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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Landuyt, M. (1979). Etude interfaciale d'antibiotiques spécifiques de la membrane (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES
Service de Chimie Générale II Laboratoire de Chimie - Physique des Macromolécules aux Interfaces
ETUDE INTERFACIALE D'ANTIBIOTIQUES SPECIFIQUES DE LA MEMBRANE
L'étude des interactions des dérivés métylés du mercure avec les lipides au sein de modèles physico-chimiques de membranes pourrait contribuer à la compréhension de la toxicité de cette catégorie de polluants.
Thèse présentée pour l'obtention du grade de
Docteur en Sciences Chimiques
Michèle LANDUYT
Mars 1979
ut te ieot domcûm ou il ^cuu: 4 e dépo44êdeA pouA 6' u/ilckiA.
MALCOM VE CHAIAL
^zconncuASancz à UoiU-lzuJi pou/L VÂjnttnÂX. qu’ZZ a bX.zn voulu azcoA.deA à ce tAavult; j*cU, nznzonXxt zn lui un intZÂlozutzun. c/LÙtiquz blznvzA liant -toujouu IntPAz^^ë.,
HonàlzuA J,Ca^pzÂA a tmolgni tout au long dz czttz fizzh.zn.zhz d'unz mlnutlz zt d’un 6oln pafLtlzuHznzwznt attzntl^6 aux n.QÀ,ultati>, qu’il tfiouvz Izl l’ zxpfiZi>&lon dz tjout.z ma gfiatltudz.
Je ^emcAC-ée Mon&lzufi J.M, Ruijàszhazfit qui m’a inltlzz aux pfioblzmz^
dz la zhÂmlz~phij6lquz; z’zét lui qui m’a azzzuUllz au l^onutolnz zt m’a znzounagzz à znlfizpfizndfiz Iz pfitiznt thjxvail..
J’al .tAOUvz zhzz toutzi zej> pzAôonnzé Iz 6ouzl. pzAmanznt d’amêllonzA (fX dz pofijalnz Izé tzzhnlquzi dz lu pkyàlzo-zhlmlz d.z6 ■àuA^azzA a^ln
d'obtznlA dzJ> Aziultati toujonM mzlUzufU.
Je voudfial& au6.&l Azmznzlzn. toui> zzux qui ont, au
zoujudz zz&
dQJi.ni^Qj> annzzô, ciiàzutz avzz mol dz ce tfiuvall zt. zn pantlzullzn. mzô zoUP.guz^ dz laboAotolnz, Madame A^Tznznbaum-GaynbZyng zt Monàlzun H.Vzlzzfu,
Je Amzfizlz taui, zzux qui ont. zu l’amabltutt dz Aztlfiz tout ou pantlz du manuéznlt zt d'y appoAtzn. IzuM znltlouzé.
Mon zonjolnt nz pzut ztJiz oublié, poun. Iz6 judlclzux zonszllâ zt l’aldz patlznt.z zX vlgltantz qu’lt a apponXéz à. la AéulUatlon dz zzttz thlôz.
■Son Aoutlzn moKol zonàtant m’a éXz d’un gnand hzzouJU, éunXout dufiant. zzttz dzAniéAz année panXlzuliéAzmznt zhangéz.
En^ln jz Azmznclz l’ï.R.S.J.A. pouJi la zon^lanzz zt l’aldz mat^Alzllz
qu’lt m’a apponX&z.
aire occupée par molécule du constituant i dans le film étalé (A
°
2
aire occupée par molécule dans un réseau jointif (A )
°
2
aire moléculaire moyenne dans un mélange binaire (A ) aire totale offerte au film étalé
-2
concentration superficielle en substance étalée (mg.m ) constante diélectrique de l'eau
charge élémentaire constante de Boltzmann
concentration "superficielle" en cation monovalent (mole.l
°
-2
nombre de molécules du constituant i par unité de surface (A ) nombre de molécule du constituant i
nombre de molécules ionisées constante des gaz parfaits
fraction molaire du constituant i valence de l'ion
degré de dissociation degré d'association
potentiel de surface (mV)
contribution verticale du moment dipolaire du constituant i (mD) -1
pression superficielle (dynes.cm )
°
-2
nombre de charges par unité de surface (A )contribution électrostatique au potentiel de surface (mV)
Anta DPPC Gr A Gr S PA PS Val Vm-Glu
Antamanide
DL-a-dipalmitoyl phosphatidyl choline Gramicidine A
Gramicidine S Acide palmitique Phosphatidyl sérine Valinomycine
Valinomycine dans laquelle un. résidu valyl a été remplacé par un résidu glutamyl
Valinomycine. dans, laque lie .un résidu valyl a été remplacé par un résidu lysyl
Vm-Lys
Quatre antibiotiques spécifiques de la membrane - la valinomycine, 1 'antamanide, la gramicidine S, la gramicidine A - sont étudiés sous forme de couches monomoléculaires et au sein de films lipidiques.
La pression superficielle, le potentiel de surface et l'échange
isotopique sont utilisés pour caractériser le comportement de ces substances à l'interface air-eau.
Les deux premières méthodes de mesure permettent ensuite d'aborder l'étude des interactions antibiotique-lipides dans le cas de la gramicidine S et de la gramicidine A, et de la complexion ionique dans le cas de la
valinomycine et de 1'antamanide.
Les résultats obtenus sont mis en corrélation avec les données relatives au comportement de ces substances au sein de membranes biologiques et avec les données accumulées à leur sujet par d'autres techniques de mesure.
INTRODUCTION 1 CHAPITRE I - STRUCTURE ET PROPRIETES DE QUELQUES
ANTIBIOTIQUES 4
1.1. Propriétés physico-chimiques de la Gramicidine A 5
1.1.1. Structure et Conformation 5
1.1.2. Sélectivité ionique et interactions antibio
tiques-ions 9
1.1.3. Gramicidine A à l'interface air-eau et au sein
de modèles membranaires 10
1.2. Propriétés physico-chimiques et la Gramicidine S 13 1.2.1. Structure et conformation en solution 13 1.2.2. Gramicidine.S à l'interface air-eau et au sein
de modèles membranaires 16
1.3. Propriétés physico-chimiques de la valinomycine et
de 1'antamanide 19
1.3.1. Conformation de la 'valinomycine et de son com
plexe avec l'ion 19
1.3.2. Conformation de l'antamanide et de son complexe
avec l'ion Na^ 23
1.3.3. Valinomycine et antamanide à l'interface air-eau
et au sein de modèles membranaires 27
CHAPITRE II - TECHNIQUES...E.XPER.IMENTALES 3 1
2.1. Substances employées 32
2.2. Méthodes de mesure et appareillage 33
2.2.1. Pression superficielle 33
2.2.2. Potentiel de surface 33
2.2.3. Echange., iso.topique 34
2.2.4. Bico.uche^ asymétriques
36
3.1. Etude de la conformation et de l'orientation de divers
antibiotiques à l'interface air-eau 39
3.1.1. Pressions superficielles 39
3.1.2. Echange isotopique à l'interface air-eau. 41 3.1.3. Potentiel, de surface : étude de l'orienta
tion de la Gramicidine S à l'interface 41 3.1.4. Potentiel de surface : étude de la complexion
des ions par 1'antamanide, la valincmycine et
ses analogues 47
3.1.5. Conclusions . 52
3.2. Comparaison du comportement de la Gramicidine A et de la Gramicidxne. S au sein de films 1 i.p.i,dl qn e s, par
pression superficielle 53
3.3. Incorp-oration de valinomycine et d'antamanide au sein de films lipidiq-uesEtude.de la complexion ionique par pxession supe.rf Icielle, potentiel de.surface et
mesure de la conductance membranaire 57
3.3.1. Pression superficielle de films mixtes
valtncm-ycine-phosph.o.lipides .... 57 3.3.2. Potentiel de surfaoe de films mixtes valino-
mycine-phospholipides 58
3.3.3. Films mixtes v.al.inomycine-lip.ldes.. :. effet du pH 67 3.3.4. Potentiel de surface de films mixtes antamanide
-lipides 70
3.3.5. C O n du c.t-anc e. d.e bicouch.es.. asymétriques. ..en présen
ce de valinomycine 72
CONCLUSIONS 74
BIBLIOGRAPHIE 77
II existe plusieurs manières de tenter un classement des antibiotiques.
