Disponible à / Available at permalink :

Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Wikler, M. M. (1965). Modifications physiques et chimiques du lysozyme (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/215361/1/edfe453d-1e29-411d-a571-2062815a0efb.txt

(English version below)

Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université ([email protected]).

Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.

DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :

Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités; L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué; Le contenu ne soit pas modifié.

L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.

--- English Version ---

This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University ([email protected]).

If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.

DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights. Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:

The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;

The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated; The content is not changed in any way.

It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.

BIBLIOTHtlUJE flf

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Service de Chimie Générale I

Modifications physiques

et chimiques du lysozyme

Thèse présentée pour l'obtention du titre

de Docteur en Sciences Chimiques

BIBLIOTHEQUE DE CHIMIE

DE BRUXELLES

Service de Chimie Générale I

H. XÜ.iKLBd

ÔLA'i-t-klc ’

fj2.

^ ^ - Co2^ Oo'hy0^'<kit- yO-^ CuhJ'

ve-0

»

Maurice WIKLER

Que Mademoiselle le Professeur L. de BROUCKERE veuille bien accepter l'expression de notre respectueuse reconnaissance. Le fruit de son précieux enseignement nous a donn? goût à la Chimie Physique; par la suite elle n'a cess^ de nous prodiguer ses encouragments dans la voie que nous avons choisie.

Le Professeur J. LEONIS a présidé à notre formation de cher­ cheur et a bien voulu nous faire b^n^ficier de toute son expérience en nous guidant dans l'élaboration de cette thèse. Nous tenons à l'en remercier et à lui expriiTier notre gratitude pour l'appui moral que ses critiques et ses con­ seils ont été pour nous.

Nous remercions vivement le Professeur R. DESCAMPS qui nous accueillit dans son service, nous permettant ainsi de trouver l'aide maté­ rielle sans laquelle ce travail n'aurait pu être mené à bien. Nous garderons de cette période un souvenir que la gentillesse et la compréhension du Profes­ seur R. DLSCAMPS a su rendre particulièrement agréable.

Une partie de nos recherches a ét^ effectuée dans le labora­ toire du Professeur P.E. GREGOIRE que nous remercions très sincèrement pour l'hospitalit^ qu'il nous a accordée et pour l'intérêt qu'il a marqué à ce travail.

Nous avons bénéficié enfin, dans le laboratoire de Médecine Nucléaire des conditions matérielles qui nous ont pennis de mener a son terme la présente recherche. Nous en remercions bien sincèrement la Faculté de Médecine en les personnes du Professeur A.M. ERI-IANS et du Docteur J.E. DUMONT qui ont pu créer et maintenir dans ce laboratoire un climat de travail très favorable.

Nous avons trouvé au sein de l'équipe qu'anime le Professeur J.LEONIS, un esprit de camaraderie qui s'est exprimé dans les discussions et les critiques franches et toujours constructives. C'est à ce titre que les Docteurs L. KANAREK, A.G. SCHNEK et F.C. STEVENS ont droit à notre gratitude.

Les figures qui illustrent le texte sont dues au talent et au dévouement de Monsieur J, VAN DEH BORRE que nous remercions très vivement.

O O

O

1

pages

Introduction. 2

Résumé. 8

PARTIE I

Etude d'altérations permanentes induites dans la confi­ guration spatiale du lysozyme.

Introduction. ü

Chapitre I ; Equilibres acido-basiques des lysozymes al- ^5 térés.

Chapitre II : Etude de l'hydrolyse trypsique des lyso- mes altérés.

PARTIE II

Modifications chimique et enzymatique du lysozyme.

Introduction. 75

Chapitre III ; Recherche d'une activité enzymatique dans les hydrolysats trypsiques du lysozyme.

Chapitre IV î Modification chimique des groupes fonc- 90

tionnels du lysozyme.

Conclusions générales. 120

Annexe. 1^2

TABLE LES MATIERES.

Bibliographie.

2.

INTRODUCTION.

L’objectif majeur dans l’interprétation des mécanismes chimi-- ques est la représentation tri-dimensionnelle complète du proces­ sus réactionnel. Ceci nécessite une connaissance approfondie, non seulement des structures du substrat et de l’enzyme, mais aussi de la manière dont l’enzyme provoque la modification du substrat, donc, de la géométrie précise des états transitoires.

