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Texte intégral

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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Massamba Ne, N. (1979). Etude de la bêta-galactosidase chez Physarum polycephalum schw (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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(2)

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES

Laboratoire de Chimie Biologique

ETUDE DE LA/3-GALACTDSIDASE CHEZ PHYSARUM POLYCEPHALUM schw.

Mémoire présenté en vue de l'obtention du grade de

Docteur en Sciences Chimiques

MASSAMBA ne NGANGU

1979

(3)

Grâce à l'isolement des RNA messagers de quelques protéines de plantes supérieures, on pourrait établir si les gènes correspon dants ont une structure discontinue ou non chez ces organismes

(4)

page 4 17e ligne à partir du haut,

lire "sporanges” au lieu de "spores"

10e ligne à partir du bas,

lire "ou sphérulation" au lieu de "sporulation"

page 8 2e ligne à partir du haut,

lire "polygalactose" au lieu de "polygactose"

3e ligne à partir du bas,

lire "enzymes" au lieu de "activités"

page 11 10e ligne à partir du bas,

lire "et non après" au lieu de "et après"

page 16 14e ligne à partir du haut,

lire "travaux de Monod" au lieu de "travaux"

page 79 10e ligne à partir du haut, lire "300 %" au lieu de "300"

page 98 fig. 24, indications à droite, lire "10 , 20 et Activité (U)"

page 100 3e ligne à partir du haut,

lire "0,5 M" au lieu de "0,05 M"

page 143 dernière ligne,

lire "dite exoplasmodiale de Physarum (Pilly et al. 1978)"

au lieu de "dite"

(5)

sujet de recherche. Il nous a suivi tout au long de ce travail avec beaucoup d'intérêt et une attention toute particulière, en nous faisant bénéficier de sa grande expérience de "Scientifique avisé". Nous tenons à. lui exprimer nos sentiinents profonds de reconnaissance, d'admiration et d'affection.

Nous avons eu la chance de travailler aux côtés des professeurs A. Burny et A. Sels, des docteurs G. Marfaaix, G. Huez et H. Grosjean : nous les assurons ici de notre sincère gratitude pour les multiples discussions et conseils judicieux dont ils nous ont fait profiter.

Nos vifs remerciements s'adressent à Madame G. Steinert, du laboratoire de Cytologie et Embryologie moléculaires, à Madame

G. Vanheule ainsi qu'à Monsieur le Professeur D. Dekegel de l'Institut Pasteur du Brabant pour leur importante contribution dans la réalisation de ce travail.

Que Madame Leclercq, Yvette, Suzy et Gabriel le trouvent ici l'expression de notre gratitude pour leur aide précieuse.

Nous remercions également tous nos camarades de labora­

toire et tout le personnel du service de Chimie biologique pour la sympathie qu'ils n'ont cessé de nous témoigner.

L'Agence Générale de la Coopération au Développement et l'Université Nationale du Zaire nous ont donné la possibilité de parfaire notre formation scientifique dans un Institut de Biologie Moléculaire de renom. Nous tenons à leur témoigner toute notre reconnaissance pour leur aide.

à Lessay, Lydie et Bena

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La recherche d'activités enzymatiques sur un extrait brut de Physarum polycephalum révèle qu'à l'état plasmodia!, ce myxoïnycète synthétise de nombreuses hydrolases.

Toutes les hydrolases que nous avons pu mettre en évidence sont des hydrolases acides, qui jouent vraisemblablement un rôle important dans le processus de digestion cellulaire.

Il importe dès lors de préciser la localisation intra- ou extra-cellulaire de ces hydrolases et de voir s'il existe une corrélation entre la localisation de ces enzymes et la manière suivant laquelle leurs activités sont ajustées pendant les changements des conditions nutrition­

nelles qui déterminent la sphérulation : phénomène de différenciation cellulaire.

Au cours de la sphérulation induite en carençant l'orga­

nisme en certains éléments nutritifs, de nombreux événements morphogénéti­

ques et biochimiques se produisent au sein du plasmode. Ainsi, on observe une élévation significative de l'activité spécifique de plusieurs hydrola­

ses acides, notamment celle de la /3 -galactosidase, qui est quintuplée lorsque la sphérulation est induite par privation du glucose ou par trans­

fert de l'organisme dans un milieu salin non nutritif.

Nous apportons des éléments d'explication de ce phénomène.

Enfin, nous avons tenté d'isoler la /3 -galactosidase et nous avons étudié quelques-unes de ses propriétés. Cependant, cette fi - galactosidase reste contaminée par la phosphatase acide tout au long du processus de purification.

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^280 ATP BCG BCP BNG CM-

° C DEAE- DNA D.O.

EDTA GDH NABG ONP ONPG OTCase P.M.

PNP PNPG PNPGlu PNPP RNA RNase SDS SP- TCA Vo Ve

absorbance à 280 nanomètres adénostne triphosphate

5-bromo~4-chloro-3-îndolyl-/3 -D-galactopyranoside 5- hromo-4-chloro-3-îndolyl-phosphate

6- broino-2-naphtyl- H -D-galactopyranoside carboxymethyl-

degré centigrade diéthylaminoéthyl-

acide désoxyribonucléique densité optique

éthylène diamine tétracétate de sodium glutamate deshydrogénase

p-nitrophenyl-N-acetyl- H -D-glucosaminide o-nitrophenol

o-nitrophenyl fi -D-galactopyranoside ornithine carbamoyl transférase poids moléculaire

p-nitrophenol

p-nitrophenyl fi -D-galactopyranoside p-nitrophenyl fi -D-glucopyranoside p-nitrophenyl phosphate

acide ribonucléique ribonucléase

dodécylsulfate de sodium sulfopropyle -

acide trichloracétique volume mort

volume d'élution

(8)

AVANT - PROPOS

INTRODUCTION 1

BUT DU TRAVAIL 22

MATERIEL ET METHODES 23

RESULTATS EXPERIMENTAUX :

I. Purification de Physarum polycephalum 40 II. Mise en évidence d'activités lytiques dans les

extraits bruts de Physarum polycephalum 42 III. Localisation d'activités lytiques dans le

plasmode de Physarum polycephalum 47 IV. Evolution de quelques activités lytiques de

Physarum polycephalum pendant la différenciation 70 V. Etude de l'accroissement de l'activité fi -

galactosidasique pendant la sphérulation 82 VI. Purification de la /5 -galactosidase de

Physarum polycephalum 92

CONCLUSIONS ET DISCUSSION GENERALE 137

BIBLIOGRAPHIE

145

(9)

Au cours de ce siècle, d'énormes progrès ont été accomplis en biologie et plus particulièrement en biologie moléculaire grâce à l'utili­

sation d'"organismes modèles" E. Coli, Neurospora ou levures dont certains n'ont pas d'importance biologique particulière mais constituent de bons systèmes pour l'étude de problèmes majeurs de croissance et de différen­

ciation.

Cependant, toutes les questions en biologie n'ont pas été résolues par l'étude du système E. Coli; on a examiné des organismes plus complexes mais qui offrent encore maints avantages : travailler avec les raicroorganismes est d'un accès méthodologique facile, permet d'effectuer des analyses génétiques et d'obtenir des cultures en masse suffisante.

Durant ces récentes années, un grand nombre de scientifiques ont concentré leurs recherches sur les myxomycètes,et plus spécialement sur Physarum polycephalum. La raison de cet intérêt croissant est dû, comme nous le verrons plus loin,à la complexité du cycle de vie de ces organismes (fig. 1).

Les n\yxomycètes sont un groupe particulier de microorganismes qui présentent certaines caractéristiques de croissance typiques de quelques formes animales et végétales. Par la forme végétative qu'adoptent beaucoup d'espèces, les myxomycètes ressemblent aux animaux pendant la reproduction sexuée; pouvant produire des spores à parois cellulosiques, ils sont

cependant considérés comme des végétaux.

Du point de vue taxonomie, les myxomycètes tirent leur origine des champignons dont ils se sont écartés suffisamment au cours de l'évolu­

tion pour constituer un groupe séparé : les "myxomycotina" (Alexopoulos 1962).