On peut les caractériser par leur origine, leur nature chimique ou leur mode d'action au niveau cellulaire. Suivant ce dernier critère, il est possible d'établir une distinction fondamentale entre deux classes de substances : celles qui exercent leur activité au niveau des processus de réplication et de transcription du DNA, d'une part, celles qui modifient les propriétés de la membrane cellulaire, et singulièrement sa perméabilité ionique, d'autre part. C'est à cette seconde catégorie de substances que s'attache le pré
sent travail.
Il est cependant commode d'introduire une subdivision supplémentaire au sein de cette catégorie, et de distinguer les antibiotiques "mobiles" (capa
bles de former avec divers ions des complexes liposolubles pouvant être trans
férés d'un côté à l'autre de la barrière hydrocarbonnée constituée par l'inté
rieur de la membrane cellulaire) et les antibiotiques "fixes" (capables de s' incorporer au sein du matériel lipidique et de modifier, par leur présence, la perméabilité de l'édifice membranaire). La valinomycine et 1'antamanide, molécules cycliques de type peptidique, appartiennent au premier sous-groupe ainsi défini. La gramicidine S et la gramicidine A, qui présentent également une structure peptidique, appartiennent au second sous-groupe.
Ces substances possèdent toutes un poids moléculaire de l'ordre de 1000 à 2000 et son insolubles en milieu aqueux. En raison de cette dernière ca
ractéristique, la plupart des études conformationnelles qui leur ont été con
sacrées ont été menées en solution organique, conditions qui s'éloignent mal
heureusement fort de celles qui prévalent dans le milièu biologique.
En ce qui concerne l'activité biologique proprement dite, les diverses études ont, le plus souvent, été menées sur des cultures cellulaires et ne permettent, en raison de la complexité de tels systèmes, que l'observation des effets globaux.
Les recours aux modèles membranaires (couches mono- ou bimoléculaires li
pidiques) permet de palier de tels inconvénients. La phase aqueuse, matéria
lisée par le support sous jacent à la couche monomoléculaire restitue, au moins partiellement, les conditions d'environnement naturelles, tandis que
la simplicité du modèle membranaire étudié autorise une interprétation peu ambigüé des résultats expérimentaux.
Le présent travail s'assigne pour but l'étude des quatre antibiotiques précités, au moyen des diverses techniques de la physico-chimie des surfaces ; pression superficielle, potentiel de surface, échange isotopiqueà l'interface.
Leur comportement est tout d'abord envisagé à l'interface air-eau, en absence de matériel lipidique, et les résultats obtenus mis en corré
lation avec les données relatives aux paramètres conformationnels de ces molécules. Deux analogues ionisables de la valinomycine, synthétisés récem
ment, sont également étudiés au cours de cette première phase de travail.
L'incorporation des antibiotiques au sein du matériel lipidique, simulant l'environnement membranaire, constitue la seconde phase de travail. L'interaction de la gramicidine A et de la gramicidine S avec deux phospholipides y est envisagée en termes du mode d'action de ces s\ibstances vis à vis de la membrane biologique. La complexion des cations monovalents à l'interface lipide-eau, par la valinomycine et 1'antamànide, est ensuite abordée. Le rôle joué par la^nature du matérie lipidique, et en particulier de la tête polaire, sur le processus de complexion, est plus spécialement pris en considération. Au cours de cette dernière partie du travail, la valinomycine est également introduite au sein de bicouches lipidiques asymétriques.
Avant de présenter les résultats obtenus au cours de ces différentes phases de notre étude, il nous paraît souhaitable de dresser un rapide bilan des travaux consacrés ces dernières années à l'étude de ces divers antibiotiques d'un point de vue physico-chimique.
CHAPITRE I
STRUCTURE ET PROPRIETES DE QUELQUES ANTIBIOTIQUES
Quatre antibiotiques, la gramicidine A, la gramicidine S, la valino- mycine et 1'antamanide, sont étudiés dans le présent travail. Ce chapitre a pour but de faire le point des connaissances acquises à propos de la structure chimique, de la conformation et, le cas échéant, du comportement de ces différentes substances au sein de modèles de membrane.
Pour des raisons de commodité, les quatres substances sont envisagées l'une à la suite de l'autre et les informations accumulées à leur sujet sont présentées dans la mesure du possible, en se plaçant d'un point de vue chronologique.
1.1. PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DE LA GRAMICIDINE A
1.1.1. Structure et conformation
La gramicidine A a été isolée en 1941 par Hotchkiss et Dubos (1) au départ de bacillus brévis. Sur la base d'analyses d'hydrolysats, ces au
teurs lui attribuèrent un squelette moléculaire constitué entièrement d'aci
des aminés neutres.
Ce n'est cependant qu'en 1965 que Sarges et Witkop (2,3) identifièrent la structure primaire de cet antibiotique :
HCO - Ile, - Gly - L Ala - D Leu - L Ala - D val - L Val - D Val - L Try - Val
D Leu - L Try - D Leu - L Try - D Leu - L Try - NH-CH^-CH^OH.
En fait, la gramicidine est un mélange composé à 60-80 % de valine gramicidine A et à 40-20 % d'isoleucine-gramicidine A, suivant l'acide aminé situé en début de chaîne (4). Les deux caractéristiques principales de cette structure résident d'une part dans l'alternance d'acides aminés L et D, d'autre part dans le fait que tous ces résidus, à l'exception de la glycine en position 2, sont hydropho
bes .
Il est à remarquer toutefois que la gramicidine A utilisée dans nos travaux est un mélange constitué de gramicidine A, BetC (72 %, 9 %, 19 %) dont la composition en acides aminés se trouve rés\imée dans le tableau 1.1. Ces trois gramicidines ont leur NH^ terminal formylé et leur groupement carboxyle amidifié par 1'éthanolamine.
Gr. gly Ala Val Leu Try éthan. Phe Tyr
A 1 2 4 4 4 1
B 1 2 4 4 3 1 1
C 1 2 4 4 6 1 1
Tafa£eau 1.1. Compo6^ùtCon du gn.(mlcÂ.dln<L& k, E C
De nombreux travaiix ont été consacrés ces dernières années à l'étude de la conformation de la gramicidine A en solution, compte tenu de son importan
te activité antibiotique. Cette dernière est en relation étroite avec le rô-
le joué par la molécule au sein de la membrane cellulaire; à savoir : faciliter la diffusion passive des cations alcalins et de de l'extérieur vers l'inté
rieur de la cellule (5,6,7) .
La première hypothèse conformationnelle qui vient naturellement à l'es
prit en regard de sa structure primaire (toutes les chaînes latérales étant hydrophobes), est que la gramicidine A s'insère dans la membrane sous la forme d'un tunnel permettant aux ions de franchir la barrière lipidique entourant la cellule. Cette hypothèse fut immédiatement vérifiée par des mesures de conduc
tance (8,9) qui ont également montré que seules des associations de deux molé
cules par pore étaient autorisées (10).
En 1971, Urry (11,12), se basant sur des mesures de dichroîsme circulaire, suggère l'existence de deux structures spatiales stables pour la gramicidine A l'une apparentée à la conformation hélicoïdale, l'autre au feuillet plissé 3.
Ce deuxième modèle fut rapidement éliminé. En effet, une telle structure exi
gerait la présence de 70 résidus disposés bout à bout, c'est-à-dire un peu plus de trois molécules de gramicidine A, pour pouvoir réaliser un tunnel trans
C
membranaire de 36 à 40 A de long (épaisseur de la membrane).
D'autre part, les structures hélicoïdales classiques, rencontrées généralement dans la littérature (voir tableau 1.2), ne convenaient pas d'avantage dans le cas de cet antibiotique. Celles-ci étaient, soit trop courtes, dans le cas de l'hélice Y trop longues, soit encore incapables de satisfaire les conditions d'hydrophobicité imposées par la structure primaire de la gramici
dine A (l'hélice 2.2^ forme en se dimérisant une structure hydrophile).