Toutefois, il n’est pas physiquement possible d’isoler un état de transition. Ses caractéristiques doivent être déduites des pro­ priétés physiques et chimiques des molécules stables.

Etant donné la complexité des processus biologiques, l'objec­ tif immédiat des études ne peut cependant être que limité. L'iden­ tification des acides aminés responsables de la spécificité de l’enzjrme, leur arrangement relatif dans l’espace, l'analyse des cinétiques enzjrmatiques sont des problèmes qui doivent avant tout recevoir une réponse. Ces données n’ont néanmoins pu acquérir leur pleine signification que grâce au concept du "centre actif"

3

4 A la suite des brillants travaux de Sanger sur la structure de l’insuline (1951-1955), de nombreuses équipes entreprirent avec succès l’analyse séquentielle des protéines. C’est ainsi que l'on connaît actuellement la structure d’un certain nombre d’entre-elles, dont la ribonucléase (Hirs _et I960; Spackman £t I960), le lysozyme (Jollès ejb 1963; Canfield, 1963), l’hémoglobine humaine (Braunitzer et al, 1961; Konigsberg et Hill, 1962; Goldstein et al, 1963) et l’hémoglobine fétale (Schroeder e_t ad., 1961). l’élucida­ tion de la séquence complète des amino-acides de plusieurs protéines de masse molaire élevée, est actuellement en voie d’achèvement

(chymotrypsine, cytochrome c, trypsinogène).

L’automatisation (Spackman, Stein et Moore, 1958) et le perfection­ nement des méthodes d’analyse permettent d'obtenir des résultats dans des délais de plus en plus courts.

Quoique la structure covalente d’un grand nombre de protéines ait été élucidée, les études concernant leur organisation spatiale n’ont pas progressé au même rythme. En fait, une réponse détaillée a\mc questions que pose l’organisation spatiale d'une protéine n’a encore été obtenui/^pour peu d'entre elles. La subdivision de l'or­ ganisation spatiale par Linderstr)î^m-Lang (19^2 a)en deux niveaux structuraux (structures secondaire et tertiaire) a sans doute con­ tribué à clarifier le problème, tout en le schématisant un peu ar­ bitrairement. Dans certains cas, un niveau supplémentaire doit être considéré (structure quaternaire Bernai, 1958); 1'organisation sy­ métrique des quatre sous-unités de l'hémoglobine dans un tétraèdre, en est un exemple typique (Perutz _et I960).

Aucune méthode d’étude des macromolécules en solution n'est

5

Le succès des études structurales directes a eu pour conséquence un renouveau d'intérêt, qui s'est étendu à d'autres propriétés de protéines cristallines. En particulier, ces travaiox ont démontré que le comportement chimique de la protéine à l'état cristallin peut être étudié de la même façon que son comportement en solution

(Richards, 1963; Rupley, 1964).

Mais, étant donné que les protéines et les acides nucléiques remplissent généralement leurs fonctions biologiques.en solution aqueuse ou sous forme de gels hydratés, c'est dans les milieux

aqueiix qu'il convient particulièrement d'étudier leur configuration. Pour cela, il est nécessaire de faire appel à un grand nombre de méthodes de caractère physico-chimique. De plus, ces méthodes doi­ vent être utilisées dans des conditions expérimentales suffisamment variées, et ce n'est qu'en confrontant les données ainsi obtenues que l'on peut espérer arriver à une solution.

Dans l'ensemble des travaux consacrés aux propriétés physico­ chimiques et enzymatiques du lysozyme, il nous a paru intéressant d'apporter une contribution à l'étude des fondements structuraux de son activité biologique. Effectivement, au stade actuel de nos connaissances, le lysozyme convient particulièrement bien à ce type d'étude.