Dans la nature, les tnyxomycètes se rencontrent habituellement à l'état de plasmodium (ou plasmode) en croissance sur des troncs d'arbres, sur des feuilles mortes ou à même le sol, essentiellement dans les régions tempérées de l'hémisphère nord, vivant par ingestion de bactéries, d'autres formes de vie ou de débris organiques.

Plus de 400 espèces ont été classifiées jusqu'à ce jour.

Quoiqu'aucun rôle économique n'ait été dévolu à ces microorganismes.

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Les plasmodes de 30 à 40 espèces de ir\yxomycètes peuvent être cultivés en laboratoire; dans la plupart des cas, ces cultures se font en présence de bactéries mortes ou en vie (Haugli 1971). Cependant, plusieurs espèces sont cultivées en milieux semi-définis ou complètement définis.

(11)

INTRODUCTION

1. Physarum polycephalum

Physarum polycephalum, organisme primitif eucaryote plurinucléé de la famille des myxomycètes, a fait l'objet de multiples recherches concernant les aspects fondamentaux du métabolisme cellulaire durant ces dernières années.

L'intérêt croissant porté sur Physarum polycephalum comme

"système modèle" dans l'étude des phénomènes pouvant survenir au cours du cycle de vie repose sur un certain nombre de caractéristiques biologi­

ques de cet organisme :

1) le rnyxonycète Physarum polycephalum présente des mitoses essentielle­

ment et naturellement synchrones dans la phase plasmodiale de croissance;

2) les différents stades de prolifération et de différenciation (sphérulation et sporulation) sont distincts et séparables; ils peuvent être contrôlés à volonté;

3) dans certains cas, la structure végétative appelée plasmodium ou plasmode ( — 15 cm

0 )

peut être considérée biochimiquement comme une seule cellule; cellule géante, constituée principalement d'une masse protoplasmique contenant des milliers de noyaux. La grande taille du plasmode permet d'établir une corrélation entre les changements

morphologiques et les changements dans la composition chimique

d'autant; en effet, des prélèvements d'échantillons peuvent être faits simultanément ou séquentiellement sans perturber la croissance normale du plasmode (Daniel et Rusch 1961);

4) du point de vue biochimique, Physarum polycephalum offre de nombreux avantages : l'organisme peut être cultivé en grandes quantités au laboratoire; ses organites subcellulaires, noyaux, mitochondries et particules lytiques peuvent être isolés et étudiés séparément.

Coirnie aucune paroi rigide n'entoure le plasmode, ses macromolëcules peuvent être extraites relativement facilement.

Le plasmodium est entouré d'une simple membrane plasmique : ce manque de parois externes rigides confère au plasmodium une très grande

flexibilité, unique pour une grosse cellule.

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très primitif réglé par les mêmes protéines que celles qui sont respon­

sables de la contraction musculaire chez les vertébrés : actine et tnyosine. La migration du plasmode est contrôlée aussi bien par des facteurs internes tels que l'état nutritionnel du plasmode que par des facteurs externes : lumière, humidité, ...

Si deux plasmodes sont mis ensemble, ils peuvent fusionner ou pas. La fusion des plasmodes est un phénomène très complexe et contrôlé par des facteurs génétiques. Physarum polycephalum constitue donc un matériel d'analyse des problèmesde compatibilité somatique (Carlile and Dee 1967).

Physarum polycephalum a été décrit pour la première fois par Schweinitz en 1882, mais les recherches biochimiques relatives à ce microorganisme ne datent que d'une trentaine d'années, depuis la réalisa­

tion par Daniel et Rusch (Daniel and Rusch 1961) d'une culture de Physa­

rum dans un milieu axénique semi-défini.

2. Cycle de vie de Physarum polycephalum

DIPLOPHASE haplophase

Spore germination

Swarm cell

Starved Plasmodium

wiarviru w • —.

plasmodium Sclerotia

O®®--

(Spherules)

Zygote \

\

Microplasmodia

Fig. 1 : Cycle de vie de Physarum polycephâlum (tiré de Rusch 1970)

(13)

Nous reproduisons ci-dessus le diagramme illustrant le cycle de vie de Physarun polycephalum. Ce cycle vital consiste en une alternance des générations haploïdes et diploïdes qui peuvent être étudiées en laboratoire.

La phase haploïde est limitée à une spore uni-nucléée (10 U 0) qui germe en culture liquide pour former une cellule nageuse flagellée ou bien, en surface, pour produire une amibe non flagellée

(inyxamibe).

Dans des conditions défavorables (température basse,

carence en nourriture, accumulation de produits de dégradation métaboli­

que, surpeuplement ...), ces n\yxamibes ou cellules nageuses développent une forme de résistance, un état haploïde de dormance appelé microcyste en s'enkystant dans une paroi (Koevenig 1964). Les microcystes resur­

gissent quand les conditions d'environnement deviennent favorables à la croissance.

En présence d'une alimentation adéquate, les cellules haploïdes se divisent à plusieurs reprises et forment une population considérable de cellules semblables.

La phase plasmodiale est initiée par un processus sexuel, la fusion de deux amibes qui doivent être de nature sexuelle différente.

Cette union de deux n\yxamibes ou de deux n\yxamibes flagellés conduit à la formation d'un zygote avec un noyau diploïde. Après un certain temps, le zygote perd ses flagelles et, par des divisions nucléaires successi­

ves, donne naissance à un nouveau plasmode plurinucléé.

Le plasmode est une masse protoplasmique jaune multinuclée, non limitée par des parois rigides; elle coule d'une manière amiboïde à la surface du support.

Aussi longtemps que les conditions nutritionnelles sont adéquates ou appropriées à un développement végétatif, le plasmode continue à accroître sa masse protoplasmique et cette augmentation s'accompagne de nombreuses divisions nucléaires synchrones en l'absence de toute division cellulaire.

Dans un milieu liquide agité, le plasmode se fragmente en microplasmodes contenant chacun entre 2 â 200 noyaux diploïdes; sur un milieu solide, il forme des macroplasmodes contenant plusieurs millions de noyaux diploïdes (Smith 1974).

(14)

Quand le plastnode est maintenu en état de carence nutrition­

nelle (privation), l'organisme peut encore survivre en optant pour l'une ou l'autre voie de survie :

a) en l'absence'de lumière, le plasmode carencé se clive en formant un sclérotium ou sclérote à parois très rigides. Un sclerotium est constitué d'un grand nombre de petites sphérules, chacune contenant un ou plusieurs noyaux diploïdes. Le sclérote reste longtemps en état de dormance (plus d'un an); s'il est remis dans un milieu riche approprié, il peut donner un plasmode.

La sel érotisation (= sphérulation) est abondamnent étudiée comme modèle de différenciation diploïde contrôlée par les conditions d'environnement. En laboratoire, elle peut être induite par simple transfert du plasmode dans un milieu salin non nutritif ou bien par addition de polyols (par exemple du mannitol) à forte concentration dans le milieu riche de culture. Le mécanisme de cette transformation n'est pas encore élucidé;

b) en présence de lumière, les plasmodes carencés forment des spores.

Durant ce processus de sporulation, les noyaux diploïdes subissent une méiose et des spores haploïdes sont libérés. La sporulation requiert des conditions strictes d'environnement comprenant une période de privation à l'obscurité en présence de niacine (amide nicotinique) suivie d'une brève exposition à la lumière.

Le cycle sexuel des niyxoniycètes est complet quand le

plasmode se différencie en sporanges, dans lesquelles les spores haploï­

des uninuclées sont formées.

Ainsi, il y a trois stades distincts et séparables dans le cycle de vie de Physarum polycephalum :

- une phase végétative plasmodiale de croissance

- une phase transitoire de différenciation (selérotisation, sporulation)

- et une phase sexuelle irréversible (transformation en sporanges).

Chaque phase constitue un système modèle pour l'étude expérimentale des aspects spécifiques de croissance et de différenciation.

Dans le cas de Physarum polycephalum, le cycle de vie tout entier, malgré sa complexité, peut être étudié dans des conditions définies en laboratoire. Toutes les étapes de ce cycle vital peuvent être induites dans les milieux axéniques et quelques-uns de ceux-ci sont de composition étonnamment simple.