Hélice 2.2^
^10 3.6^3(a) 5.1^/y) Longueur par
0 résidus (A)
2.75 2 1.5 0.98
Longueur de 16 0 peptides en A
44 32 24 15.7
TabZdoa 1.2. GfimiicuxLinz A - poAmèJAe c.on^oAmatlonmLi
L'hé-tcc^ dé^Zgnée poA dmx : tz p-iemiM. Qj>t It YiombfiQ, d2. fiti>idvüii poA touA iX. itcond tz nombAz d'atomzô poA ci/cZz.
c'est ainsi que les diverses données citées ci-dessus ont conduit Urry à admettre un seul type conformationnel possible pour ce pentadécapeptide linéaire : l'hélice gauche II (L,D) .
Dans ce modèle, tous les groupements peptidiques, à l'exception des ex
trémités, sont liés par des liens hydrogène intramoléculairœ et les groupe
ments latéraux sont dirigés à l'extérieur de l'édifice, ce qui explique le caractère d'hydrophobicité associé à la molécule. Par l'alternance en di
rection des liaisons C=0 des groupements peptidiques, ces hélices H (L,D) sont capables de se dimériser par formation de liens hydrogène intermolécu
laires (entre les deux groupes formyl) formant un pore caractérisé par une longueur, un diamètre intérieur et une sélectivité ionique, tributaires des caractéristiques de l'hélice considérée. Dès lors, la structure spatiale qui fut attribuée par Urry à la gramicidine A est l'hélice II (L,D) (figure
1.1) privilégiée par rapport aux autres hélices du point de vue de la loii-
O O
gueur du dimère (25 à 30 A) , et du diamètre du pore (4 A) .
R
FtguÆé 1.1. GfLCUfnccÂ,cU.ne, A - Pe/t6pecitve long de, Vaxe de. VhéJiicz n {L,V] montAant appAoxxmatcvement 6,3 fiéJ,lduM poA touA
/à 20 et 22 atomes pcui cycle
Une autre conformation, constituée de deux chaînes enroulées autour d'un axe commun sous la forme d'une double hélice 3 droite ou gauche, fut proposée récemment par Veach, Fossel et Blout (1974) (13),
S'appuyant sur des données de dichroîsme circulaire, de résonance magnétique nucléaire et de spectroscopie infra-rouge, ils suggèrent (figure 1.2) un nou
veau mode de dimérisation des molécules de gramicidine A, dans lequel tous les liens hydrogène sont intermoléculaires.
fZguA& 1.2. G/umicUctm A
Voubté httic.
2. aifvtLpaAaltH.e. à 7 pciA touA (gauche.]
O Cette double hélice, comparable à celle du DNA, forme un pore de 3 A de diamètre intérieur. Le tableau 1.3 reprend les caractéristiques rela
tives aux doubles hélices 3 parallèles et antiparallèles ainsi que celles des hélices II (L,D) précédemment envisagées.
TabZcau 1.3. GAornicU-dine. A CompoAcuUon de^ dU.{^lé.Ae.yvti> modeler
pA0p06C6.
Le trait commun aux deux modèles considérés comme plausibles est la présence d'un large pore hydrophile, le long de l'axe du dimère, "orienté"
par les oxygènes carbonyles des groupes amides.
Les résultats expérimentaux actuels ne sont pas suffisants pour tran
cher de manière définitive en faveur de l'une ou l'autre de ces deux pos
sibilités .
1.1.2. Sélectivité ionique et interactions antibiotiques-ions
La mesure de la conductivité membranaire a permis à un certain nombre d'auteurs (11,14) de montrer que la gramicidine A incorporée dans une membrane rend cette dernière perméable aux cations monovalents. L'existence d'une région à potentiel négatif dans le pore et la présence des extrémités acyles et alkyles, pouvant engendrer des coordinations avec les ions, per
mettent d'expliquer la facilité de passage des cations vis-à-vis des anions.
L'interaction initiale de l'ion avec l'antibiotique se ferait plus volontiers avec la "queue" éthanolamine qui a trois groupements coordinants possibles
(deux oxygènes-acyles et un "éthanolamine"), qu'avec la "tête" (extrémité formyle), ne possédant que deux oxygène acyles.
La possibilité de former un complexe est reliée à un certain nombre de facteurs comme la taille du pore et la conformation du ligand.
Selon Urry (11,12), le diamètre intérieur de l'hélice (L,D) permet d'ex
pliquer la sélectivité ionique observée :
NH^ > Cs^ > Rb'*’ > k'*’ > Na'*’ » Li''’
O
L'ion ammonium a un diamètre de 2,86 A et passe à travers le pore avec un O minimum de perturbations; l'ion potassixm avec son diamètre de 2,66 A né
cessite lors de son passage une relaxation de conformation dans laquelle les directions des vecteurs C=0 se tournent vers le centre du tunnel; le
O
passage de l'ion sodium (diamètre = 1,92 A), quant à lui, provoque la plus grand perturbation.
lléanmoins, ces différences ne sont pas très grandes : la séquence de sélec
tivité ionique est très faible comparée à celle observée dans le cas d'au
tres antibiotiques effectuant des déplacements à travers la membrane.
En effet, le rapport de perméabilité ionique - relativement au Na^ - des membranes contenant de la gramicidine A, est de 3,1, 4,3, 5,6 respective
ment pour k"*^, Rb^, Cs^.
Byrn (15) tente d'en expliquer les raisons en soulignant le fait que le modèle conformationnel, proposé par Urry pour la gramicidine A, est lui-
4 6
même sujet à discussions. "Est-ce une hélice t (L,D), tt (L,D) ou une 4 6
hélice hybride ir - tt ?" Il semble logique de penser que l'ion s'accro
che plus fermement dans la cavité interne d'un transporteur mobile que dans le pore d'une hélice hybride.
1.1.3. Gramicidine A à l'interface air-eau et au sein de modèles membranaires
La plupart des études conformationnelles de la gramicidine A ont été réalisées dans des solvants organiques. Or, il est évident que les propriétés antibiotiques de cette substance se manifestent dans un environnement essentiellement aqueux. Ceci pose un problème expérimen
tal important; en effet, la solubilité dans l'eau de cet antibiotique est extrêmement faible. Pour contourner cette difficulté, il est possi
ble d'étaler la gramicidine A sous forme de couches monomoléculaires à l'interface air-eau. C'est dans cet environnement, schématisant à l'ex
trême les conditions d'anisotropie rencontrées au niveau de la membrane, que quelques auteurs ont entrepris d'étudier la conformation de la grami
cidine A. Un modèle plus réaliste consiste à étaler simultanément l'an
tibiotique et le matériel lipidique à l'interface air-eau, ou à incorpo
rer l'antibiotique au sein de bicouches lipidiques.
Dans un premier stade, Kemp, Jacobson et Wenner (16) se sont atta
chés à déterminer par des mesures de pressions superficielles, l'aire oc
cupée par une molécule de gramicidine A dans un réseau de molécules join
tives. Les mesures de pressions superficielles, bien que ne permettant pas d'accéder immédiatement à la structure de la molécule à 1'interface,
o2
autorisent la détermination d'une aire de 180 A • Cette valeur corres
pond à l'aire pouvant être calculée au départ d'un cylindre creux de 15 de diamètre extérieur et apparaît compatible avec les modèles proposés.
Ces auteurs concluent donc à l'existence à l'interface air-eau d'un film au sein duquel les molécules de gramicidine A seraient disposées côte à côte avec le grand axe du cylindre dirigé perpendiculairement au plan de 1'interface.
Lorsqu'un fiTm monomoléculaire de lipide est étalé ensuite sur le film monomoléculaire d'antibiotique, une étude du processus de pénétra
tion de la gramicidine A dans la couche lipidique peut être envisagée.
Les mêmes auteurs ont pu démontrer par cette technique que ce sont des
>
Odimères ou agrégats de gramicidine A qui s'insinuent dans les films lipi
diques étalés.
En 1970, Hladky et Haydon (17) étudient les modifications de conduc
tance de bicouches lipidiques en présence et en absence d'antibiotiques.
