprotéinisations au chloroforme-alcool-isoamylique, conjointement au DNA, sur une colonne d'albumine méthylée d'après la méthode de Ellem, 1966.
f) Il se situe à la même densité que le DNA dans un gradient de césium (Yanofsky et Spiegelman, 1962 ; Kidson et Kirby,1964).
g) Il est totalement (Richter et Senger, 1965 ; Brunfaut et al, 1967) ou partiellement résistant a la RNase (Kidson et al, 1963 j Kidson et Kirby, 1964 ; Bassel, 1964 ; Bokowska, 1964).
h) La dissociation de ce complexe par la chaleur à basse force ionique et la séparation des deux acides nucléiques dans un gradient de CSgSD^ (Hayashi et al, 1965 a) b) ; 1966 ; Levis et al, 1967 a) b) ) suggèrent que le RNA rapidement marqué est associé au DNA par des ponts hydrogènes.
L'ensemble de ces constatations fait supposer que le complexe se présente sous forme d'hybride.
33
L'ensemble de ces caractéristiques relevées au cours de notre travail ne constitue pas une preuve formelle de la présence d'un RNA en voie de transcription associé au DNA sous forme d'hybride tel que plusieurs auteurs l'ont présenté.
Remarques : a) La petite taille de ce RNA rapidement marqué s'écarte
considérablement de celle des RNA rapidement marqués que l'on isole par d'autres méthodes pendant un même temps de synthèse (Bremer et Konrad, 1964 ; Hayashi, 1965 a) b) ; Richardson, 1966 c) ; Shin, 1966), ainsi qu'avec la taille élevée des RNA précurseurs (Scherrer et Darnell, 1962 ; Yoshikawa-Fukada, 1965 ; Penman, 1966),
b) Il est à noter, cependant, que le faible poids moléculaire de ce RNA transcrit pourrait dépendre des conditions expérimentales et des moyens de purification utilisés. Les procédés employés par Levis et al ne sont pas les plus doux et occasionnent des pertes ; nous nous sommes proposé de rechercher une méthode de purification plus douce.
c) Il a été suggéré que, quels que soient le matériel et la méthode expérimentale utilisés, ce complexe n'est pas un artéfact ;
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D. RNA rapidement marqué dans les cellules de mammifères
1. Hétérogénéité du RNA
Dans une cellule de mammifère, on relève actuellement l'existence de cinq espèces de RNA différents par leurs propriétés physico-chimiques et par leur rôle dans la synthèse protéique.
1°. Le RNA ribosomial intervient pour 60°/o dans la constitution des ribosomes, les 40% restant étant constitués de protéines. Il représente 80% des RNA cellulaires (Davidson, 19S9)cu
2°. Un RNA 5S (Oalibert, 1965) d'origine ribosomiale (Oalibert et al, 1967), distinct du RNA 4S, car ne possédant pas de bases méthylées, et trouvé dans la cellule, solidement associé aux ribosomes [Porget, 1967) à rtdson d'une molécule par.sous-unité 5QS (Brown et Weber, I960)
3°, Un RNA 7S dont la composition en bases est semblable à celle du RNAr, mais possédant peu de bases méthylées. Une molécule de RNA 7S est associée à la molécule de RNAr 288 par ponts hydrogènes (Pene et al, 1968)
4°. Les RNA 48 transporteurs des acides aminés et constituant 10% des RNA cellulaires (Hoagland et al, 1957 ; Davidson, 1969J,
5°. Les RNAm servant d'informateurs pour la séquence d'acides aminés de la protéine, correspondant au code génétique et constituant une population de taille hétérogène. Ils représentent 5% des RNA cellulaires (Davidson, 1969)a^.
en révèle quatre à neuf espèces différentes. Notablement méthylés, leur proportion en G + C est de 47°/o à 54°/o. Aucun des résultats
rapportés jusqu'à présent ne permet d'attribuer une fonction à ces petits RNA, absents du cytoplasme. Ils ne semblent ni participer à la bio
synthèse protéique, ni servir de précurseurs, car ils sont métaboliquement stables : leur demi-durée de vie est de quelques jours pour un temps de génération de 24 heures [Weinberg et Penman, 1969], Peut-être jouent-ils un rôle purement structural, ou bien interviennent-ils dans la mitose (Weinberg et Penman, 1968). Ces RNA ont également été découverts dans des cultures de cellules supérieures [Rein et Penman, 1969).
