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Saturation en AmS (%)

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: Zone de précipitation de la /3 -galactosidase

par le sulfate d'ammonium en tampon phospho-citrate à pH 6,5 par addition du sel solide à 4° C.

A

c

ti

v

it

é

m Fractions

Fig. 31 : Détermination des points isoélectriques de

40 50 60 70 80

Fractions

/3 -galactosidase et de la phosphatase acide

5 4 t 3 2 la

dans une colonne "LKB 8101" de 110 ml de capacité avec un gradient d'ampholines de pH 2,5 à 6.

Détails dans "Matériel et Méthodes".

6.7.1.5. Chromatographie sur échangeurs d'ions Nous avons au préalable déterminé le pH isoélectrique de l'enzyme par focalisation ionique en gradient de pH selon la technique classique (voir Matériel et Méthodes). Le pH^- de la /3-galactosidase est de l'ordre de 3,6 . Cette donnée nous a permis d'essayer, pour la purification, les résines échangeuses d'ions de type CM- en gradient ascendant de pH (pH 3 - pH 4,5). En outre, les gradients de force ionique (NaCl ou KCl) ont été testés sous le pH 3,6 sur les CM-Sephadex, SP-Sephadex et phosphocellulose et au-dessus de pH 3,6 sur les DEAE-Sephadex. En conclusion de cette analyse, seuls les échangeurs anioniques en gradient de sel (DEAE-Sephadex A-50 en gradient de KCl) se sont avérés intéressants tant du point de vue du rendement que de la purification (séparation partielle de deux activités

/5-galactosidasique et phosphatasique acide).

L'étude de la variation du pH de la chromatographie montre que le taux le plus élevé de purification est obtenu à pH 5 avec un gradient de KCl sur DEAE-Sephadex A-50.

6.7.2. Analyse du protocole de purification

Les étapes successives de la purification sont rassem­ blées dans le tableau VI. Les microplasmodes sont récoltés en phase expo­ nentielle de croissance par centrifugation et les culots sont conservés à - 20° C. Les culots des microplasmodes ainsi obtenus peuvent être conservés

pendant longtemps sans altération des propriétés enzymatiques de la /3 -

galactosidase.

Toutes les étapes de la purification sont effectuées à 4° C et les centrifugations sont réalisées à 15 000 rpm dans une centrifu­ geuse "Sorvall RC-2B" réfrigérée à 4° C.

6.7.2.1. Préparation des extraits bruts

Le culot congelé provenant de 5 litres de culture (environ 500 gr de

maté--2

riel) est mis en suspension dans 2 litres de tampon KH2P0^ 10 M , Mg

(acétate)2 10 ^ , KCl 5.10 ^ M additionné de 1,5

%

de Triton X-100 ajusté

à pH 7,8 avec KOH. Après décongélation, le matériel est homogénéisé à l'aide d'un "Mixer'’ et la suspension est alors centrifugée à 15 000 rpm

pendant 30 minutes i 4° C. Le liquide surnageant est recueilli et consti­ tue l'extrait enzymatique brut.

6.7.2.2. Précipitation en milieu acide

A l'extrait enzymatique brut de la première étape, on ajoute goutte à goutte à 0° C de l'acide citrique 1 M sous agitation jusqu'à ce que le pH s'équilibre à 3. On laisse agiter pendant 1 heure, puis le mélange est centrifugé pendant 30 minutes à 15 000 rpm à 4° C. Le surnageant est recueilli pour l'étape suivante. Cette opération permet d'éliminer une partie importante des protéines inactives sur les substrats étudiés.

6.7.2.3. Fractionnement par précipitation

au sulfate d'ammonium

Le surnageant acide obtenu lors de l'opération précédente est amené à pH

6,5 au moyen d'ammoniaque 20

%.

Il est ensuite porté à 40 % de saturation

en sulfate d'ammonium en ajoutant le sel solide à 4° C sous agitation. Le

pH du mélange est maintenu à 6,5 par addition d'ammoniaque 20

%

au cours

de l'opération.

Après agitation pendant 2 heures à 4° C, le mélange est centrifugé à

15 000 rpm pendant 30 minutes dans une centrifugeuse Sorvall RC-2B réfrigé­ rée. Le culot est écarté et le surnageant est amené à 70 % de saturation en sulfate d'ammonium dans les mêmes conditions.