Cet enzyme de masse molaire relativement peu élevée (14300), est facilement isolé à partir du blanc d'oeuf de poule (Alderton e_t 1945). Sa structure primaire a été complètement déterminée (Canfield, 1963; Jollès e_t 1963); la structure à l'état cristal­ lin est maintenant également connue (Blake et 1965). Les quatre ponts disulfures, qui établissent des jonctions entre les différentes parties de la chaîne polypeptidique, ont récemment pu être localisés (Jollès £t 1964; Canfield et Liu, 1965). D'autre part, les struc­ tures chimiques de lysozymes extraits d'espèces animales différentes, ou d'organes différents d'un même animal, furent comparées par Jollès £t (1959). Bien qu'ayant la mêm,e activité biologique, ces enzymes

6

Les études tridimensionnelles du lysozyme ont fourni des rensei­ gnements précieux sur la structure spatiale de la molécule et ses rapports avec l’activité enzymatique (Blake e_t al; Stanford et al; Lickerson _et £l, 1962; Blake ejb 1965; Jonson et Phillips, 1965).

Diverses techniques ont permis de caractériser la configuration de la protéine en solution, ainsi que ses changements sous l'effet des agents physiques et chimiques (voir Hamagushi 1963-1964,

Sophianopoulos 1962-1964). On notera particulièrement que, ni la structure de la molécule, fort compacte d'ailleurs, ni son activité biologique, ne sont affectées par des variations de pH allant de 2,8 à 11,8 (Edelhoch et Steiner, 1962). Confirmant l'extraordinaire stabilité de la structure secondaire du lysozyme, Kanarek (1962) et Léonis (1961) mirent en évidence le rôle fondamental des interac­ tions hydrophobes dans sa structure tertiaire.

Tout récemment, des précisions ont été apportées quant à l'impor­ tance relative des divers types de liaisons (interactions hydropho­ bes, interactions électrostatiques et liaisons hydrogènes) qui con­ tribuent au maintien de la structure de la protéine en solution (Barel et léonis, 1964).

7

et même les peptides obtenus par la technique de "fingerprinting", (Goldberger et Epstein, 1963). Ces résultats suggèrent que la sé­ quence des amino-acides du lysozyme représente une information suf­ fisante pour l’organisation correcte des structures secondaire et tertiaire de la molécule.

Nous ne pouvons pas clore cet aperçu sans rappeler les travaux que Praenkel-Conrat (1950) entreprit en vue d’identifier les groupes fonctionnels essentiels à l’activité biologique du lysozyme.

8

RESUME .

Parmi les diverses manières d'approcher le problème des fonde­ ments structuraux de l'activité du lysozyme, nous en avons sélec­ tionné quelques-unes. Ce travail sera orienté vers l'étude de modi­ fications apportées à la structure de la protéine, sous l'effet d'agents soit physiques, soit chimiques.

Les altérations dans les caractéristiques moléculaires et biolo­ giques du lysozyme, provoquées thermiquement ou par des moyens chimiques, ont été étudiées par diverses techniques expérimentales.

l'analyse des courbes de titration acido-basique d'échantillons préalablement soumis à l'effet de la température, révèle l'existence d'une série de formes moléculaires stables résultant du prétraite­ ment. En particulier, les paramètres caractérisant la titration de groupes carboxyles du lysozyme ont été évalués. Ils subissent dans nos conditions expérimentales des influences com.plexes rendant leur interprétation difficile.

la cinétique de la protéolyse du lysozyme préchauffé, ou encore traité au préalable à l'urée ou au chlorure de guanidinium, nous a permis d'obtenir des informations sur la nature des liaisons fragi­ les affectées par le dénaturant. Le mode d'action de ces agents pour­ rait dans certaines conditions être semblable. Ils altèrent alors irréversiblement les interactions hydrophobes tout en maintenant la presque totalité de la structure secondaire. D'autre part, le rôle prépondérant des interactions hydrophobes dans la protection du lysozyme contre l'attaque enzymatique est mis en évidence.

9.

aspect distinct de la structure moléculaire de la protéine. A partir des hydrolysats trypsiques du lysozyme natif, nous avons pu isoler des fractions modifiées ayant gardé encore une activité biologique. Il semble que dans la protéine native, deux à trois liaisons peptidiques peuvent être ouvertes sans altérer complètement son action bactériolytique.