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Nous examinerons en détail la phase de différenciation.

Dans cette phase, la sphérulation a retenu notre attention parce qu'elle est facile à induire en laboratoire et aussi parce que d'importants chan­

gements biochimiques (variations dans l'équipement enzymatique de l'orga­

nisme), objet de notre travail, accompagnent ce processus de différencia­

tion .

3. Différenciation chez Physarum polycephalum

Un système modèle pour l'étude de la différenciation ou de la régulation enzymatique doit présenter certaines propriétés, à savoir ;

X uniformité de la population cellulaire

XX facilité d'obtenir du matériel en quantités suffisantes en vue de l'isolement et de la caractérisation des protéines et autres molécules

XXX utilisation facile des traceurs isotopiques (Schimke and Doyle 1970)

xxxx possibilité d'analyse génétique directe par les mutants (Monod and Jacob 1961).

Tous ces critères s'appliquent au processus de différenciation (sphérula­

tion et sporulation) chez Physarum polycephalum.

La sphérulation et la sporulation se produisent dans la phase diploïde du cycle de vie de Physarum sans aucune interférence des phénomènes sexuels et peuvent être induites par des changements des conditions métaboliques.

3.1. Sphérulation

En réponse aux conditions défavorables à la croissance végétative plasmodiale, le myxomycète Physarum polycephalum se transforme en sclérotium ou sclérote. C'est un état de dormance prolongée dans

lequel l'organisme peut survivre pendant très longtemps (plusieurs années), tout en conservant la capacité de se régénérer et reprendre la croissance végétative dès que les conditions nutritionnelles redeviennent adéquates.

La formation des sclérotes est un phénomène courant chez beaucoup de champignons vrais (Smith 1974). Dans la nature, la

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dessication et la baisse de température peuvent induire la formation des sclérotes. D'autres facteurs tels que le pH bas (pH 2), une pression osmotique élevée (0,5 à 0,6 M de saccharose) (Sauer 1973, Smith 1974) et des concentrations sublethales en ions métalliques (Jump 1954)

induisent aussi la sclérotisation.

En laboratoire, les plasmodes de Physarum polycephalum peuvent être transformés en macrocystes après avoir atteint la phase stationnaire de croissance (Stewart and Steward 1961).

Des recherches plus récentes sur ce phénomène général de sclérotisation ont conduit à considérer un type particulier de sclérotisa­

tion appelé "sphérulation", dans laquelle les microplasmodes en croissance dans le milieu liquide agité ont été induits pour former des sphérules par choc osmotique ou par privation.

La méthode la plus facilte et la plus rapide pour obtenir des sphérules a été décrite par Daniel et Baldwin (1964) : les micro­

plasmodes en phase exponentielle de croissance dans le milieu riche standard sont transférés dans le milieu salin non nutritif. Après 14

heures, la production d'un mucus "polygalactose" commence; après 24 heures, les premières sphérules apparaissent et le processus est terminé au bout de 36 heures par conversion totale des microplasmodes en sphérules. Par cette méthode,des quantités importantes de mucus se forment; ce qui provoque un entassement des sphérules en groupes.

L'addition du mannitol 0,5 M dans le milieu de croissance contenant des microplasmodes en phase exponentielle de croissance, conduit à la formation des sphérules dans les 35 - 36 heures de l'induction de la sphérulation (Chet and Rusch 1969). Il n'y a pratiquement pas de produc­

tion de mucus avec cette méthode et les sphérules formées apparaissent bien individualisées.

Le mannitol ajouté au milieu salin non nutritif n'induit pas la formation des sphérules.

Les changements morphologiques induits par privation ou par choc osmotique sont semblables.

En pratique, les sphérules peuvent être séchées sur papier filtre stérile (ou sur membrane Millipore) et gardées à 4° C pendant des années (cfr. préparation des sclérotes).

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3.1.1. Changements biochimigues au cours de la sghérulation

D'importants changements morphogénétiques accompagnent le processus de sphérulation chez Physarum polycephalum (Goodman and Rusch 1969 ; Mc Cornick et al. 1970 a, b ; Mohberg and Rusch 1971 ; Hüttermann 1973 ; Goodman and Beck 1974 ; Zaar and Kleinig 1975).

Le premier changement important démontré à l'aide du micros­

cope électronique après induction de la sphérulation est la disparition rapide du glycogène, carbohydrate majeur dans le plasmode en croissance (Goodman and Rusch 1969). Environ 70 % du glycogène présent dans le plasmode en croissance disparaît durant les 15 premières heures de la privation.

Au même moment, à quelque 18 heures de la sphérulation, l'appareil de Golgi se forme et peut être détecté dans le cytoplasme.

Ce complexe dictyosomial est une structure qui, dans la phase diploïde du cycle vital de Physarum polycephalum, n'existe que pendant le clivage du plasmodium en sclérotium.

Il n'a jamais été démontré ni dans le plasmodium en crois­

sance, ni dans les sphérules mûres. Le moment de l'apparition et de la disparition du complexe de Golgi coïncide avec une intense production du mucus (polysaccharide), bien qu'une partie de ce mucus soit produit au cours de la croissance du plasmode de Physarum (Mc Cornick et al. 1970 a).

Cette observation semble indiquer que l'appareil de Golgi est impliqué dans la sécrétion des polysaccharides extracellulaires

(Rambourg et al. 1969 ; Cheung et al. 1974 ; Zaar and Kleinig 1975).

Parallèlement à cette production de mucus, Physarum polyce­

phalum synthétise un autre carbohydrate destiné à l'élaboration de la paroi cellulaire des sphérules. Le constituant principal du mucus est le galactose, alors que la paroi cellulaire est composée essentiellement de polygalactosamine.

Bien qu'aucun rôle n'ait été reconnu à cette énorme quantité de mucus produite pendant la sphérulation, de par sa nature gluante ou gélifiée, on peut penser qu'il pourrait jouer un rôle de ciment pour maintenir les sphérules en surface; agir comme agent hydrophile en rete­

nant l'eau, ce qui favoriserait la germination; protéger l'organisme contre des agents étrangers (bactéries, ...) et servir de source de carbone en cas de besoin (Mc Cornick et al. 1970 a).

Cette dernière proposition est sujette à discussion. En effet, Daniel et Baldwin (Daniel and Baldwin 1964) ont montré que Physarum

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polycephalum ne peut utiliser le galactose comme source de carbone.

Mc Cornick et al. (1970 a) ont précisé que le mucus (polygactose) n'est pas une réserve extérieure de nourriture comme c'est le cas chez d'autres champignons (Szaniszlo et al. 1968 ; Davis et al. 1964). En présence de faibles quantités de glucose dans un milieu semi-défini additionné de

"bactotryptone" et de "yeast extract", Physarum polycephalum est incapa­

ble de métaboliser du mucus radioactif purifié (Mc Cornick et al. 1970 a).

Cependant, Cariile (1970 , 1978) a pu cultiver avec succès une souche de Physarum sur galactose comme seule source de carbone. Des expériences menées dans notre laboratoire (Massamba, observations person­

nelles) ont montré qu'il était possible de faire pousser Physarum polyce­

phalum sur milieu riche standard dans lequel le glucose est remplacé par le galactose.

Toutefois, le développement de la culture est plus lent et la croissance obtenue est nettement inférieure ( 65 %) à celle obtenue pour une culture sur milieu normal de croissance. Ces résultats diver­

gents peuvent s'expliquer par la différence des souches utilisées.

Les grosses molécules (DNA, RNA et protéines) subissent une dégradation importante au cours de la sphérulation. Après 32 heures de privation, seulement 64 % de DNA présent au moment de l'induction de la sphérulation, 36 % de RNA et 50 % de protéines résistent à cette dégrada­

tion (Sauer et al. 1970 ; Mitchell and Rusch 1973 ; Sauer 1973). En même temps, de nouvelles molécules des RNA et des protéines sont synthé­

tisées durant cette période (Wendelberger-Schieweg and Hüttermann 1978).