Ils observent qu'en absence d'antibiotiques, la conductance d'xin film bi
moléculaire de lipide est constante. Par contre, lorsqu'un antibiotique est introduit dans le système, la conductance augmente. De plus, cette augmentation est différente suivant la nature de l'antibiotique incorporé : en présence de nonactine (antibiotique cyclique), la conductance augmente progressivement au cours du temps; en présence de gramicidine A elle fluc
tue par sauts.
Pour expliquer ces différences, de comportement, les auteurs de ces expérien
ces émettent l'hypothèse que la nonactine forme un complexe 1/1 avec l'ion monovalent, et que ce complexe traverse ensuite la membrane. Dans le cas de la gramicidine A, les pics de conductance observés seraient liés à la dimérisation de la molécule, le début et la fin d'un pic correspondant à la formation et à la dissociation d'une unité conductrice constituée par un dimère. On peut en effet remarquer que la conductance membranaire aug
mente avec le. carré de la concentration en gramicidine A dans la phase aqueuse, ce qui indique que le tunnel est bien constitué d'un dimère.
En 1972, ces mêmes auteurs (18) observent que les molécules de gra
micidine A sont localisées dans les membranes et qu'à chaque instant une grande proportion de ces molécules est inactive. L'équilibre entre les unités conductrices (dimères) et non conductrices est très sensible à 1' épaisseur de la membrane,, le temps de vie du tunnel étant inversément proportionnel à l'épaisseur de la membrane.
D'autre part, Hladky et Haydon remarquent que la séquence des différen
tes conductances ioniques est similaire à celle obtenue pour les mêmes électrolytes en solution aqueuse; ils en concluent que le pore transmem
branaire contient de l'eau. Le passage à travers ce "canal" ressemble à un phénomène de diffusion dans l'eau : l'énergie d'activation pour le pas- sage de Na et K à travers le pore vaut 4,5 à 5 Kcal/mole, alors que pour + + la diffusion en solution aqueuse on observe 4,4 à 4 Kcal/mole.
En 1977, Appell, Bamberg, Alpes et Laûger (19) étudient la formation de pore ionique avec un analogue chargé négativement de la gramicidine A, la 0-pyromellihylgramicidine A. Ces auteurs remarquent que ce dérivé forme des tunnels perméables aiix ions selon un schéma similaire à celui de la gramicidine A. Toutefois, la variation de conductanceobservée en présen
ce de cet antibiotique est moins marquée que dans le cas de la gramicidine A.
L'explication réside dans le fait que deux molécules d'antibiotiques ne peu
vent se combiner pour former un tunnel que si elles sont en face l'une de l'autre dans la bicouche lipidique. La gramicidine A non modifiée étant fort hydrophobe peut se déplacer plus facilement dans la membrane que son analogue chargé et, de cette manière, forme plus facilement une unité con
ductrice. Ceci constitue une preuve supplémentaire à l'appui de la thèse suivant laquelle le tunnel transmembranaire est formé par. l'association de deux monomères.
Le modèle le plus plausible à l'heure actuelle est celui suivant le
quel deux molécules de gramicidine A, en pénétrant dans la couche lipidique, forment un tunnel impliquant une interaction hydrophobe marquée entre la partie extérieure du cylindre ainsi réalisé et les chaînes hydrocarbonées des phospholipides membranaires (figure 1.3).
£ p P 00—5”
6^ 5 S
^ <pccû_ctj4_0
£^cL'zx:>cc3JL^r>n<xA
f
^Co(ju) ^'OO-'TO > cJoCf /9 ,
VI
qujiq, 1.3. GàxmLcJ,dlnz A au, 6eJ.n d’une.b-icouche LipZdLique
1.2. PROPRIETES PHYSICD-CHIMIQUES DE LA GRAMICIDINE S
1.2.1. Structure et conformation en solution
La gramicidine S est un décapeptide cyclique constitué de 10 rési
dus acides amrnés identiques deux à deux :
— —
L Pro - L Val - L Orn - L Leu - D Phe D Phe - L Leu - L Orn - L Val - L ProUn grand nombre de techniques physico-chimiques, telles que la dispersion optique rotatoire (ORD), le dichrolsme circulaire (CD), la résonance magné
tique nucléaire (RMN), la résonance paramagnétique électronique (EPR), ont été utilisées ces dernières années en vue de déterminer sa conformation.
Depuis 1957, différentes structures spatiales ont été proposées.
Hodgkin et Ougton (20) proposèrent comme structure la plus probable le feuillet plissé g à quatre liens hydrogènes. Ce modèle est confirmé en 1968 par Schwyser et Ludescher sur base de données de résonance magnéti
que nucléaire (21).
La même année (1968), un autre groupe de chercheurs (22) suggère 1' existence de régions hélicoïdales : les résidus (valine-ornithine-leucine)^>
impliqués dans deux hélices a droites antiparallèles, seraient reliés à deux segments non hélicoïdaux (phénylalanine-proline)
2
• Cette structure présenterait deux ponts hydrogènes entre les oxygènes des carbonyles des deux résidus valine et les protons NH des deux résidus phénylalanine.Pour confirmer leurs hypothèses (obtenues par études de diffraction des rayons X), Liquori et Conti suivent par spectres RMN l'échange hydrogène- deutériimi de la Gramicidine S dissoute dans divers mélanges diméthylsul- foxide - eau deutérée. Cette technique est basée.sur le fait que les pro
tons liés aux atomes d'azote s'échangent plus difficilement avec les pro
tons du solvant lorsqu'ils sont impliqués dans des liaisons hydrogène.
Ces dernières sont effectivement décelées aux emplacements prévus par les auteurs qui concluent à la validité de leur modèle. Cependant, toujours en 1968, par analyses de spectres RMN également, Stern, (23) arrive à des conclusions tout à fait opposées à celles recueillies par Liquori et Conti.
Il réfute toute possibilité d'existence de régions à structures hélicoïda
les dans la molécule et élabore un modèle apparenté au type g à 4 liens hydrogène (figure 1.4), en s'appuyant sur les considérations suivantes ;
- la présence d'un axe de symétrie d'ordre 2
- un petit angle <j> (trans) pour les résidus Orn, Leu, Val - un grand angle \p (ois) pour le résidu Phe.
- 4 protons s'échangeant plus rapidement que les autres.
NIh
a / \
■A
H
MH
C.rO--tt-N/
a \
Cl^ ,CH C H H H CHJ
Jù ^
FXguAt 1.4. GA.anu.cU.cUm S
deux tAUp^ptcdeJ, [L \/al - L ÛA.n - L L^a]
an4UpcLAaIZè.Zm^nt côtt à côtz zt A.eUUê.6 pan.
[V ?kz - L Pa.o) Lu .tcgnu en poûntélZêA quent £e4 ZUen&^hgdAogenei>.
&ont plaeti .eux 6egmentii '---H ûndU-
Ce modèle permet d'expliquer l'échange rapide hydrogène - deutérium des deux résidus Phe et Orn. En effet, étant situés à l'extrémité du cycle, ces deux résidus sont fortement accessibles au solvant.
En fait, jusqu'en 1970, la structure spatiale de la gramicidine S n'a pu être rigoureusement prouvée. Il fallut attendre Ovchinnikov (24) et ses collaborateurs pour que la conformation de cette molécule soit établie de manière définitive. Ils utilisèrent un mode d'approche identique à celui qui fut adopté pour un autre antibiotique cyclique : la valinomycine. Il est basé sur l'emploi de différentes méthodes physico-chimiques indépendan
tes .
Une étude quantitative des bandes d'absorption des spectres infra-rouge in
dique que six groupements NH participent à des liaisons hydrogène intramo- léculaires. D'autre part, la comparaison des vitesses d'échange hydrogène- deutérium Indique que des six liens trouvés par infra-rouge, seuls quatre, formés par les NH des résidps Val et Leu sont très stables.
Par ailleurs, une étude des constantes de couplage spin-spin (J.,„ _„) des résidus Val, Orn, Leu, montre que les protons de ces fragments sont tous trans (J = lO / 9,6 / 10 hertz) alors que ceux de la Phe sont gauches
(J = 4,1 hertz).