Le mélange est agité pendant 16 heures à 4° C avant d'être centrifugé à 15 000 rpm pendant 30 minutes à 4° C. Le précipité est dissous dans 200 ml de tampon acétate 0,1 M pH 5. La solution obtenue est dialysée contre 5 litres du même tampon pendant une nuit. Un léger précipité est écarté par centrifugation. Le surnageant est conservé à - 20° C, réparti en ali- quotes de 50 ml.

6.7.2.4. Filtration moléculaire sur colonne

de Sephadex G-200

La solution protéique (aliquote de 50 ml) est soumise à une filtration moléculaire sur une colonne de Sephadex G-200 équilibrée avec le tampon acétate 0,1 M pH 5 (fig. 32). La filtration est réalisée avec un débit de

A c ti v it é re la ti

Fig. 32 : Filtration moléculaire sur Sephadex G-200. Une partie aliquote du précipité obtenu à 40 - 70 % de saturation en sulfate d'ammonium est soumise à une filtration sur

Sephadex 6-200. La colonne (2,6 x 100 cm) est prééquilibrée avec le tampon acétate 0,1 M pH 5. Détails dans le texte.

—,— : absorbance à 280 nm ; o---o ; activité /3 -galactosidasique.

30 ml/heure et des. fractions de 8 ml sont recueillies. L'élution s'effec­ tue avec le même tampon acétate. Cette étape permet d'éliminer une partie importante de substances pigmentées de faible poids moléculaire. L'extrait enzymatique obtenu â ce stade de purification a été utilisé dans les essais de séparation de la /J-galactosidase par chromatographie d'affinité. A ce stade de purification, l'analyse électrophorétique en gel de polyacryla- mide des fractions actives réunies donne une bande de protéine active vis- à-vis des substrats ONPG et PNPP.

6.7.2.5. Chromatographie sur DEAE-Sephadex A-50

Les fractions actives provenant de la filtration sur Sephadex G-200 sont réunies, concentrées par ultrafiltration à l'aide d'une membrane Diaflo XM-50 (Amicon Corporation). Après avoir été dialysée contre le tampon acétate 0,05 M de pH 5, la solution protéique résultante est chromatogra- phiée sur une colonne de DEAE-Sephadex A-50 (2,5x 35 cm) prééquilibrée avec le tampon acétate 0,05 M pH 5. La colonne est éluée, dans un premier temps, par 500 ml de tampon d'équilibrage, puis par application d'un

gradient linéaire 0 à 0,5 M de chlorure de potassium dans le tampon acétate 0,05 M pH 5 (250 ml dans chaque réservoir) avec un débit de 20 ml/h et on recueille des fractions de 5 ml.

La concentration en protéines (D.O.20q) et les activités enzymatiques sont

déterminées. La figure 33 illustre le profil d'élution obtenu. Les

fractions correspondant à la plus forte activité enzymatique sont réunies, concentrées par ultrafiltration et conservées à - 20° C pour d'autres analyses ultérieures.

L'ensemble de ces opérations conduit à une purification de l'enzyme de

l'ordre de 2 000 fois avec un rendement d'environ 25

%.

L'enzyme purifiée

ne possède aucune activité à l'égard du para-nitrophenyl /? -D-glucoside,

du p-nitrophenyl-N-acetyl- /3-D-glucosaminide et du phénolphtaleine

fi

-D-

glucuronide, substrats hydrolysés de façon significative par l'extrait brut des microplasmodes de Physarum polycephalum. Ces activités enzymati­ ques sont donc dues à des enzymes spécifiques qui ont été éliminées au cours de la purification.

Les électrophorèses sur gel de polyacrylamide, selon Davis et Ornstein (1964) à pH 8,5 et selon Bruni et al. à pH 3, montrent une bande unique de protéine active à la fois sur les substrats chromogènes BCG et BNG (fig. 34). L'utilisation du réactif de Schiff sur les gels, après oxyda­ tion périodique, indique en outre que l'enzyme est une glycoprotéine.

A

c

ti

v

it

é

re

la

ti

v

Fig. 33 : Chromatographie sur colonne de DEAE-Sephadex A-50. Détails dans le texte.