La substitution et l'inactivation par des réactifs chimiques furent étudiées cinétiquement; la chromatographie fut utilisée pour le fractionnement des dérivés substitués, l'étude comparative des modifications chimiques à permis de dénombrer,et même de localiser partiellement, les groupes aminés qui sont très accessibles aux réactifs et ne paraissent pas indispensables à l'activité biologi­ que. L'autre part, l'inactivation par substitution chimique des groupes basiques semble étroitement liée aux modifications qui en résultent, dans l'enzjrme, au niveau tertiaire. la moindre accessi­ bilité de certains groupes aminés aux réactifs utilisés fut mise en

10

PARTIE I

ETTOE D’ALTERATIONS PERMNENTES INDinTES_MNS_M_COOTIGURATOT SPATIALE LU LYSOZYÎ'^.

CHAPITRE I - Equilibres acido-basiques des lysozymes altérés.

11.

INTRODUCTION

Afin de préciser davcnt'^ge l'interdépendance des divers niveaux structuraux dans la macromolécule, et de déterminer les rapports entre l'activité biologique et la configuration moléculaire, nous avons provoqué dans la niolécule du lysozyme des modifications struc­ turales permanentes au moyen d'agents physiques et chimiques. Notre intérêt s'est porté sur les modifications n'ayant pas entraîné la perte de l'activité biologique de l'enzyme.

Il est nécessaire de se souvenir, que la réversibilité de la perte d'une propriété moléculaire est principalement une question de technique expérimentale, ou un fait de circonstances ; lorsque les solutions aqueuses du lysozyme sont soumises pendant quelques heures à une température unifornie, dans l'intervalle de 50 à 90° C

environ, la protéine subit des altérations structurales irréversi­ bles. Des recherches récentes ont montré que ces altérations concer­ nent notamment le pouvoir rotatoire (Kanarek, 1962), ainsi que le taux et la vitesse des échanges hydrogène-deuterium (Kanarek ejt al. 1961 et 1962).

les techniques utilisées m_irent en évidence un grand nombre d'al­ térations irréversibles que peut subir la configuration du lysoz3nîie. Selon le traitement, ces altérations portent aussi bien sur la

12.

Dans l'ensemble, ces résultats montrent que les divers niveaux structuraux de la molécule du lysozyme jouissent d'une certaine in­ dépendance mutuelle. Mettant l'accent sur la complexité du proces­ sus de dénaturation, Kanarek (1962) distingue cependant deux ou trois étapes essentielles, chacune pouvant à son tour être subdivi­ sée en un grand nombre de stades assez proches, les uns réversibles les autres non. La grande importance de la structure tertiaire du lysozym.e et son rôle dans l'activité enzymatique, ont déjà été si­ gnalés par Léonis (1956, 1959). La stabilité de cette structure est assurée essentiellement par des liaisons du type hydrophobe. Il semble que, l'intégrité d'une partie au moins de ces liaisons soit indispensable à l'activité bactériolytique de l'enzym.e

(Kanarek, 1962).

13

PARTIE I

ETUDE D'ALTERATIONS PERI-IAKBETES INDUITES PARS LA COWEIGURATION SPATIALE DU LYSOZ™.

Introduction,

Chapitre I î Equilihres acido-basiques des lysozymes altérés.

A. Partie expérimentale.

1. Préparations utilisées. 2. Appareils.

3. Description de la méthode de titration. 4. Calcul de la courbe de titration à partir

des données expérimentales. 5. Représentations graphiques.

6. Comptage des groupements carboxyles titrés. 7. L’équation de Linderstr;^m-Lang,

8. Application de la relation de Linderstr/m-Lang au lysozyme.

B, Résultats et discussion.

1. Titration du lysozyme natif i comparaison d'échan­ tillons d'origines diverses.

a) Stoechiométrie

b) Le facteur d'interaction électrostatique c) pK intrinsèque.

2. Titration de lysozymes altérés par la chaleur. a) Stoechiométrie

b) Le facteur d'interaction électrostatique c) pK intrinsèque.

14.