Cette structure, identique au feuillet plissé g, prédit par Hodgkin, Oughton et Schwyzer, exclut tout autre modèle proposé pour la gramicidine S. Dans ce modèle (figure 1.5) , les chaînes latérales de la Valine et de la Leucine sont placées d'un côté du plan du cycle, tandis que celles des résidus Orni- thine, avec ses groupements NH^ libres, sont orientés de l'autre côté. Dans les solvants non polaires, ces groupements participent à des liaisons hydro
gènes avec les carbonyles du peptide voisin.
FtguA.e 7,5. ^pcutùitz de. la. gfiamlcÂ.dU.ne. S en ■iotutlon
Le facteur essentiel de la manifestation biologique de la gramicidine S réside dans le fait que cet antibiotique possède deux groupements char
gés (résidus ornithine) . Mais contrairement à la valinomycine, l'antama- nide et la gramicidine A, la gramicidine S ne possède pas de cavité inter
ne ni de pore capable d'accomoder des cations métalliques et de ce fait ne forme pas de complexes avec ceux-ci.
1.2.2. Gramicidine S à l'interface air-eau et au sein de modèles mem- branaires
Comme dans le cas de la gramicidine A, en raison de l'insolu
bilité de la gramicidine S en phase aqueuse, la plupart des études envisa
gent le comportement de cette molécule en milieu organique, ce qui ne fa
cilite évidemment pas un rapprochement ultérieur avec son mode d'action au niveau de la membrane. C'est pourquoi, certains auteurs, comme Abbot et Ambrose en 1953 (25) et Few en 1957 (26), se sont attachés à étudier la conformation de la gramicidine S par la technique des couches monomolécu
laires précédemment citée.
Few propose, à l'interface air-eau, un modèle qui situe tous les groupe
ments NH et CO dans un même plan, et approximativement coplanaires aux a- tomes C des acides aminés. Les quatre ponts hydrogène, attribués à cette
a
molécule cyclique, rendent ce décapeptide particulièrement rigide. La seu
le flexibilité réside dans le mouvement possible des chaînes latérales des différents acides aminés. Ce modèle a pu être vérifié par la technique de pression superficielle, employée également par Kemp dans le cas de la gra- raicidine A. L'allure caractéristique de l'isotherme de pression (26) mon
tre que la gramicidine S forme un réseau monomoléculaire rigide.
Few, dans une première étape, s'attacha à calculer la valeur de l'aire oc
cupée par la gramicidine S, dans un réseau de molécules jointives (A ). La
©2 O
valeur qu'il obtient est de 170A et est en accord avec la détermination théorique de 172 A , correspondant à la répartition suivante des acides
°2
aminés (les résidus marqués d'une " plongent dans la phase aqueuse) :L Pro” - L Val” - L Orn“ - L Leu" - D Phe D Phe - L Leu - L Orn“ - L Val - L Pro
La détermination du potentiel de surface lui permit par la suite de confir
mer l'immersion alternée des acides aminés, à l'exception des deux phényl- alanine qui sont situées.dans l'air et des deux ornithines qui sont immer
gées dans la phase aqueuse, perpendiculairement au plan du cycle. Le cal
cul du moment dipolaire, qu'autorise cette méthode de mesure, conduit en effet à trancher en faveur d'une orientation de ce type.
Bien que depuis 1957 la gramicidine S ait fait l'objet d'études dé
taillées concernant sa structure, sa conformation et sa biosynthèse, on ne possède jusqu'à présent que très peu de renseignements concernant son mode d'action sur les bactéries. Cet antibiotique, dépourvu de caractère complexant vis-à-vis des ions., agirait par simple "lyse" de la membrane cellulaire. Ceci suppose une interaction lipide-antibiotique importante de telle sorte que la gramicidine S puisse pénétrer la couche lipidique et provoquer sa désorganisation.
Chapman et son équipe {21), en 1972, étudient l'interaction Irpide- antibiotique au niveau d'une émulsion de lécithine dans l'eau. Pour ce faire, ils choisissent trois antibiotiques fort différents du point de vue de leur structure et de leur conformation ; la polymixine B, la chlo- rotricine et la gramicidine S. Ils analysent les spectres de résonance magnétique nucléaire et remarquent que la chlorotricine et la polymixine B présentent les mêmes caractéristiques : elles élargissent le signal de la chaîne hydrocarbonée du lipide, ce qui peut s'interpréter comme une restriction à la mobilité de la chaîne lipidique. En effet, une entrave à la libre rotation se manifeste sur le spectre par un élargissementde la rare. Par contre, aucune modification de ce genre n'est observée dans le cas de la gramicidine S.
Les différences de structure qui existent entre ces trois antibioti
ques vont leur permettre d'expliquer leurs résultats (figure 1.6). La polymixine B est un polypeptide cyclique possédant une longue chaîne hy
drophobe qui pénètre entre les queues hydrocarbonées des lipides en les immobilisant. La chlorotricine., également, forme un complexe avec les chaînes hydrocarbonées des lipides par interactions hydrophobes. Compte tenu de la structure de la gramicidine S, on peut donc■conclure à l'exis
tence d'une interaction de type non hydrophobe avec le matériel lipidique.
De plus, la sensibilité de ce mélange à l'addition d'ions semble indi
quer que cette interaction est essentiellement de nature électrostatique.
La technique de calorimétrie différentielle, que Chapman utilise ensuite, l'amène à confirmer ces résultats. Le présent travail se propose quant à lui de comparer les interactions Gramicidine S - lipides avec les inter
actions gramicidine A - lipides sein de couches monomoléculaires mixtes et de tenter de relier les résultats obtenus lors de l'étude de ces systè
mes aux informations déjà recueillies dont il a été fait état ci-dessus.
F-cguA& 1.6. Schéma de, VIntoJuieXÀjan de, tAoÂj, aYVtibÂ,otiqa.e6 ave,c la
mejvb^anc biologique (modèle, de. Vanle.111).
1.3. PROPRIETES PHYSICQ-CHIMIQUES DE LA VALINDMYCINE ET DE L’ANTAMANIDE
La valinomycine et l'antamanide appartiennent au groupe des antibio
tiques capables de complexer-les ions alcalins et de favoriser leur dif
fusion à travers la membrane biologique. Le pouvoir antibiotique de ces substances apparaît étroitement lié à leur pouvoir complexant, puisque le déséquilibre ionique provoqué par leur présence au voisinage de la membra
ne peut atteindre la valeur léthale. Ces deux sxibstances se caractérisent par leur spécificité plus ou moins grande vis-à-vis d'un type d'ions pré
sent dans le milieu physiologique ; l'ion (28-31) dans le cas de
la
+ 'valinomycine, l'ion Na (32,33) dans le cas de l'antamanide.
La sélectivité ionique étant fonction de la nature et de la conformation de la molécule complexante (34,35), les paragraphes qui suivent résument 1'ensemble des données relatives à la composition chimique et à la géomé
trie de ces deux ionophores en solution et à 1'interface air-eau.
1.3.1. Conformation de la valinomycine et de son complexe avec l'Ion K
La valinomycine est un depsipeptide cyclique constitué de 6 rési
dus amino-acides [N C (C„)C] alternant avec 6 résidus esters [O C (C„)C]
a B a P
de configuration L et D :
a a a a
cyclo (NH - CH - C' 1
0
10
1 ■0
K 10
-0-NH-CH-C - 0 - 0 - CH B *CH / \
^CH / \
^CH / \
B*CH3
CH
3
CH3
C«3 ^=“3 CH
3
CH3
L Val D HYIV D Val L Lac
Le dichrolsme circulaire, la spectrométrie infra-rouge et ultra-violette ainsi que la résonance magnétique nucléaire ont permis de montrer qu'en solu
tion, la valinomycine présente trois conformations en équilibre, différentes par le nombre de liens hydrogène intramoléculaire. La figure 1.7. schématise ces différentes conformations.