Les changements dans l'activité de quelques enzymes ont été étudiés, notamment les enzymes responsables de la dégradation des RNA et des protéines.

L'activité "RNase" montre une augmentation prononcée durant les premières six heures de la privation pour commencer à décroî­

tre 6 heures plus tard (Brand and Hüttermann 1973 ; Waterborg et al.

1979).

Les activités protéolytiques ont été étudiées aussi pendant la sphérulation. Ces activités enzymatiques ne montrent pas de change­

ments remarquables au cours de la différenciation (Hoffmann and Hütter­

mann 1975 ; Farr et al. 1973 ; Polanshek et al. 1978).

Les activités GDH* et phosphodiesterase manifestent une augmentation considérable de leurs activités spécifiques pendant la sphérulation (Hüttermann et al. 1971 ; Hüttermann 1972).

GDH*= glutamate deshydrogenase

(19)

l'enzyme durant cette période et qu'il y a un changement de comportement dans les isoenzymes de la phosphodiesterase (Hüttermann et al. 1971 ; Hüttermann 1972). Les deux enzymes GDH et phosphodiesterase montrent un accroissement dans leurs activités spécifiques beaucoup plus faible lors­

que la sphérulation est induite par le mannitol.

Des expériences en vue d'induire ces activités enzymatiques par l'augmentation de la concentration de l'acide glutarique ou du phos­

phate inorganique n'ont pas donné de résultats satisfaisants (Hüttermann 1970 , 1971 ; Stine 1969 ; Torriani 1960).

Il semble bien que la stimulation de la synthèse d'enzymes chez Physarum polycephalum n'est pas réglée selon le schéma classique d'induction à l'aide des substrats causant la dérépression.

Le rôle de la transcription dans ce processus de sphérula­

tion est encore inconnu. Des expériences avec l'actinomycine D ont montré qu'il y a un léger effet inhibiteur de l'antibiotique sur la sphé­

rulation, bien que les sphérules formées en présence de l'antibiotique aient une viabilité très faible.

D'autres études indiquent que certaines espèces de RNA disparaissent alors que de nouvelles espèces sont synthétisées durant la sphérulation. La signification de ces observations n'est pas encore connue.

La possibilité de l'existence d'une phase G 1 pendant la sphérulation a été envisagée depuis qu'il a été montré que la quantité de DNA dans les noyaux des sphérules était approximativement la moitié de la quantité de DNA trouvée dans les noyaux des plasmodes en phase végétative

3.2. Sporulation

La sporulation est une étape essentielle du cycle de vie de Physarum polycephalum; elle présente un triple avantage pour l'organisme

- comme un mécanisme de survie

- comme un moyen de propagation ou de dissémination par les spores - et pour la recombinaison génétique durant la méiose.

Durant la sporulation, le plasmode tout entier est converti en une ou plusieurs structures appelées "fructifications" et les phases somatiques et reproductrices ont lieu dans le même plasmode. Les données actuelles

(20)

ne nous permettent pas de proposer un mécanisme de régulation du processus de sporulation; toutefois, les conditions nécessaires pour déclencher ce processus ont été déterminées.

Deux types de facteurs sont requis pour engager le plasmode dans la voie de sporulation. Des conditions nutritionnelles et des condi­

tions d'éclairage.

Pour induire la sporulation, il est nécessaire de carencer le plasmode pendant un minimum de quatre jours, et cette privation est immédiatement suivie d'une période d'exposition à la lumière de quatre heures (Daniel 1962). En pratique, la sporulation peut être obtenue au laboratoire : les microplasmodes en croissance exponentielle sont repiqués sur une surface exempte de substances nutritives (papier filtre stérile ou filtre Millipore), humidifiée par une solution saline non nutritive addi­

tionnée de niacine; on les maintient carencés pendant quatre jours et, finalement, on les expose à la lumière au moins quatre heures.

La longueur d'onde effective de la lumière responsable de cette transformation se situe entre 315 et 415 nm; cela coïncide avec les pics d'absorption du pigment jaune qui confère sa couleur au plasmode (Rusch 1965).

Durant la période de privation, les plasmodes se déplacent à la surface à la recherche de nourriture. Le volume du plasmode diminue considérablement durant cette période, aussi la survie s'explique-t-elle par l'utilisation des réserves nutritives endogènes.

Quoiqu'il y ait au moins une mitose et synthèse simultanée d'acides nucléiques durant la période de privation, on observe une diminu­

tion sensible de la teneur en DNA, RNA et protéines du plasmode.

En absence de la niacine, les étapes subséquentes la sporu­

lation n'ont pas lieu. Le rôle exact de la niacine sur le processus de la sporulation n'est pas connu, mais il semble que ce métabolite contribue à la formation des nucléotides pyrimidiques qui sont impliqués dans les réactions photosensibles concomitantes (Sauer 1973 ; Smith 1974).

La lumière est nécessaire à l'induction de la sporulation dans les plasmodes pigmentés tels que Physarum polycephalum; elle n'est pas requise dans les plasmodes non pigmentés, Physarum compressum.

L'état de photosensibilité du plasmode est obtenu par priva­

tion durant 4 jours en présence de la niacine.

Les plasmodes qui ont été placés seulement en état de priva­

tion ou en exposition à la lumière peuvent repousser dès que les conditions nutritionnelles deviennent favorables et qu'ils sont remis à l'obscurité.

(21)

3.2.1. Changements biochimiques accompagnant la sporulation

Contrairement à la sphérulation, le processus de sporulation est sensible à 1'actinomycine D. Des expériences avec cet antibiotique ont montré qu'il y a une synthèse accrue des RNA pendant et immédiatement après la période de privation et d'illumination. L'actinomycine D appli­

qué après cette période n'a plus d'effet sur la sporulation.

Après le déclenchement de la sporulation, aucune synthèse importante n'est requise pour son achèvement. La synthèse des protéines est essentielle à toutes les étapes de la sporulation et des expériences ont montré que de nouvelles protéines sont synthétisées pendant la sporu­

lation.

Le rôle de la lumière dans la sporulation semble être la stimulation de la transcription et aussi la préparation des systèmes syn­

thétisant les protéines de manière à permettre une traduction immédiate de nouvelle information en provenance du génome en sporulation. Dès lors, la sporulation chez Physarum polycephalum paraît être clairement sous le contrôle de la transcription.

La transformation d'un plasmode hautement actif du point de vue métabolique en une structure relativement moins active telle que la

"spore" provoque des variations dans les besoins énergétiques durant cette morphogénèse. Ces variations se reflètent dans le niveau de l'ATP.

Daniel (1964 a, b et 1966) a montré que les changements dans le niveau de l'ATP n'ont lieu que si le plasmode est illuminé et que le milieu de sporulation contient de la niacine.

La lumière cause une chute initiale du niveau de l'ATP de 25 à 50 % par rapport au niveau de l'ATP du plasmode à l'obscurité, suivie d'un bond de 150 à 200 % avec un maximum au bout de 2,5 heures.

Le glucose inhibe fortement la sporulation. Cette inhibi­

tion se manifeste avant et après l'illumination. Ceci semble indiquer que la lumière induit la perméabilité de la cellule plus spécialement pour le glucose (Gray and Alexopoulos 1968 ; Rosa et al. 1972).

Le pigment jaune de Physarum contient un système photorécep­

teur non encore identifié. C'est un mélange de plusieurs composés. La structure chimique de ce pigment jaune, décrite comme "polyène conjugué", n'est pas encore connue.

L'étude de l'efficacité de la lumière monochromatique sur la sporulation chez Physarum nudum révèle un large spectre d'action avec deux zones principales (330 - 540 nm) et (630 - 713 nm) (Rakoczy 1965)

(22)

et peut indiquer que la lumière n'agit pas sur un seul composé. Cepen­

dant, la sporulation n'est pas induite par la lumière verte (540 - 620 nm) (Rakoczy 1967).

Les changements du pigment de la couleur jaune à la couleur brune olive ont été observés au cours d'une intense illumination aussi bien pendant la croissance que pendant la privation. Ces changements sont interprétés comme formation de pigments protecteurs pour le système photorécepteur (Rakoczy 1965).