^• Lieu de synthèse des RNA rapidement marqués
L'étude de l'incorporation des précurseurs radioactifs du RNA a révélé que la synthèse initiale de celui-ci a lieu essentiellement dans le noyau. En effet, la radioactivité apparaît en premier lieu dans le RNA nucléaire, puis seulement dans le cytoplasme [Perry, 1960 ;
Zalokar, 1960 ; Perry et al, 1961 a) b) ; Srinivasan et al, 1963). Il semblerait donc que la majorité du RNA cytoplasmique vient du noyau. D'ailleurs, l'apparition de la radioactivité dans le cytoplasme se fait avec un retard de quelques minutes [Perry, I960).
Des expériences de microirradiations aux rayons U.V. [2 p) détruisant sélectivement les nucléoles ont permis de démontrer une diminution de 70°/o de l'incorporation de précurseurs radioactifs dans le RNA cytoplasmique ; on en conclut que les 30% restant ne sont pas
contrôlés par le nucléole, mais par le,restant du noyau [Perry, 1961 a) ; Takeda et al, 1967).
:5b
Le noyau n'est pas le seul site de synthèse de RNA : en effet, plusieurs observateurs présentent l'évidence de la présence d'un DNA à double hélice dans les mitochondries (Nass et al, 1963 a) b) ; Schatz et al, 1964 ; Kalf, 1964 ; Rabinowitz et al, 1965} et Luck et Reich (l964) trouvent un complexe formé d'une RNA polymérase associée à un DNA; dans les mitochondries de Neurospora Crassa, il existe également un RNA associé à l'enveloppe mitochondriale (Neubert et Helge, 1965).
La présence simultanée de flNA, de RNA et de RNA polymérase dans les mitochondries suggérerait que celles-ci pourraient synthétiser des protéines sans l'intervention du noyau.
Il serait intéressant de savoir si le DNA associé au RNA rapidement marqué que nous voulons isoler à partir de cellules HeLa est contaminé par du DNA mitochondrial. En effet, d'après les consta tations précitées, il n'est pas exclu de supposer que les mitochondries peuvent transcrire certains de leurs RNA.
Pour autant que les mécanismes de transcription nucléaire et mitochondriale soient synchrones et qu'après 30 minutes d'incubation il y ait un RNA rapidement marqué dans les mitochondries, une mauvaise séparation des complexes DNA-RNA nucléaires et mitochondriaux risquerait de fausser l'interprétation de nos résultats.
Chez HeLa, 12% du DNA total serait constitué de DNA mitochondrial. Cependant, les résultats sont peu nombreux, et il est difficile d'affirmer l'absence de contamination de DNA nucléaire
(Radloff et al, 1967). Il semble également possible de les séparer dans un gradient de CsCl ; malheureusement, les auteurs ne donnent pas les densités des DNA respectifs.
Cependant, Rabinowitz et al (î965) observent que du DNA mitochondrial extrait de coeur et de foie de poulet embryonnaire se situe dans un gradient de chlorure de césium à une densité différente de celle du DNA nucléaire : elle est de 1,707 gr/ml, tandis que celle du DNA nucléaire est de 1,6EB gr/ml.
Des travaux menés par Luck et Reich (1964) suggèrent que.le DNA mitochondrial est plus léger que le DNA nucléaire, tandis que ceux de Clayton et Vinograd montrent qu'il est plus lourd. Pour Koch (1969), dans des cultures de foie humain (Chang), une distinction entre DNA mitochondrial et nucléaire peut se faire selon la structure.