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quA-
q, 1.7. Coniohmoutlon de £a vatinomycUm en &oZjuution ---► ; pont H (1-4) ---> ; pont H [1-3]
o ^/ 9 7 « y v -^ ^ Q T fO H f't ^ ^
f^^ A -f
~JpOA1Dans la forme A, prédpminante dans les solvants non polaires, tous les groupements NH participent à la formation de 6 ponts hydrogène intramolécu-
laires de type (1-4). Il en résulte une très grande stabilité. Dans les solvants peu polaires, la forme B (B^ - B^) à quatre ponts H (1-4) et à trois ponts H (1-3) prédomine. Les formes B^ et B^ se différencient par la participation des groupements peptidiques aux liens H (1-4) et (1-3) . Dans la forme B^^, c'est le résidu D valyl qui intervient dans le pont (1-4) et le L valyl dans le pont (1-3). Dans la forme B^, nous observons l'inverse.
La forme C, présente dans les solvants à forte polarité, n'a pas de pont H intr a moléculaire et présente dès lors une grande flexibilité. Il apparaît donc que le nombre de liens H intramoléculaires est d'autant plus petit que la polarité du solvant est grande.
D'autre part, des études de constantes de couplage spin-spin ont permis à Ovchinnikov et ses collaborateurs de montrer que dans les milieiuc non po
laires, les groupements carbonyles pointent alternativement vers l'intérieur et vers l'extérieur du cycle (35,36).
La structure spatiale admise pour la valinomycine est constituée d'un système O
de 6 cycles à 10 membres, formant ainsi un "bracelet" rigide de 8 A de dia- O
mètre et de 4 A d'épaisseur (figure 1.8.),
O
O.' c
0-0
NVlguM, J.S. Con^^guACLtcon spatiale, dt la valinomt/clm dam Im 6olvant&
non poùUAm.
II est important de faire remarquer que c'est précisément l'existence en solution d'un équilibre conformationnel de trois différentes formes de la valinomycine qui est un facteur décisif dans la spécificité de son ac
tion biologique, à savoir sa propension à transporter les cations monova
lents, et particulièrement k"*^, à travers les membranes biologiques.
Des études physico-chimiques analogues ont été menées pour déterminer la conformation du complexe valinomycine - en solution. Ces études per
mettent de conclure que dans les solvants apolaires, ce complexe contient 6 ponts hydrogène intramoléculaires et se trouve donc sous la forme B.
Par ailleurs, Ovchinnikov et ses collaborateurs grâce à une étude compara
tive par résonance magnétique nucléaire de la valinomycine libre et comple
xée, ont montré que les ponts hydrogène du complexe sont plus stables que ceux de la molécule sous forme libre. L'architecture moléculaire du com
plexe est différente de celle de la molécule libre : la valinomycine su
bit une transcpnfomation lors de la. réaction de complexion. En effet, les spectres I.R. et R.M.N, indiquent que les 6 groupements carbonyles sont di
rigés vers 1'intérieur de la molécule dans le cas du complexe et sont en in
teraction ion-dipôle avec l'ion situé dans la cavité centrale (figure 1.9.)
O
; C 0:0 : w # ; K
V-iguAe. J.9. Con^lguAcution ^patiatz de. ta vatÂnomycâne. comptexée
&n 6ot-LLÙion.
Un aspect important de cette architecture est que l'ion est protégé du solvant par les groupements latéraux hydrophobes situés à la périphérie de
ia molécule. Il est donc clair que cette conformation autorise aisément le passage des ions à travers la membrane biologique, milieu essentiellement hydrophobe.
+
1.3.2. Conformation de 1'antamanlde et de son complexe avec l'ion Na
L'antamanide a été isolée en 1968 par Wieland (37) , d'extraits de champignon "amanite phalloïde". Elle inhibe 1'action toxique de ce champignon vénéneux. Cette molécule est un décapeptide cyclique où tous les acides ami
nés ont la configuration L (figure l.lO). Les mêmes techniques expérimenta
les que celles utilisées dans le cas de la valinomycine ont été mises à pro- / fit pour déterminer la conformation de l'antamanide complexée et non comple
xée en solution.
FtguAe l.W, Compo^^ùtCon dz
Sur base de données I.R., N.M.R. et O.R,D., Ovchinnikov et ses collabora
teurs (38,39) postulent qu'il y a dans le cas de l'antamanide libre un équi
libre de plusieurs états conformationnels dépendant de la nature du solvant utilisé. Dans les solvants non polaires (CHCl^, CD^CN), la forme A (figure
1.11) prédomine, dans laquelle tous les groupements NH participent à des liens hydrogène intramoléculaires. Dès lors, la présence de deux liens H de type 1-3 et de quatre liens H de type 1-4, celle d'un pseudo axe de symétrie d'ordre deux, ainsi que les résultats d'une analyse théorique, conduisent Ovchinnikov et al. à établir la structure conformationnelle de l'antamanide non complexée en solution (figure 1.12). En ce qui concerne l'orientation
VZguAo. ?.n. Con{^onmcutioYi dt Vantamovildz en solution
--- : poYit H de tijpe 1-4 --- ; pont H de tofpz 1-3 Le6 qwûitAz ponti, hydAogznz dsL.tqpz 1-4 6ont ^ofmé-6 peut tz6 MH dz6 AZ6tdiu aIayUn&4, phénglctZanlm^^g^jo; tz deux powtk H de typz 1-3 iz njippofvtznt aux gaoupzô MH dz6 Az-ôt- du6 vaitnzj et phzncjlalantnz^.
des groupes carbonyles, les interactions dipôles dipôles laissent suppo
ser que ces derniers n'occupent pas de directions privilégiées. Cette orientation détermine la formation du complexe antibiotique - Na^ que nous envisagerons dans la suite.
D'autre part, on a constaté dans le cas de la valinomycxne que le nom
bre de liens H diminue avec l'augmentation de la polarité du solvant et de ses interactions avec la molécule. De la même manière, dans le cas de 1'antamanide, lorsque l'on passe graduellement du milieu non polaire au milieu polaire, une succession de différentes formes nouvelles apparaît, dans lequelles les liaisons hydrogène sont de moins en moins nombreuses, jusqu'à l'obtention d'une conformation dépourvue de tels liens.
Plus récemment, Patel (40) a étudié la conformation de 1'antamanide li
bre en milieu aqueux (mélange dioxane-eau). Jusqu'alors, toutes les études
FlguJin 1.1 Z. Con^^guAcutCon 6pcutLaZt dt V omtamanldz JUhH.(i dam d&6 éotvonti non polaÂAej, (vue £e long du p^ejudo axt do, -iymétAÂ^e, d'ofid/iz 2).
avaient été menées en solution organique. -Les-spectres R.M.N., obtenus par cet auteur, indiquent que l'antamanide ne contient que deux ponts H de type 1-4. Les résidus participant à ces liens n'ont toutefois pu être identifiés.
La faible dépendance vis-à-vis du solvant des courbes ORD fait res
sortir que contrairement à l'antamanide libre, le complexe antamanide-Na"*^
est rigide et par conséquent très stable (40). Ovchinnikov et son équipe, se basant sur des données de spectres RjM.N,, suggèrent l'existence, dans des solvants non polaires, de quatre liens H intramoléculaires dont les deux du type 1-3 font participer les résidus valine, et phénylalanine
+ ^ ®
(figure 1.13). Dans ce modèle, l'ion Na est entouré de six carbonyles, mais interagit plus fortement avec ceux des résidus Val^ et Phe^ qu'avec les quatre autres (figure 1.14).
P'CC'
Pt/O
i—T
TL
quaz1.13. Con^oàmatlon du Z'antamayu.de ■comp£.^xé.& en àoZatton --- ZZen H de type 1-4 --- ZÂ.en H de type 1-3
Ftgu/Le 1.14. StfiuctuAe ^patlaZe du eompZext anta/nanlde-Na dans Zes
^oZvantA non poZatAei,.
Patel (40), au moyen de la même technique^ arrive à-des conclusions différentes. Il propose une conformation, ne contenant que deux ponts H de type 1-4, formés par les NH des résidus Val^^. et (figure 1.13).
La rigidité particulière du complexe, observée dans différents solvants, peut s'expliquer par la position très groupée des carbonyles autour de
l'ion Na : les dix carbonyles sont très proches du Na , situe dans une ca
vité centrale, mais seuls les carbonyles des résidus Pro
2
, Pro^, Pro^ et Pro interagissent avec lui par liaisons coordinatives. Contrairement à8
ce qui avait été démontré dans le cas de la valinomycine, Patel a montré que la réaction de complexion [antamanide + Na^,^=ir antamanide-Na^] est accompagnée d'une très faible modification de conformation.