Bien que les plasmodes et les sporanges immatures soient jaunes dans les premiers stades du développement de Physarum.les spores mûres ont des parois noires; il se forme vraisemblablement des mélanines au cours de la sporulation. Ceci présuppose le développement d'un système

"phénoloxydase" ou l'activation d'un système existant déjà.

Dans la recherche des systèmes enzymatiques impliqués dans la mélanogénèse pendant la sporulation, Ward et Havir (1957) ont trouvé une activité "crésolase"(polyphénoloxydase) dans les extraits de Physarum.

Comme toutes les crésolases classiques, l'activité crésolase de Physarum montre une latence avant la consommation d'oxygène. Cette latence est éliminée par l'addition du p-CMB (para-chloromercuribenzoate), du NEM

(N-ethylmameide) ou de l'acide iodoacétique qui réagit avec les groupes -SH (sulfudryl) associés à la sporulation.

Ceci montre que la sporulation peut être déclenchée par inactivation des groupes -SH. Daniel (1963, 1964 a et 1966) rapporte que le "NEM" provoque la libération des pigments jaunes du plasmode et que cette libération est accélérée par la lumière. Cette observation suggère que le métabolisme des groupements sulfudryl "-SH" n'est pas seulement

impliqué dans l'attachement du pigment jaune, mais que la lumière accentue la formation ou le turnover des groupes sulfudryl (-SH).

L'existence d'un système cytochrome oxydase a été établie chez Physarum polycephalum (Gray and Alexopoulos 1968). Au cours de la sporulation, l'activité cytochrome oxydase s'élève â un niveau trois fois supérieur au niveau d'activité dans le plasmode.

Les spores de Physarum sont entourés d'une membrane épaisse constituée principalement de cellulose et non de chitine (Goudwin 1961).

Différents facteurs physicochimiques naturels ou provoqués (température, pH, humidité, lumière, ...) entraînent la rupture de la membrane des spores (germination), dont il sort une cellule mobile : une myxamibe ou cellule nageuse. Les spores sont disséminées dans la nature par le vent (Gregory 1961).

(23)

La classification des niyxomycètes est basée sur la forme des sporophores (ensemble saccule et tige) et les caractères des spores (Gray and Alexopoulos 1968).

4. /?- galactosidase

4.1. Préliminaire

Les oligosaccharides ou polysaccharides renfermant des

"D-galactose" associés par une liaison /? -glycosidique se rencontrent dans la plupart si pis dans tous les organismes. Aussi n'est-il pas étonnant que les glycosidasescorrespondantes ainsi que leurs substrats soient largement répandus.

La préserrce quasi universelle des glycosidases, la simpli­

cité des techniques de leur détermination et l'abondance des substrats correspondants font de la /3-galactosidase l'une des glycosidases les plus étudiées.

La /3-galactosidase, enzyme qui hydrolyse le lactose en glucose et galactose, est connue depuis fort longtemps : en 1889,

Adametz et Beijarink la découvraient chez des Saccharon\yces et lui don­

naient le nom de "lactase". Chez E. Coli, elle fut mise en évidence en 1907 par Fuhrmann (Le Minor et Ben Hamida 1962).

La /3 -galactosidase de E. Coli a fait l'objet d'un grand nombre d'études ces dernières années. A l'analyse des fonctions telles que la cinétique et la spécificité de la /3-galactosidase est venue s'ajouter l'étude de la structure de l'enzyme. Une des grandes réalisa­

tions de la génétique moléculaire de ces dernières décennies, le concept général de la structure, expression et régulation de l'opéron, est basé sur l'étude de l'opéron lac de E. Coli. Les données sur la structure sont essentielles pour confirmer et clarifier l'image fournie par les analyses génétiques. Dès lors, l'isolement, la caractérisation des pro­

téines mutantes, leur corrélation avec le gène de structure et l'analyse in vitro de la complémentation par réassociation des fragments peptidi­

ques sont utiles dans la connaissance de la structure du gène (Zabin and Fowler 1970 ; Ullmann and Perrin 1970). Même si les recherches ont

(24)

d'informations sur le mécanisme d'action et sur le site actif de l'enzyme

4.2. Distribution naturelle de la (3 -galactosidase

La répartition de la (3 -galactosidase est fort étendue, c'est l'une des glycosidases les plus largement répandues : microorganis­

mes, végétaux supérieurs, animaux, ...

4.2.1. Bactéries

Le test de fermentation du lactose dans le diagnostic bacté riologique des Entérobactériacées a beaucoup contribué au développement des recherches sur l'activité /3-galactosidasique chez les bactéries (Le Minor et Ben Hamida 1962 ; Marymont et al. 1966). L'activité f3 - galactosidase a été trouvée dans plusieurs souches d'Enterobacteriacées

(Wallenfels and Well 1972), de Pseudomonacées, de Parvobacteriacées et de Neisseriacées (Corbett and Catlin 1968). Parmi les bactéries gram-

positives Diplococcus pneumonia (Hugues and Jeanloz 1964), Streptococcus lactis (Citti et al. 1965), Bacillus megaterium (Landman 1957), Bacillus subtilis (Anema 1964) et plusieurs bactéries propioniques produisent la

f3 -galactosidase.

Staphylococcus aurons (Hengstenberg 1967) et une souche de Streptococcus lactis (Mc Kay 1969) contiennent une phosphogalactosidase spéciale qui hydrolyse les 6-0-phosphoryl-/?-galactosides. Ces dérivés sont synthétisés lors du passage des (3 -galactosides à travers la membrane cellulaire par un système phosphotransferase.

4.2.2. Levures

De nombreuses levures des genres Saccharomyces, Torulopsis, Candida, fermentent le lactose. Saccharomyces lactis et Saccharomyces fragilis sont les espèces de levures les plus citées pour leur production de /3 -galactosidase (Wallenfels and Malhotra 1960; Biermann et Glantz 1968). La levure de boulangerie est dépourvue de f3 -galactosidase.

(25)

4.2.3. Animaux

La présence très répandue de /} -galactosidase dans les organes animaux est probablement en rapport avec les multiples fonctions physiologiques de l'enzyme. Le rôle de la /3-galactosidase dans l'hydro­

lyse et par conséquent dans l'absorption du lactose de l'alimentation est bien connu; et il est clair que cette /?-galactosidase lysosomiale est l'enzyme clé dans la dégradation des glycolipides (Spiro R.C. 1970 ; O'Brien et al. 1972 ; Norden et al. 1974), des mycopolisaccharides et des glycoprotéines (Spiro 1970 ; Sato et al. 1974).

Les sucs digestifs de plusieurs espèces d'escargots contien­

nent une activité /3 -galactosidasique élevée, qui est probablement nécessaire à la dégradation des galactosides nutritionnels (Horstmann 1964 ; Got 1964, 1968).

4.2.4. Végétaux

Dans les plantes supérieures, une activité H -galactosidase très élevée a été mise en évidence dans les graines (Agrawal et al. 1968 ; Wallenfels and Malhotra 1969 ; Kanfer et al. 1973 ; Li et al. 1975) et dans les feuilles (Gatt and Baker 1970), oû l'enzyme est probablement liée au catabolisme des galactolipides tels que les /3 -D-galactosyl diacyl­

glycérol, qui sont universellement répandus dans les plantes et les algues.

4.2.5. Autres microorganismes

L'activité /3 -galactosidase est présente dans de nombreuses espèces de champignons et protozoaires (Howard 1963 ; Gorin et al. 1964 ; Akasaki et al. 1976 ; Lester and Byers 1965 ; Johnson and Gib Debusk 1970 a, b).

Chez Physarum polycephalum, de nombreuses activités glyco- sidasiques xoplasmodiales ont été mises en évidence et déterminées

(Kilpatrick and Stirling 1975, 1977). Toutefois, aucune activité /3 - galactosidase endoplasmodiale n'a été décrite jusqu'à présent (Hüttermann

1970).

Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à la fi - galactosidase de Physarum notamment du point de vue de sa situation intracellulaire, son comportement au cours de la différenciation, son isolement et sa caractérisation.