3. Nature des RNA rapidement marqués
RNA messager : la transcription produit des RNA de très grande taille se présentant dans le cytoplasme sous forme de RNA de plus petite taille
De nombreux auteurs se sont attachés à isoler un D-RNA nouvellement formé à partir d'organismes supérieurs et se sont aperçu qu'il sédimentait à une vitesse de sédimentation de 30 à 70S, correspondant
g
à un PM de 2 à 5 10 , selon le matériel et les méthodes utilisés
(Oerogiev et Lerman, 1964 ; Samarina et al, 1954 ; Yoshikawa-Fukada, 1964 ; Scherrer et al, 1966; Attardi et al, 1966 ; Warner et al, 1966).
De plus, les RNA isolés à partir du cytoplasme des cellules animales n'ont un coéfficient de sédimentation que de 16 â IB S,
g
correspondant à un PM de 0,5 à 0,6 10 (Srawerman et al, 1E?63 ; Di
Girolamo et al, 1964 ; Penman et al, 1963 ; Samarina, 1964 ; Samarina et al, 1965 b) ).
Ceci fait suggérer que les D-RNA géants sont des précurseurs du RNA cytoplasmique qui, lors de leur passage dans le cytoplasme, sont cassés en plus petites chaînes dans le noyau (Samarina, 1964 ; Georgiev,
1967 ; Scherrer et Spohr, 1970 ; Darnell et al, 1970).
Il existe deux classes de D-RÎMA dans le noyau
Ces mêmes expériences d'hybridation compétitives permettent de suggérer qu'une partie du RNA nouvellement formé est rapidement détruit sans quitter le noyau.
Il existerait donc deux classes de D-RNA : D-RNA^, précurseurs du RNAm cytoplasmique et le D-RNA^i qui se dégrade au sein du noyau sans jamais atteindre le cytoplasme.
RNA ribosomial : les RNA ribosomiaux subissent le même genre de transformation au sein du noyau
Des expériences de chassage en présence d'Actinomycine 0 et d'hybridations compétitives montrent que le RNAr géant nucléaire 45S est un précurseur des RNA cytoplasmiques 28S et IBS (Scherrer et al, 1963 ; Perry et Srinivasan, 1964).
Selon le schéma de Zimmerman (1967), le RNA polycistronique 45S se scinde au sein du noyau en deux RNA 28S et IBS.
Plus tard, il a été démontré que seulement 50% de la molécule originale se transforme en RNAr 28S et IBS, les 50 autres pourcents ne se retrouvent pas dans le cytoplasme, ce qui fait supposer que cette partie de la molécule s'est dégradée dans le noyau (Lerman et al, 1965 ; Jeantheur et al, 1968 ; Willems et al, 1968).
E. Différences entre les Procaryotes et les Eucaryotes
1, Le génome des organismes supérieurs (Eucaryotes) contient
un grand nombre de séquences_de bases répétées
Il a été démontré, lors de cinétiques de renaturation de DNA (Britten et Kohn, 1968) ou d'hybridations DNA-RNA (Ananieva et al, 1968 ; Georgiev, 1968 ; Church et Mc Carthy, 1968 ; Melli et Bishop, 1969)
qu'une partie du génome est constituée de séquences de bases hautement répétées. Chez les mammifères, près de 5 à 20°/o du génome sont représentés
2 par des séquences de bases répétées plusieurs centaines de fois (de 10
G
à 10 • dans certains cas).
Il ressort d'expériences d'hybridations également que, chez les organismes supérieurs, elles n'ont pu se réaliser que sur des RNA synthétisés principe dement sur des séquences de bases répétées.
L'hétérogénéité des séquences de bases non répétées est trop grande pour permettre des hybridations dans les conditions usuelles expérimentales actuelles.
Il est intéressant de constater que les séquences répétées se trouvent surtout dans le D-RNA^ : un D-RNA cytoplasmique s'hybride moins bien que le D-RNA nouvellement formé. Il en est de même pour le RNA 188 (Arion et Georgiev, 1967 ; Shearer et Mc Carthy, 1967),
2. La transcription chez les Eucaryotes peut être spécifiquement
inhibée par des protéines appartenant au complexe DNP
(chromatine), c'est-à-dire les déoxyribonucléoprotéines, en particulier, les histones
Il a été observé par des expériences d'hybridation que le RNA transcrit sur un DNA libre s'hybride 4 à S foix mieux que le RNA