La grande flexibilité associée au cycle de 1'antamanide rend plus dé
licate une analyse au niveau des liens hydrogène intramoléculaires formés et explique sans doute une certaine indétermination quant aux conformations des formes libres et complexées. Les renseignements obtenus semblent être plus contradictoires que ceux obtenus dans le cas de la valinomycine à struc
ture plus rigide.
1..3'..3. Valinomycine et antamanide à l'interface air-eau et au sein de modèles de membrane
Tout comme la gramicidine A et la gramicidine S, la valinomycine est insoluble en pha»e aqueuse. Elle a donc été fort étudiée en solution organique. Quelques travaux s'attachent cependant à la description de son comportement "interfacial", en absence ou en présence de matériel lipidique.
Kemp et Wenner (41) ont étudié, par mesures de pression superficielle et de potentiel de surface, 1'interaction valinomycine-K^ au niveau de cou-
i +
ches monomoléculaires de valinomycine étalées sur un support salin (K ) de
«
concentration donnée. L'isotherme de pression superficielle montre une in
teraction antibiotique-ion qui devient plus importante avec l'augmentation de]a concentration en potassium.dans-le support. Les aires expérimentales obtenues dans un réseau de molécules jointives sont rassemtilées dans le tableau 1.4 et comparées à celles calculées.au départ du modèle spatial de la valinomycine.
'>2 Aire par molécule en A
K Val-K
Pression de collapse à interface 185 - 190 160 air-eau
Modèle spatial 170 - 175 150
TabZe.au 1.4. l/aZAnomycine - VaAornetneA moZéculaZne.!>
En présence d'ions K dans le support, la valeur de l'aire occupée par
®
2
®2
molécule dans le film jointif est de 160 A contre 185 à 190 A en absence de K^. D'autre part, cet effet est spécifique de l'ion potassium, aucun change
ment n'est observé en présence de sod.um. La différence dans la valeur de l'aire peut être interprétée comme résultant d'un changement conformationnel lors de la réaction de complexion :
valinomycine + ^ valinomycine.K^
Les mesures de potentiel de surface permettent de confirmer ces hypothèses. Une étude par rayons X a d'ailleurs permis de montrer que la valinomycine non comple-
O
xée occupait à l'interface une aire par molécule de 20 à 25 A plus grande que la valinomycine complexée. L'ensemble de ces résultats permet donc de montrer la formation à l'interface d'un complexe valinomycine.K^ d'une assez grande spécifi
cité .
Plusieurs travaux ont été consacrés, ces dernières années, à l'étude des mo
difications de perméabilité de la membrane cellulaire sous l'effet de divers iono- phores du type de la valinomycine. Ces études ont été menées à bien tant au niveau de modèles membranaires qu'au niveau de membranes biologiques (42-45). L'hypothè
se avancée dans le cas de la valinomycine est que la réaction de complexion avec l'ion s'effectue à la surface de la membrane. Le passage à travers le corps hydrocarboné de cette dernière est ensuite rendu possible grâce à la modification conformationnelle intervenue : les groupements non polaires, situés à la périphé
rie de la molécule, protègent l'ion de tout contact avec ce milieu.
Le mécanisme de transfert ionique proprement dit a été beaucoup étudié au niveau de membranes-modèles. Ces dernières sont constituées de deux couches mono-
O moléculaires de phospholipides, accolées, formant un double feuillet de 40 à 50 A d'épaisseur, séparant deux phases aqueuses (figure 1.15).
QQQQQOÇÇÇÇÇ
^ C-LouincA \
ÔÔOÔOÔOÔôSo—>
FXguAe 1.15. Schéma, dz ta mzmbfLonz btotogtquz [modétz dz VantzltÂ, Vav4>on]
Les diagrammes courant-tension ont été utilisés pour calculer la valeur de la conductivité de ces modèles en présence et en absence d'antibiotiques (46, 47).
Pour autant que des ions K soient présents dans le support aqueux, la présence de l'antibiotique entraîne une augmentation de conductance mettant en évidence une augmentation de la perméabilité ionique. Gotlib (48) a montré que la valeur de la conductance de bicouches lipidiques augmentait de 10 à 15%, pour une con
centration en valinomycine de 10 ^ g/ml. D'autre part, pour une concentration donnée en valinomycine, l'augmentation de conductance est fonction directe de la concentration en KCldu support (47).
Une autre hypothèse, rendant compte du transport ionique, a été proposée en 1969 par Wipf et ses collaborateurs (49). Selon ces auteurs, il y aurait un échange de ligands pendant le parcours dans la phase hydrocarbonée, par une sorte
"d'effet relais": l'ion passerait d'un ligand à l'autre. Une certaine quantité d'antibiotique serait figée dans la membrane elle-même (figure 1.16),
solution membrane solution
Q: antibiotique non complexé • ; ion (£)-, antibiotique complexé
FXguÆe /,/é, Tn.oÂj>.moddÀ du tfiamizAt .ioyiique. poA lu antlblotlqau au tAavuu, de. la mmb^ane..
Dernièrement, Ovchinnikov et son équipe (50) ont montré que la valinomycine peut former avec l'ion un complexe 2-1, moins stable que le complexe 1-1, tou
jours envisagé. L'ion serait pris en "sandwich" entre deux molécules d'anti
biotique (figure 1.17),
V-LQvJiz 1.1?. a) SfiacXu/LQ, po66Zbie, du complexe (voLcnomcfCA-n^j b) StAactu/LZ du compleLXd vaLinomi/cUm.K^
La plupart des expériences décrites ci-dessus ont cependant été menées au moyen de modèles membranaires constitués de lipides neutres. Or, parmi les facteurs à prendre en considération dans le transport ionique, la densité de charge membranaire ainsi que la concentration en espèces chargées au voisinage de l'interface membrane-eau revêtent une grande importance (51-54). Divers au
teurs se sont attachés à l'étude du comportement de la valinomycine ou d'autres antibiotiques du même type au sein de membranes phospholipidiques constituées de lipides chargés. Il a été démontré que la conductance de ces systèmes aug
mentait avec la densité de charge négative du double feuillet lipidique (51).
Ces résultats ont quelquefois été mis en corrélation avec la théorie de Gouy- Chapman, régissant la distribution des espèces ioniques dans la phase aqueuse adjacente à la double couche lipidique. Peu de travaux abordent cependant ce problème de manière systématique. Notre travail, précisément, se propos^ avant d'aborder le modèle de la double couche lipidique, d'établir >le rôle joué par la densité de charge sur la réaction de complexion au moyen du modèle de la couche monomoléculaire étalée à l'interface air-eau.
TECHNIQUES EXPERIMENTALES
2.1, SUBSTANCES EMPLOYEES
La gramicidine S a été fournie par la firme Mann Research Laboratories, la gramicidine A par la Nutritional Biochemical Corporation (composition : 72 % en gramicidine A, 9 % en gramicidine B, 19 % en gramicidine C) et la valinomycine par la Sigma Chemical Co. L'antamanide a été synthétisé par le docteur Birr du Max Planck Institute (Heidelberg) qui nous en a aimable
ment fourni un échantillon. Les analogues ionisables de la valinomycine ont été synthétisés par l'équipe du professeur Ovchinnikov, de l'Institut
Schemyakin de Moscou. Le docteur V.T. Ivanov, vice-directeur de l'Institut, a bien voulu nous faire présent d'un échantillon de chacun des deux analo
gues ainsi préparés. Dans l'un de ceüx-ci, un résidu valyl est remplacé par un résidu glutamyl et dans l'autre par un résidu lysyl,
La lécithine de blanc d'oeuf, l'acide palmitique et le glycerol monoole- ate sont des produits.. Sigma Chemical Co. La phosphatidyl serine et la DL-a- dipalmitoyl phosphatidyl choline ont été fournies par la firme Mann Research Laboratories, Le premier de ces deux phospholipides possède une charge néga
tive résultante entre pH 6 et 8, tandis que le second en est dépourvu (formu
les ci-dessous).