Les courbes de titration des protéines sont susceptibles d’appor­ ter des renseignements précieux concernant la configuration des mo­ lécules en solution. Sous l'impulsion des travaux de Linderstr;?(m- Lang (1924), des progrès considérables ont été effectués dans la compréhension des équilibres acido-basiques des macromolécules. Les bases théoriques des équilibres ioniques, ainsi que l'interprétation mathématique des résultats ont été clairement revues par Steinhart et Zaiser (1955 ), Tanford (1962) et Steinhardt et Beychok (1964). Plus particulièrement, le comportement acido-basique du lysozym.e a fait l'objet de diverses recherches. Les anomalies, affectant la courbe de titration du lysozyme dans la région des groupes carboxy- liques et des groupes tyrosyles, ont été décelées par Tanford et Wagner (1954). Les pK des 9 groupes carboxyles titrables dans la

protéine native, peuvent être subdivisés en deux classes distinctes. Beychok et Warner (1959) ont pu déterminer que la moitié des groupes carboxyles ont un de 5,1» Le P^int autres groupes est in­ férieur à cette valeur et serait égal à 3,5.

La courbe de titration du lysozyme dans le chlorure de guanidinium 8 M fait apparaître trois groupes acides supplémentaires titrables (Lonovan ejt al, i960, 1961). De plus les 12 groupes s'ionisant en dessous de pH 6, présentent dans le chlorure de guanidinium une va­ leur de normale et s'avèrent être des groupes carboxyles. D'autre part, les interactions internes rompues sous l'action du chlorure de guanidinium et rendant les groupes carboxyles normaux, peuvent être restaurées réversiblem.ent par dialyse de l'agent déna­ turant .

Il nous a semblé intéressant d'étudier les altérations provoquées sur le lysozyme par la chaleur, au moyen de la méthode de titration. Etant donné le comportement tout particulier des groupes carboxyliques

15

A. PARTIE EXPERiœRTALE.

1. Préparations utilisées.

Lysozyme ; deux préparations commerciales de lysozyme de blanc d'oeuf de poule ont été utilisées.

a) Lysozyme Sigm.a trois fois cristallisé, lot L59-057. b) Lysozyme Worthington deux fois cristallisé, lot Ly 591. Ces préparations ont été utilisées sans autre purification.

Leur pureté chromâtographique a été démontrée (Kanarek et Godfrine, 1959).

Pour permettre la préparation de solutions de composition ioni­ que bien déterminée, les échantillons de lysozyme ont été préalable­ ment dessalés par la résine "Amberlite Î.CB 3". Le procédé de dessa­ lage a été décrit par Kanarek et Godfrine (1959).

(ï ) Lysozymes altérés par la chaleur ^

Des solutions h 2 fô de lysozyme et 0,1 ¥ en KCl furent soumises à un chauffage à diverses températures entre 45° et 89° C. Après ajustement du pH les solutions furent placées en tubes scellés et imm.ergés dans un bain d'eau à la température voulue. Après une du­ rée de 4 heures, la température du bain fut ramenée lentement à la température ordinaire. La protéine fut ensuite séchée par lyophili­ sation de la solution, sans m.odification ni du pH ni de la force ionique.

16

Autres produits et réactifs ; tous sont de pureté analytique.

Solutions : des solutions à 1 ^ en lysozyme ont été préparées par pesée et leur concentration exacte déterminée par mesure de la densité optique à 282 nm. la valeur de la densité optique à cette longueur d’onde et sous 1 cm d'épaisseur est de 2,6 pour une solution contenant 1 mg/ml de lysozyme (Fromageot et Schnek, 1950). Cette valeur a été confirmée par Kanarek (1962) sur les

préparations utilisées.

Afin de réaliser des solutions de lysozyme de composition ionique identique nous avons préparé les solvants suivants

a) *CaCl2 0,05 M : destiné à recevoir la protéine chauffée en présence de KOI 0,1 M.

b) *CaCl2 0,05 M + KOI 0,025 M ; solvant du lysozyme natif. Tam-pons de référence ; préparés selon les indications de Bâtes

(1964). Tampon pH à 25 tetraoxalate 1,68 phtalate 4,01 phosphate 6,86 borax 9,18 2. Appareils.

la cellule de titration utilisée se compose de deiix compar­ timents assemblés au moyen de rodages normalisés (fig. l). Ce système permet de séparer l'électrode de référence du milieu protéique. En effet, le précipité pouvant éventuellement se for­ mer au cours de la titration est une cause courante de blocage de la jonction de l'électrode.