(26)

4.3. Régulation de Tactivité -galactosidase de E. Coli

Dès 1922, Waksman fit deux constatations importantes sur la /3-galactosidase de E. Coli : d'une part, cette enzyme est intracellulaire, d'autre part, les organismes cultivés sur un milieu dépourvu de lactose ne contiennent que peu ou pas de "lactase" qui ne se développe pleinement que dans les cultures sur milieu lactosé. Cette enzyme entre dans la catégorie des enzymes "adaptatives" ou inductibles de Karstron (Le Minor 1962).

La /3-galactosidase de E. Coli s'est révélée être un

matériel se prêtant à des nombreuses expériences, son étude a contribué à la plupart des recherches sur le mécanisme de la synthèse induite d'une enzyme et même des protéines en général.

L'essentiel des travaux sur l'induction enzymatique porte sur l'étude de cette enzyme (Monod 1947, 1956).

Ces recherches ont aussi permis de préciser le mécanisme de répression de la synthèse d'une enzyme (Monod 1960); elles ont même

conduit à suivre la biosynthèse de protéines bactériennes anormales conte­

nant des analogues d'acides aminés (Cohen et Munier 1959 a, b).

4.4. Propriétés enzymatiques de quelques fi -galactosidases

Contrairement à la /3 -galactosidase de E. Coli, les propriétés des fi -galactosidases d'autres organismes sont relativement peu étudiées. Un examen des données disponibles indique que la plupart des enzymes d'origine microbiale ont des optima de pH dans la région des pH 6-7 (Hugues 1964 ; Anema 1964 ; Biermann and Glantz 1968 ; Harrap and Watkins 1970 ; Hengstenberg et al. 1970 ; Lester and Byers 1965). Il est à noter que pour les /3-galactosidases de Diplococcus pneumoniae

(Hugues 1964), Saccharornyces lactis (Biermann and Glantz 1968) et

Trichomonas foetus (Harrap and Watkins 1970), la présence des ions biva­

lents est nécessaire pour la détermination de l'activité enzymatique.

Trichomonas foetus (Lester and Byers 1965) et Neurospora crassa (Johnson and Gib Debusk 1970 a,b; Stephens and Gib Debusk 1975) produisent une seconde /?-galactosidase qui a une activité maximale respectivement à pH 4,0 et pH 4,5.

(27)

La même gamme de pH a été décrite pour deux autres /J - galactosidases d'origine végétale (Agrawal and Bahl 1968).

Durant ces dernières années, de nombreuses études sur les /3-galactosidases animales et plus spécialement humaines ont été pu­

bliées. Ces enzymes ont suscité un grand intérêt non seulement du point de vue académique, mais surtout à cause de leur implication dans les troubles métaboliques graves causés par les déficiences génétiquement transmises (O'Brien 1971 ; Okada and O'Brien 1968 ; Ho and O'Brien 1969 ; Ockerman 1968 ; Dawson and Stein 1970).

Du point de vue de leur localisation intracellulaire, on peut distinguer deux groupes de /? -galactosidases chez les mamnifères : le premier groupe concerne les enzymes localisées dans la bordure en brosse de l'intestin grêle, le second groupe comprend les enzymes lysoso­

miales qui sont omniprésentes dans toutes les cellules animales.

L'enzyme liée à la bordure en brosse de l'intestin grêle est évidemment impliquée dans l'élimination des /3 -galactosides de l'alimentation, spécialement du lactose. Elle montre une spécificité assez faible envers la moitié aglycone des /3-D-galactosides; elle est plus active avec le lactose comme substrat. Cependant, les orthonitro- phenyl et les paranitrophenylgalactosides sont aisément hydrolysés par 1'enzyme.

Cette enzyme qui parait être une vraie "lactase" a été isolée à un degré de pureté très élevé à partir de l'intestin grêle de veau (Wallenfels and Fischer 1960) et de rat (Alpers 1969).

La /3 -galactosidase intestinale humaine n'hydrolyse pas le 6-bromo-2-naphtyl /3 -D-galactoside. Cette caractéristique est utilisée pour distinguer l'enzyme de la bordure en brosse de l'intestin grêle de la seconde /3-galactosidase cytoplasmique, toutes deux ayant des pH optima d'activité semblables (pH 6) (Asp et al. 1970).

Les /3 -galactosidases localisées dans les lysosomes comme toutes les hydrolases lysosomiales ont un optimum de pH acide situé entre pH 3 et 4.

Bien que la plupart de ces enzymes ont été étudiées avec des substrats synthétiques de poids moléculaire peu élevé, leur rôle physiologique est probablement de catalyser le catabolisme des glycolipi­

des complexes, des mucopolysaccharides et des glycoprotéines contenant des résidus " /3-galactosyl".

Cette conclusion se fonde sur l'existence des désordres métaboliques innés de catabolisme, qui sont caractérisés par une faible

(28)

activité enzymatique et par l'accumulation de ces produits dans divers organes.

La plupart des /3 -galactosidases lysosomiales hydrolysent le lactose aussi bien que les hétéro /3-D-galactosides tels que phenyl, nitrophenyl, 6-bromo-2-naphtyl et methyl-umbelliferryl galactosides, montrant ainsi une grande indifférence pour l'aglycone (Robinson 1967 ; Jungalwala and Robinson 1968 ; Asp and Dahlgvist 1968).

Jungalwala et Robinson (1968) ont isolé deux /3 -galactosi­

dases du cerveau de lapin qui sont très actives envers les nitrophenyl ga­

lactosides et le lactose, mais ne semblent pas catalyser l'hydrolyse des galactosphingolipides complexes. D'autre part, Brady et al. (1967) ont montré que l'enzyme partiellement purifiée de l'intestin du rat et qui est aussi présente dans le cerveau, dans le foie, dans la rate et dans les reins, est strictement spécifique pour les céramide trihexosides et ne catalyse pas l'hydrolyse d'un grand nombre de sphingolipides correspondants ou des nitrophenyl /3 -D-galactosides. Ces observations montrent qu'il y a des enzymes spécifiques pour l'hydrolyse des galactosphingolipides et que celles-ci n'ont pas nécessairement une activité /3 -galactosidasique envers les hétérosides synthétiques.

Le D-galactono-l,4-lactone inhibe l'activité /3 -galactosi- dase des mammifères (Conchie 1959). C'est un inhibiteur compétitif

puissant des enzymes lysosomiales de l'intestin de rat, de foie de rat, du cerveau de rat et du cerveau de veau (Kraml 1969 ; Levvy 1962 ; Gott 1966). La force inhibitrice du galactono-l,4-lactone est probablement due à la formation dans la solution de petites quantités de D-galactono- 1,5-1actone (Levvy 1962 ; Conchie 1967) et il est possible que cette lactone ressemble â l'état de transition dans la réaction enzymatique catalysée par des /3-galactosidases animales.

4.5. Purification de /3-galactosidases 4.5.1. /3 -galactosidase de E. Coli

L'isolement et la purification de la /3-galactosidase de E. Coll est relativement aisée. L'enzyme représente environ 5 % des protéines totales dans quelques souches constitutives de E. Coli. En plus, la grandeur de l'enzyme et sa stabilité facilitent l'isolement.

(29)

La purification de l'enzyme a été systématiquement étudiée pour la première fois par Cohn et Monod (1951). Plus tard, Wallenfels et al. (1959) réussirent à isoler la f} -galactosidase de E. Coli ML 309 sous forme d'une protéine cristallisée.

Hu et al. ont cristallisé l'enzyme de la souche ML 308 en utilisant la chromatographie sur DEAE-cellulose et l'électrophorèse pré­

parative (Hu et al. 1959).

Craven et al. (1965) puis Steers et Shifrin ont développé un procédé de fractionnement excluant la cristallisation mais donnant de grandes quantités d'enzyme exempte de toute contamination mineure.

L'enzyme, après l'étape de DEAE-Sephadex, peut être crital- lisée et recristallisée, selon Wallenfels et Malhotra (1961). Les

premiers cristaux obtenus apparaissent sous forme de plaquettes hexagona­

les. La recristallisation donne des aiguilles hexagonales.