La fraction éluée de la colonne de Sephadex G-200 est passée sur DEAE-Sephadex A-50 équilibrée avec le tampon acétate 0,05 M pH 5. La /3 -galactosidase est éluée par un

gradient linéaire de 0 à 0,5 M KCl (x---x) ;

(—•—)

absorbance à 280 nm ;

(o—o) activité -galactosidase.

rvj O K C l (M I

Cependant, le p-nltrophenylphosphate est fortement hydrolyse par l'enzyme purifiée. Ceci indique la présence de phosphatase acide dans l'extrait purifié et montre que les deux hydrolases acides /J -galactosidase et phos­ phatase acide semblent être co-purifiées.

O

____

12 3 4

Fig. 34 : Electrophorèse en disque sur gel de polyacrylamide de l'extrait purifié sur DEAE-Sephadex A-50.

Système acide acétique - NaOH à pH 3 ou 4.

1) révélation de l'activité /J -galactosidasique (BNG) 2) révélation des protéines à l'Amido Black

3) révélation de l'activité /3 -galactosidasique (BCG) 4) révélation des glycoprotéines.

Etapes vol urne total (ml) protéines totales (mg) activité totale (U) activité spécifique (U/mg) purification rendement Extrait total 2 000 24 000 882 000 36,7 - 100 Solubilisation acide à pH 3 1 850 1 386,5 661 500 477,1 13 75 Fractionnement au AmS* (40-70 %) 200 313,4 529 200 1 688,2 46 60 Sephadex G-200 30 36 396 900 11 010 300 45 DEAE-Sephadex A-50 10 3 220 500 73 400 2 000 25

Etapes activité totale ( U ) activité spécifique (U/mg) purification rendement Extrait brut 3 087.10^ 128,6 - 100 Solubilisation acide à pH 3 2 160,9.10^ 1 558,5 12,1 70 Fractionnement au AmS (40-70

%)

1 728 720 5 516 42,8 56 Sephadex G-200 1 049 580 29 155 226,6 34 DEAE-Sephadex A-50 540 225 180 075 1 400 17,5

6.7.3. Co-purlfication de la

f)

-galactosldase et de la phosphatase aci.de de Ph.ysaruiti polycephalum

Dans ce paragraphe, nous montrons que les deux hydrolases

acides ( /3 -galactostdase et phosphatase acide) de Physarum polycephalum

étudiées sont difficilement séparables. L'examen des profils d'élution obtenus par filtration moléculaire et par chromatographie sur colonne de DEAE-Sephadex A-50 indiquent que ces protéines constituent deux entités enzymatiques distinctes, dont les caractéristiques physico-chimiques sont fort semblables. Ce fait rend leur séparation difficile par les méthodes classiques d'isolement des protéines.

6.7.3.1. Filtration moléculaire sur Sephadex G-200

L'extrait précipité au sulfate d'ammonium est dialysé contre le tampon

acétate 0,1 M pH 5 pendant une nuit. Il est alors centrifugé à 15 000 rpm

pendant 30 minutes avant d'être soumis à une filtration moléculaire sur une colonne (2,6 x 100) de Sephadex G-200 préalablement équilibrée avec le même tampon acétate. La vitesse d'élution de la colonne est de 40 ml/heure

et des fractions de 6 ml sont collectées. Les activités

fi

-galactosida-

sique et phosphatasique acide, ainsi que l'absorbance à 280 nm des frac­ tions, sont mesurées. Le résultat est présenté à la figure 35.

Bien que les deux pics d'activités

fi

-galactosidasique et phosphatasique

acide ne coïncident pas, les profils d'élution de ces deux enzymes se

chevauchent fortement. Ceci indique que les deux enzymes ont des masses

moléculaires semblables et qu'il est par conséquent difficile de les sépa­

rer sur la base d'une différence de poids moléculaire. Cependant, l'étape de filtration moléculaire s'est avérée utile dans le cas présent, car elle permet d'éliminer la plus grande partie des substances pigmentées très abondantes dans le plasmode de Physarum polycephalum et qui contaminent l'extrait enzymatique tout au long du processus de purification.

6.7.3.2. Chromatographie sur DEAE-Sephadex A-50

Les fractions actives vis-à-vis de 1'ortho-nitrophenyl /3 -D-galactopyrano- side et le para-nitrophenyl phosphate de la colonne de Sephadex G-200 sont réunies, concentrées par ultrafiltration à l'aide d'une membrane Diaflo

XM50 et la solution protéique résultante est dialysée contre le tampon acétate 0,05 M de pH 5. Après une centrifugation de 10 minutes à 15 000

rpm, le surnageant est déposé sur une colonne (2,6

x

35 cm) de DEAE-

Sephadex A-50 équilibrée au préalable avec le tampon acétate 0,05 M pH 5. Les protéines non retenues sont éliminées par lavage de la colonne avec le tampon d'équilibrage. L'élution des enzymes s'effectue après établis­ sement d'un gradient linéaire de 0 à 0,5 M en chlorure de potassium dans le même tampon acétate pH 5 (250 ml dans chaque réservoir). Le débit est de 20 ml/heure et on récolte des fractions de 5 ml.