R. -
- C II O
- O - CH
I
- O - CH
I
CH
0 II O - P 1 0 (-)
.0 O - CH„ - CH - C
2 I \ (coô; NH, OH (h
?ho6pk(vtLdyl
R. - O
II
c
- O - CH.R., - - O - CH,
CH„ - O - P I O (-)
-O - CH„ - CH^ - N(CH3>3
VL~ar cUpaùnitoyZ pho^phcLtcdyl choLcm
'i
Les films constitués d'antibiotiques ou les films mixtes antibiotique- lipide sont étalés sur des supports aqueux contenant, le cas échéant, un élec
trolyte tel que NaCl ou KCl, ou sur des solutions tampons de pH déterminé.
La mesure de ce dernier est effectuée sur un appareil de type Radiometer à + 0,05 unités près. Le solvant.d'étalement est le chloroforme. L'eau du support est obtenue par double distillation de l'eau distillée. L'étale
ment est réalisé au moyen d'une microseringue Agla.
2.2. METHODES DE MESURE ET APPAREILLAGE
2.2.1. Pression superficielle
La pression superficielle constitue une des méthodes les plus couramment utilisées dans l'étude des propriétés des couches monomoléculai
res. Dans le domaine des hautes concentrations superficielles (supérieures
2
au mg de matière par m ), les isothermes de pression superficielle sont re
levés par la méthode de la plaque immergée de Wilhelmy, reliée à une élec
tro-balance Cahn RG sensible au 1/lOOe de dyne/cm. Les mesures sont réali
sées par compression : le film est étalé à l'intérieur d'un cadre en mica paraffiné; la concentration superficielle est modifiée par compression du film à l'aide d'un piston. L'appareil autorise, la mesure de pressions super
ficielles de plusieurs dynes/cm et permet l'accès à la valeur de la pression correspondant à la formation d'un réseau de molécules jointives. Dans le do
maine des faibles concentrations superficielles (inférieures au mg de matière par m ), les mesures de pression superficielle sont effectuées à l'aide du micromanomètre à fil tendu de J.Guastalla (55). Les modifications apportées à cet appareillage ont été signalées dans des travaux antérieurs (56). Le principe réside dans la séparation de la surface du support en deux compar
timents , par une barrière mobile.. La solution contenant la substance à étu
dier est étalée dans un compartiment,.le solvant dans l'autre. La pression superficielle du soluté est donc proportionnelle aux déplacements de la bar
rière mobile sur la surface. Cet appareil permet de mesurer des pressions superficielles de l'ordre du centième de dyne/cm.
2.2.2. Potentiel de surface
Les mesures de potentiel de surface (figure 2.1) sont réalisées par la méthode de l'électrode vibrante (57,58). Le principe repose sur le
fait que lorsqu'il existe une différence de potentiel entre la surface du liquide et celle de l'électrode (D), vibrant perpendiculairement au dessus de cette surface, il.se crée un condensateur variable dont la modification de capacité donne naissance., à un courant sinusoïdal dans un circuit exté
rieur (E,F,G)., directement proportionnel à la différence de potentiel exis-
La mesure de ce dernier est effectuée sur un appareil de type Radiometer à + 0,05 unités près. Le solvant.d'étalement est le chloroforme. L'eau du support est obtenue par double distillation de l'eau distillée. L'étale
ment est réalisé au moyen d'une microseringue Agla.
2.2, METHODES DE MESURE ET APPAREILLAGE
2.2.1. Pression superficielle
La pression superficielle, constitue une des méthodes les plus couramment utilisées dans l'étude des propriétés des couches monomoléculai
res. Dans le domaine .-des hautes concentrations superficielles (supérieures
2
au mg de matière par m ), les isothermes de pression superficielle sont re
levés par la méthode de la plaque immergée de Wilhelmy, reliée à une élec
tro-balance Cahn RG sensible au 1/lOOe de dyne/cm. Les mesures sont réali
sées par compression : le film est étalé à l'intérieur d'un cadre en mica paraffiné; la concentration superficielle est modifiée par compression du film à l'aide d'un piston. L'appareil autorise.la mesure de pressions super
ficielles de plusieurs dynes/cm et permet l'accès à la valeur de la pression correspondant à la formation d'un réseau de molécules jointives. Dans le do
maine des faibles concentrations superficielles (inférieures au mg de matière
2
par m ), les mesures de pression superficielle sont effectuées à l'aide du micromanomètre à fil tendu de J.Guastalla (55). Les modifications apportées à cet appareillage ont été signalées dans des travaux antérieurs (56), Le principe réside dans la séparation de la surface du support en deux compar
timents, par une barrière mobile.. La solution contenant la substance à étu
dier est étalée dans un compartiment, le solvant dans l'autre, La pression superficielle du soluté est donc proportionnelle aux déplacements de la bar
rière mobile sur la surface.. Cet appareil permet de mesurer des pressions superficielles de l'ordre du centième de dyne/cm.
2.2.2. Potentiel de surface
Les mesures de potentiel de siarface (figure 2.1) sont réalisées par la méthode de l'électrode vibrante (57,58) . Le principe repose sur le fait que lorsqu'il existe une différence de potentiel entre la surface du liquide et celle de l'électrode (D) , vibrant perpendiculairement au dessus de cette surface, il.se crée un condensateur variable dont la modification de capacité donne naissance à un courant sinusoïdal dans un circuit exté
rieur (E,F,G)., directement proportionnel à la différence de potentiel exis-
tant entre les armatures. L'annulation de ce courant est obtenue par l'imposition d'un potentiel antagoniste au moyen d'un potentiomètre (H) incorporé dans le circuit et relié à une électrode d'argent (J) plon
geant dans la solution. L'ensemble du phénomène peut être suivi sûr un oscilloscope (G) par l'intermédiaire d'un dispositif d'amplification sélective du signal (E,F). La différence entre les valeurs du potentiel antagoniste requises pour obtenir l'annulation du courant, en présence et en absence d'une couche monomoléculaire étalée sur la surface liquide, fournit la valeur AV du potentiel de surface de la couche. L'électrode
(D) est en acier inoxydable. La précision de la mesure peut être estimée à + 2 mV.
fÂjQVLfUL 2.1. Schéma de ia mcàvJui dix. potentlet de &u/L^ace
2.2.3. Echange Isotopique
Les échantillons que l'on désire étudier par cette méthode sont marqués réversiblement au tritium de la manière suivante : l'antibio
tique (environ 2 mg). est dissous dans 0,25 cc d'un mélange acide dichloro- acétique et eau tritiée (v/v 40/1) d'activité spécifique 10 curie/ml, four
nie pa-r le Centre d'Energie Nucléaire de Mol. Dans ce solvant "rupteur de liens hydrogène", l'échange hydrogène-tritium est nettement facilité. Cet échange NH NT se poursuit pendant quelques jours. L'addition à la solu
tion de 24,75 cc de chloroforme (solvant favorisant la formation de liens hydrogène intramoléculairesj permet ensuite de "stabiliser" le tritium in-
cubé. La solution peut alors être utilisée pour l'étalement de l'anti
biotique à l'interface air-eau. La concentration superficielle de celui- ci est maintenue constante à environ 1 mg/m^.
Immédiatement après étalement, l'échantillon est placé sous le dé
tecteur. Le tritium libre migre dans le support où son rayonnement 6 de faible énergie n'influence pas le comptage en surface. La linéarité de l'activité isotopique superficielle en fonction de la concentration super
ficielle est vérifiée auparavant avec une substance étalon.
Lorsque la molécule étalée adopte une conformation au sein de la
quelle les liens H disparaissent, le compteur enregistre une nette dé
croissance de la radioactivité superficielle. Par contre, si elle se trouve dans une conformation au sein de laquelle les liens H sont mainte
nus, la radioactivité doit rester sensiblement constante au cours du temps.
La figure 2.2. présente le dispositif de comptage (59).
VL
qo/
ul2.2. de comptage da tAtttum à £'tnteA-^^acc
Un cylindre métallique (A) est traversé par une réglette coulissante (B) dans laquelle est encastrée la cuvette en teflon (C) de 10 cm de surface,
2
contenant le support de la couche étalée (D) . La géométrie intérieure du cylindre est telle que le détecteur (E) est placé à une distance reproduc-