Récemment, Tomino et Paigen (1970) ont introduit une technique intéressante pour l'isolement de l'enzyme par chromatographie d'affinité. Ils ont employé l'inhibiteur compétitif p-aminophenyl D -D- thiogalactoside couplé à la ^-globuline comme absorbant spécifique et obtiennent un rendement de 99 % en une seule étape sur la colonne. Cette purification fonctionnelle a été développée ultérieurement par Steers et al. (1971), qui ont employé le même thiogalactoside couplé de façon cova­

lente aux dérivés d'agarose et obtinrent l'enzyme purifiée à partir de 25 gr de bactéries avec un rendement de 95 %.

4.5.2. /3 -galactosidases d'autres microorganismes

Les procédés de purification concernant les /3-galactosi­

dases des microorganismes autres que E. Coli ont été rapportés. Les enzymes de Streptococcus lactis (Mc Feters 1967), Aeromonas formicans

(Rohlfing 1966), Saccharon\yces lactis (Biermann 1968), la 6-phospho-/3 - galactosidase de Staphylococcus aurens (Hengstenberg 1970) ont été isolées dans un état de haute pureté, mesuré par divers procédés physiques. Une purification partielle a été réalisée pour les /?-galactosidases de Shigella dysenteriae (Sarkar 1966), Saccharoniyces fragilis (Davies 1964), Bacillus subtilis (Anema 1964) et Bacillus megaterium (Rohlfing 1966).

(30)

4.5.3. /3-galactosidases d'origine animale

Deux classes de /3-galactosidases animales requièrent une attention spéciale à cause de leur importance physiologique : les enzymes dégradant les galactosylsphingolipides complexes qui ont été purifiées à partir du cerveau et de l'intestin, et les lactases intestinales à cause de leur importance dans l'hydrolyse des disaccharides des aliments.

Bowen et Rodin (1968) ont décrit une /? -galactosidase lyso­

somiale qui agit sur les galactosylceramides du cerveau de rat.

Jungalwala et Robins (1968) ont relaté la purification de deux /3 -galactosidases du cerveau de lapin qui catalysent l'hydrolyse du lactose et des substrats synthétiques mais qui sont inactives envers les gaiactosy1céramides.

La première /3-galactosidase hautement purifiée a été préparée par Wallenfels et Fischer (1960). Ces auteurs ont obtenu une purification d'environ 2 000 fois de l'enzyme de l'intestin de veau.

Cependant, la préparation contient de grandes quantités de carbohydrates et n'est pas encore homogène par ultracentrifugation.

La /3 -galactosidase du foie humain existe sous deux formes : la protéine A (PM 60-70.10^) et la protéine B (PM 600-700.10^). Ces

deux protéines sont isolées par chromatographie d'affinité sur une

colonne de thiogalactosyIsepharose (Miller 1976, 1977). Les GMj^ ganglio- side /3 -galactosidases(ou GM^ - fi - galactosidase) ont été purifiées à partir du cerveau et du foie de chat par la combinaison des procédés classiques de purification d'enzyme et d'absorption sur colonne d'affi­

nité (Andersen 1978); la préparation de GMj-/3-galactosidase de cerveau a été enrichie environ 2 000 fois avec un rendement de 36 %, mais l'enzyme présente encore quelques contaminants mineurs en électrophorèse sur gel de polyacrylamide. La préparation de GMj-/3-galactosidase de foie a été purifiée avec plus de 30 000 fois d'enrichissement et un rendement de 40 L'enzyme du foie est homogène par électrophorèse en disque sur gel de polyacrylamide à différents pH : à pH 4,3, à pH 8,1 et à pH 8,9 et par chromatographie.

Les deux enzymes sont éluées simultanément sur colonne de Sephadex G-200 avec un poids moléculaire de 250 000 + 50 000 daltons.

Ce poids moléculaire diffère de celui rapporté pour la GMj^-/3-galactosi­

dase isolée des intestins des bovins (68 000) (Distler and Jourdian 1973), du foie humain (72 000) (Norden et al. 1974) et du cerveau de lapin

(81 000 et 103 000) (Jungalwala et Robins 1968).

(31)

L'existence de différentes formes moléculaires peut suggé­

rer que la GM^-ZJ-galactosidase isolée du foie de chat est un tétramère;

les formes humaines et lapine sont des sous-unités uniques, avec un dimère chez le lapin.

Tout récemment, Holmes et 0'Brien (1979) ont rapporté la puri­

fication d'une /? -galactosidase acide du foie des félins avec un enri­

chissement de 19 000 fois et un rendement de 13 % en utilisant un processus à quatre étapes impliquant :

- la chromatographie sur lectine (Con A-Sepharose) - la chromatographie échangeuse ionique

- la chromatographie d'affinité sur 6-aminohexyl-l-thiogalactoside- Sepharose et la filtration sur Sepharose6B.

La protéine purifiée est éluée sur Sepharose 6B en deux pics symétriques qui coïncident aux deux pics d'activité enzymatique et les deux formes ont des poids moléculaires apparents de 700 000 et 130 000 daltons.

Le poids moléculaire estimé par ultracentrifugation en

gradient de sucrose révèle une seule forme moléculaire de 115 000 daltons.

La /3 -galactosidase réduite et dénaturée migre en une bande unique avec un poids moléculaire apparent de 62 000 en électrophorèse sur gel en présence de SOS.

4.6. Utilisation de la /3-galactosidase et des glycosidases

L'intérêt porté sur la /3 -galactosidase et plus générale­

ment sur les glycosidasess'est fortement accru durant ces récentes années, avec la connaissance du rôle fondamental des glycoprotéines et glycolipi­

des dans la nature et la réalisation du fait que ces enzymes constituent un outil précieux pour l'étude de la structure des substances complexes.

A cause de la spécificité stéréochimique très stricte et le fait que l'analyse enzymatique peut être développée avec de faible quanti­

tés de substrats, les glycosidases sont très commodes dans les détermina­

tions structurales des carbohydrates complexes.

La démonstration que beaucoup d'affections métaboliques héré­

ditaires sont causées par le manque de glycosidases spécifiques et que ces maladies sont guéries par l'administration des enzymes absentes a aussi relancé l'intérêt porté sur les glycosidases.

(32)

Une autre raison de l'importance sans cesse croissante des glycosidases est leur application biotechnologique dans l'industrie alimentaire,principalement dans la production à grande échelle du sucre interverti à partir du saccharose et de l'amidon.

5. But du travail

A un niveau très inférieur d'organisation, certains eucaryo­

tes primitifs manifestent des changements coordonnés de métabolisme et de structure qui ne dépendent pas d'interactions cellulaires, mais qui sont provoqués par des changements de milieu (chute de température, diminution du pH, dessication, privation d'un métabolite, ...). L'analyse de ces phénomènes pourrait aider à mieux comprendre certains aspects de la régu­

lation des synthèses des macromolécules chez les eucaryotes.

Lors de la formation des sclérotes (= sphérules) chez le myxomycète Physarum polycephalum, provoquée par la privation de nourri­

ture, l'organisme subit une autophagie et une différenciation. Comme la différenciation biochimique est intimement liée au turnover des protéines

(Halvorson 1958 a, b ; 1960), la digestion intracellulaire des protéines devrait jouer un rôle important dans ce processus.

L'analyse biochimique de ce phénomène complexe exige

l'étude du comportement de quelques protéines bien caractérisées apparte­

nant à différents compartiments cellulaires, notamment des enzymes catabo­

liques, des enzymes impliquées dans le métabolisme des parois cellulaires, des protéines structurales, ...

Dans le présent travail, nous cherchons à caractériser et à purifier la /3 -galactosidase, â établir sa localisation dans l'organisme et à analyser les variations de son activité qu'accompagnent la formation des sclérotes (sphérulation).

(33)

MATERIEL ET METHODES

1. Matériel

Microorganismes

Le matériel expérimental est une souche de Physarum polyce- phalum Schweinitz originaire de la collection du "Centraalbureau voor Schenmielculture" de Baam(Hollande). Cette souche de Physarum nous a été fournie sous forme de plasmodium en croissance sur agar "oat meal".