La concentration en protéines (D.0.2gg) et les activités enzymatiques sont

déterminées dans chaque fraction. La figure 36 représente le profil d'élution obtenu.

Les deux enzymes, /? -galactosidase et phosphatase acide, sont éluées simultanément avec, toutefois, une légère séparation de leurs pics d'acti­ vités. Ce résultat indique clairement qu'il s'agit bien de deux protéines distinctes ayant des propriétés très voisines.

Les fractions actives sont réunies et concentrées par ultrafiltration, la solution résultante est soumise à l'analyse électrophorétique. Le matériel actif est parfaitement homogène, à en juger par les contrôles électrophoré­ tiques selon Davis (1964) et Ornsetin (1964) à pH 8,5 et Bruni (1970) à pH 3. L'unique bande de protéine mise en évidence par électrophorèse dans ces conditions non dénaturantes est active à la fois sur les substrats BNG et BCG lors de la détection de l'activité /? -galactosidasique dans le gel. En plus, cette bande protéique développe une réaction phosphatasique acide positive quand l'enzyme est révélée à l'aide des substrats chromo­

gènes BCP et 0( -naphtyl phosphate (fig.37 ).

L'analyse électrophorétique effectuée à divers pH (Davis 1964 ; Bruni

1970) montre que l'échantillon est homogène, alors que l'électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu SDS selon Weber et Osborn (Weber and

Osborn, 1972), appliquée au même échantilIon,permet de constater l'existence de deux polypeptides de poids moléculaires respectifs de 36.000 et 32.000 (fig.38 et 39).

dans le texte.

__ ___ : absorbance à 280 nm ; o---o : activité /3-galactosidasique ; e-—g : activité

La /3 -galactosidase et la phosphatase acide sont éluées par un gradient linéaire de 0 à 0,5 M

KCl (x---- x) ; 0—0 activité /J-galactosidasique ; 0—0 activité phosphatasique acide ;

—•—absorbance à 280 nm.

Fig. 37 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide de l'extrait purifié sur DEAE-Sephadex A-50. Système acide acétique - NaOH pH 3 ou 4. (A) révélation des protéines

(B) révélation spécifique de l'activité /? -galactosidasique (BNR)

(C) révélation spécifique de l'activité phosphatasique acide ( o( -naphtylphosphate + Fast Red TR)

(D) révélation spécifique de l'activité phosphatasique acide ( Oi -naphtylphosphate + Fast Garnet GBC sait)

Fig. 38 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide à 15 îK en présence de SDS de l'extrait enzymatique provenant du DEAE-Sephadex A-50. (Détails dans "Matériel et Méthodes").

L

o

g

R

M

Fig. 39 : Détermination du poids moléculaire de la /?-galactosidase et de la phosphatase acide par analyse électrophorétique sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.

Protéines servant à l'étalonnage : (A) phosphorylase b 94.000 (B) serumalbumine 67.000 (C) ovalbumine 43.000 (D) anhydrase carbonique 30.000 (E) trypsine 20.100 (F) o( -lactalbumine 14.400.

Fig. 40: Détermination du poids moléculaire de la /J -galactosldase et de la phosphatase acide par analyse électrophorétique sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.

Protéines servant à l'étalonnage : (A) serumalbumine 68.000

(B) immunoglobuline G de mouton (52.000) (C) immunoglobuline G de mouton (26.000)

6.7.3.3. Estimation des poids moléculaires de la

fi

-galactosidase et de la phosphatase acide

L'estimation des poids moléculaires est réalisée sur une aliquote de la préparation enzymatique provenant du DEAE-Sephadex A-50 selon la techni­ que d'Andrews (1965) par tamisage moléculaire sur une colonne (1,6 x 90 cm) d’acrylamide-agarose (Ultrogel AcA-34) ou de Sephadex G-200. Les marqueurs protéiques de poids moléculaires connus ont été utilisés pour calibrer la colonne (cfr. "Matériel et Méthodes"). On obtient une valeur de 100 000 daltons pour la phosphatase acide et de 90 000 daltons pour la /5 -galactosidase (fig.41 ).

Des études préliminaires, en vue de déterminer le nombre de sous-unités dont se compose chaque enzyme, ont montré que le polypeptide de 32 000 daltons correspond à l'activité /J-galactosidase. Cette valeur, comparée au poids moléculaire de l'enzyme native déterminé par filtration molécu­

laire de 90 000 daltons, permet de penser que la

fi

-galactosidase de

Physarum polycephalum pourrait avoir une structure trimérique.

6.7.3.4. Electrofocalisation sur gel de polyacrylamide

En utilisant un gradient de pH de 2,5 à 6 établi au moyen des ampholines,

l'activité /3-galactosidasique se focalise en un seul pic correspondant

à un point isoélectrique de 3,6; la phosphatase acide présente aussi un seul pic d'activité correspondant au point isoélectrique 3,5.

Lorsque la focalisation isoélectrique de la fraction éluée du DEAE- Sephadex A-50 est effectuée sur gel de polyacrylamide à 5 (voir "Maté­

riel et Méthodes"), on remarque que l'extrait enzymatique, qui semblait être homogène au vu d'analyses électrophorétiques à divers pH, montre deux

bandes intenses correspondant aux activités

fi

-galactosidasique et phos-

phatasique acide (fig. 42).

Ces résultats montrent clairement que les enzymes

fi

-galactosidase et

phosphatase acide constituent deux entités protéiques distinctes ayant des propriétés physico-chimiques voisines (fort semblables).

AcA-34. La colonne (1,6 x 90 cm) est étalonnée au moyen des marqueurs protéiques suivants : ferritine 540.000 (A) ; catalase 248.000 (B) ; aldolase 160.000 (C) ; ovalbumine 45.000 (D) et cytochrome C 12.500 (E).

Ca>

U) -P*

6.7.4. RésuHats et discussion

Le procédé de purification que nous avons mis au point a permis la co-purification de deux hydrolases acides de Physarum polyce- phalum : une /3 -galactosidase et une phosphatase. Les deux enzymes ont été obtenues dans un état de pureté très élevé, à en juger par l'analyse électrophorétique à divers pH dans les conditions non dénaturantes selon

Davis (1964) , Ornstein (1964) et Bruni et al. (1970). La

/3

-galactosi­

dase a été purifiée plus de 2 000 fois avec un rendement de 25 ï et la phosphatase acide est purifiée environ 1 500 fois avec un rendement d'en­ viron 17,5 %. La co-purification est une indication de ce que les deux enzymes ont des propriétés fort semblables. De plus, l'élution simulta­ née de deux activités hydrolytiques acides de la ConA-Sepharose 4B indi­ que que les deux enzymes sont des glycoprotéines. Dès lors, on peut

envisager que la moitié glycoprotéique de ces macromolécules est impliquée dans le métabolisme des carbohydrates très développé chez les myxomycètes (Kilpatrick et Stirling 1977). La présence d'une seule espèce molécu­

laire de /3 -galactosidase est confirmée par électrofocalisation ionique

et par filtration moléculaire sur Sephadex G-200 de la fraction protéique

précipitée entre 40 et 70

%

de saturation en sulfate d'ammonium. En uti­

lisant un gradient de pH de 2,5 à 6, l'activité /3 -galactosidasique se

focalise en un seul pic dont le point isoélectrique est de 3,6. De même, la phosphatase acide de Physarum se présente sous une seule forme moléculaire et son point isoélectrique est de 3,5. Une valeur identique a été rapportée dans la littérature pour la phosphatase acide exoplasmo- diale de Physarum polycephalum (Pilly et al. 1978).

Les poids moléculaires estimés par tamisage moléculaire sur Sephadex G-200 ou sur Ultrogel AcA-34 sont respectivement de 100.000 pour la phosphatase acide et de 90.000 pour la /3 -galactosidase. Ces valeurs sont très proches, de sorte que les deux enzymes sont éluées ensemble lors d'une filtration moléculaire.