Afin de disposer d'une souche axénique, préalable à toute analyse biochimique ultérieure, nous avons entrepris la purification du myxomycète Physarum polycephalum selon la technique de migration dévelop­

pée par Cohen (1939) et Râper (1951) et modifiée par Chantrenne (cfr. puri­

fication de Physarum polycephalum).

Au cours de notre travail, nous avons pu disposer d'autres souches de Physarum polycephalum. Nous donnons ci-dessous les différentes souches, leur origine et le stade végétatif dans lequel elles nous ont été fournies.

Tableau I : Souches de Physarum polycephalum

souche origine stade végétatif

Physarum p. Schw. collection du "Centraal

bureau voor Schemmelcultures"

Baarn (Hollande)

plasmodium en croissance sur agar "oat meal"

Physarum p.souche M3 c IV

Prof. Rusch H.P.

Mc Ardle Laboratory Madison (U.S.A.)

sclérotes

Physarum p.souche M3C V

Prof. Kleinig H.

Institut für Biologie Freiburg

sclérotes

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L'ensemble de ce travail a été réalisé avec la souche de Physarum polycephalura Schweinitz de la collection du"Centraalbureau voor Schemmelculture", Baarn (Hollande).

Culture de Physarum polycephalum

Le myxomycète Physarum polycephalum peut être cultivé de deux manières :

- soit en milieu liquide agité

- soit en milieu solide sur boîte de Pétri.

La culture en milieu agité est la méthode la plus courante pour l'obten­

tion des microplasmodes destinés aux études biochimiques.

Physarum polycephalum est cultivé sur un milieu synthétique semi-défini (Cariile 1970), l'induction de la sphérulation se fait par transfert des microplasmodes en phase exponentielle de croissance du milieu normal de croissance au milieu salin non nutritif.

Milieux de culture et de différenciation Milieux de culture selon Carlile (1970) :

Milieu liquide

Solution A : à quelques ml d'eau contenus dans un bêcher d'un litre, ajouter :

glucose

bactotryptone acide citrique

10 gr

10 gr

3,5 gr KH2PO4

CaCl2 4H2O MgSO^ 7H2O Na EDTA

FeSO^ (NH^)2 SO4 (sel de Mohr) ZnSO^ 7H2O

Thiamine HCl (vitam. Bj)

Biotine 0,0005 gr

(ou 1 ml d'une solution de biotine à 2,5 mg/ml) ajuster le pH à 4,6 avec KOH 2N et compléter à

2 1,5 0,600 0,220 0,120 0,034 0,042

gr gr gr gr gr gr gr

un litre avec de 1'eau

répartir dans des fioles à tubulure latérale de 500 ml en raison de 100 ml/fioie.

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20 minutes à 2 kg/cm ; elles sont mélangées juste au moment de l'emploi 2 (1 ml de solution B pour 100 ml de solution A).

Milieu solide

Il faut ajouter 1,5 gr d'agar (Difco) par 100 ml de milieu liquide.

Milieux de différenciation Pour un litre de milieu selon

acide citrique KH2PO4

CaCl

2

4H2O MgS04 7H£0 MnCl2 4H2O FeCl2 4H2O

ou FeS04 (NH4)2 SO4 ZnS04 7H2O

pH 3,8 avec KOH 30 %

Pour un litre de milieu selon Daniel (1964) :

FeCl2 4H2O 59 mg

ou FeSÛ4 (NH4)2 SO4 108 mg

MnCl2 4H2O 82 mg

ZnS04 7H2O 33 mg

acide citrique 1 200 mg

CaCl2 4H2O 630 mg

MgS04 7H2O 590 mg

CuCl2 2H2O 23 mg

KH2PO4 390 mg

Niacine 98 mg

Niacinamide 98 mg

pH 4,6 avec HCl

Pour un litre de milieu selon Chet et Rusch (1969) :

On utilise le milieu synthétique de Daniel et al. (1963) ou le milieu semi-défini de Carlile (1970) additionné de mannitol (0,5 M). Le pH est ajusté à 4,6 avec du KOH 2N.

Goodman (1969) : 4,020 gr 0,400 gr 1,500 gr 0,600 gr 0,084 gr 0,070 gr 0,140 gr 0,034 gr

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Ensemencement de Physarum polycephalum

A partir d'une culture mère en phase exponentielle de croissance, on prélève 5 ml de suspension des microplasmodes que l'on ajoute à 100 ml de milieu de culture (solution A + solution B ; le

mélange des deux solutions est effectué au moment du repiquage) contenus dans un erlenmeyer de 500 ml.

Une agitation constante à l'aide d'un "shaker" est nécessaire à 1'o)^génation de la culture et entraîne une division mécanique des

plasmodes dont le volume augmente au cours de la croissance.

L'appareil d'agitation ("shaker") est réglé à 225 oscilla­

tion? par minute. Le développement de la culture a lieu dans une chambre thermostatisée à 21° C et à l'abri de la lumière. En effet, la présence de la lumière provoque la sporulation des microplasmodes, phénomène de différenciation qu'il est indispensable d'éviter au cours de la croissance si l'on veut obtenir une culture homogène pour toute étude biochimique ultérieure.

Afin de conserver la souche en bon état physiologique, nous avons entretenu un repiquage régulier sur un milieu nutritif neuf. Des précautions d'asepsie sont nécessaires pour réaliser des cultures pures du myxomycète Physarum polycephalum.

Induction de la sphérulation

A partir d'une culture en phase exponentielle de croissance, on récolte les microplasmodes par une courte centrifugation à très basse vitesse ( 500 g pendant 2 minutes).

Le surnageant est éliminé et on lave une à deux fois avec le milieu de différenciation. Les microplasmodes sont alors transférés dans le milieu salin non nutritif et agités sur "shaker" comme pour les cultures en croissance. La transformation des microplasmodes en sphérules débute après 24 heures de sphérulation, elle est complète au bout de 36 heures depuis l'induction de la différenciation.

Les analyses relatives au phénomène de différenciation ont été réalisées uniquement pendant la période antérieure à l'apparition de premières sphérules, afin de disposer d'un matériel homogène pour les études biochimiques.

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Préparation des sclérotes

Les sclérotes destinés à la préservation de la souche sont préparés d'après la technique suivante :

Les microplasmodes en phase exponentielle de croissance sont récoltés par simple décantation. Le surnageant est éliminé, puis les microorganismes sont remis dans le milieu riche frais avec agitation sur "shaker" pendant 8 heures.

On recueille de nouveau les microplasmodes par décantation et le surnageant est éliminé, ensuite on lave deux fois avec de l'eau bidistillée stérile.

Les microplasmodes lavés sont alors transférés dans le milieu salin non nutritif de Goodman (1970) et agités sur "shaker" à

l'obscurité pendant 40 heures. La formation de sphérules peut être suivie au microscope en effectuant des prélèvements pendant le processus de

sphérulation.

On décante alors les sphérules, après élimination du surna­

geant, le matériel est lavé deux fois avec de l'eau bidistillée stérile et les sphérules propres sont étalées sur papier filtre stérile à l'aide d'une pipette.

Les sphérules sont séchées 48 heures à 25° C avant d'être conservées stérilement à 4° C.

2. Méthodes

Récolte des microplasmodes et extraction des enzymes solubles

Les microplasmodes sont récoltés en phase exponentielle de croissance lorsque la suspension des microplasmodes traitée au TCA 8 % dans l'acétone est de 1.300 à 1.500 pour une longueur d'onde de 380 nm

(cfr. dosage pigment jaune ou mesure de la croissance de Physarum, Massamba 1975). Après centrifugation, les microplasmodes sont lavés à l'eau distillée froide et congelés au freezer à - 20° C.

Le culot congelé est remis en suspension dans quelques ml de tampon phosphate d'extraction (acétate de Mg 10 M ; KCl 5.10 M ;-3 KH2P0^ 10"^ M ; Triton 1,5 % ; pH ajusté à 7,8 avec KOH IN). Un culot provenant de 20 ml de suspension cellulaire est repris dans 4 ml de tampon.

Figure

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Références

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