Aucune étude n'a été publiée jusqu'à ce jour sur la

/3 -

galactosidase de Physarum polycephalum. Certains auteurs n'ont observé aucune activité /3-galactosidasique dans les extraits de Physarum vis-à-

vis des substrats artificiels o-nitrophenyl

fl

-D-galactoside et p-nitro

phenyl

B

-D-galactoside (HUttermann 1970). Dans un premier temps, nous

avons attribué ces observations en contradiction avec les nôtres à l'ori­ gine et à la diversité des souches de Physarum polycephalum. Les analy­ ses entreprises au cours de ce travail relatives à la recherche

systématique de l'activité /3 -galactosidasique dans diverses souches de Physarum ont montré que la production de la /5 -galactosidase chez ce myxomycète est générale dans toutes les souches dont nous disposions.

Schmidt et al. (1972) ont relaté la présence d'une phos­ phatase acide exoplasmodiale chez Physarum polycephalum. Cette enzyme aurait un poids moléculaire de 49.000 daltons. Cependant, les conditions d'estimation de la masse moléculaire n'ont pas été décrites et il nous semble dès lors difficile de comparer ce résultat aux nôtres.

Plus récemment, le même groupe de Schmidt (Pilly et al. 1978) a rapporté certaines caractéristiques physico-chimiques d'une phos- phomonoestérase exoplasmodiale de Physarum polycephalum, dont le poids moléculaire est de l'ordre de 90.000 daltons. Cette valeur est très pro­ che de la nôtre, toutefois nous n'avons décelé ni de phosphatase acide, ni

de

f)

-galactosidase sécrétée dans le milieu de culture lorsque Physarum

est cultivé dans un milieu liquide agité selon Carlile (1970). L'enzyme dite exoplasmodiale est vraisemblablement le résultat de la lyse cellulaire plutôt que d'une véritable sécrétion dans le milieu de culture et ce,

d'autant plus que ces expériences ont été conduites sur

des cultures vieillies (fin de la phase stationnaire) et non sur des micro- plasmodes en phase exponentielle de croissance (voir "Conclusions et dis­ cussion générale").

L'électrophorèse en présence de SOS de l'extrait enzyma­ tique purifié donne deux polypeptides dont les poids moléculaires sont respectivement de 36.000 et de 32.000. Des études préliminaires en vue de déterminer le nombre de sous-unités dont se compose chaque enzyme ont montré que le polypeptide de 32.000 daltons correspond à l'activité /3 - galactosidasique; ce qui pourrait suggérer une structure trimérique pour cette enzyme. Des analyses plus détaillées devraient permettre de préciser le nombre des sous-unités de chaque enzyme.

L'électrofocalisation de l'extrait élué du DEAE-Sephadex

A-50 sur gel de polyacrylamide dans la gamme de pH 2,5 à 6 montre deux

bandes protéiques intenses correspondant aux activités /J -galactosidasique et phosphatasique acide. La nette séparation de deux bandes protéiques enzymatiquement actives par focalisation en gel pourrait suggérer une méthode de séparation des enzymes au moyen d'ampholines ayant une gamme de pH très étroite (pH 2,5 à 4 ou pH 3 à 4).

CONCLUSIONS ET DISCUSSION GENERALE

Le myxoniycëte Physarum polycephalum synthétise un grand nombre d'enzymes hydrolytiques lorsqu'il est cultivé dans un milieu liquide agité.

Plusieurs de ces enzymes, notamment celles que nous avons mises en évidence, sont des hydrolases acides. La présence d'une batterie d'activités hydrolytiques acides dans le plasmode de Physarum polycephalum indique que les processus lytiques sont très développés au sein du plasmode et constituent un des aspects importants du métabolisme de la cellule (Iten et Matile 1970). Toutes ces enzymes seraient donc impliquées dans le méca­ nisme de digestion intracellulaire de Physarum polycephalum.

En effet, chez les myxomycètes, groupe auquel appartient Physarum polycephalum, l'organisme est capable de capturer et d'englober des microorganismes plus petits : bactéries, petits protozoaires et des fragments végétaux en décomposition par le mécanisme bien connu de phagocytose, qui est d'ailleurs son seul mode de nutrition dans la nature (Gray and Alexopoulos 1968 ; Kazama and Aldrich 1972 ; Bauer 1973). De plus, la pinocytose a été clairement mise en évidence chez Physarum polycephalum (Guttes and Guttes 1960).

Les centrifugations différentielles en présence de divers protecteurs (saccharose, sorbitol, ficol, ...) dans les conditions classiques d'isotonicité (Garchia-Acha et al. 1967) ont montré que la majorité des acti­ vités lytiques se retrouve essentiellement dans la fraction soluble.

Cette proportion élevée d'activités lytiques dans la frac­

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