17.

Le procédé de remplissage de la cellule est le suivant î

le compartiment A destiné à recevoir l’électrode au calomel est d'abord rempli avec une solution saturée en KCl. Cette solution s'écoule par un petit orifice percé dans le rodage. Il est donc nécessaire d’ajuster rapidement le compartiment complémentaire, tout en s’assurant qu’un mince film de solution a été emprisonné entre les parois des rodages. Ce film liquide a pour but d’établir la jonction entre les électrodes. Le compartiment B contient

généralement 4 ml de solution à titrer.

L’électrode de verre (Radioraeter K 401) plonge dans le com- partim.ent B, où l’on adapte également l’aiguille de la seringue de précision (Agla) ainsi que l’arrivée du courant d’azote, La cellule toute entière est fixée aux électrodes au moyen de bouchons percés.

La therniostatisation de la cellule est réalisée dans un bain à 40° + 0,1° C. (voir note p. 16). Un agitateur magnétique, entraî­ ne simultanément deux barres aimentées, homogénéisant respecti­ vement l’eau du bain et la solution à titrer. Préalablement à la titration le pH-mètre (RADIOMETER TTTl) est étalonné à l’aide des tampons de référence.

3. Description de la méthode de titration.

La solution à titrer est amenée à un pH voisin de 3 (*) au moyen d’une solution d’HCl de volume négligeable. Lorsque l'équi­ libre ionique est atteint, on effectue la titration par du NaOH 0,1 M standardisé avec précision (Bâtes, 1964). La solution pro­ téique reçoit généralement des aliquotes de 10 à 20 microlitres de soude, débités par la seringue.

18.

Cette dernière est actionnée par une vis micrométrique. l’équili­ bre de l'électrode est habituellement atteint après quelques minutes d’agitation de la solution.

le pH indiqué est lu à 2/100 d’unité et un nouvel aliquote de soude peut alors être additionné. Généralement, nous avons titré 20 mg de protéine dissoute dans 4 ml de solvant adéquat. le blanc est constitué d'un volum.e identique de solvant, titré en l'absence de la protéine.

4. Calcul de la courbe de titration à partir des données expéri­ mentales .

Nous résumons ici la méthode générale de calcul des ions dissociés de la protéine. On détermine le pH de la solution. Une quantité connue des ions hydroxyles est additionnée; la nou­ velle valeur de pH est relevée. Lors d'une expérience indépendante, on déterm.ine la quantité de base nécessaire à amener au m.ême pH final, force ionique, volume, etc., une solution ayant des para- m.ètres identiques mais ne contenant pas la protéine. A chaque valeur de pH, on soustrait alors la quantité d'ions OH ~ néces­ saire à titrer le solvant, de la quantité des ions nécessaires à titrer la solution de la protéine, le résultat obtenu représente la quantité d'ions hydrogène dissociés de la protéine.

le tracé de cette quantité en fonction du pH final, repré­ sente la courbe de titration recherchée.

19.

5. Représentations graphiques.

a) Un point de référence peut être arbitrairement choisi .sur la courbe de titration. Au cours de nos mesures, il s’avéra que les échantillons titrés diffèrent principalement dans leur bran­ che acide. La branche basique est quasi identique d'un échantillon à l’autre. Nous avons donc fait passer les courbes de titration par un point commun choisi à pH 8,

Les résultats sont exprimés en moles d'ions hydrogène dis­ sociés par mole de protéine. La masse molaire du lysozyme est égale à 14600, C’est la valeur publiée par Jollès et (i960) à l’époque de ces mesures. La représentation graphique décrite a une portée limitée. Elle permet essentiellement de comparer la branche acide des différents échantillons titrés (fig. 5 à 10)..

b) En vue d’interpréter les courbes de titration en termes de types de groupes ionisables nous avons adopté la représentation graphique préconisée par Tanford (1955). Le nombre de moles d'ions hydrogène dissociés de la protéine (r), est porté en fonction du pH. Si l’on admet qu’à pH 2 et en dessous de cette valeur, les protons ne sont plus susceptibles de se dissocier de la protéine, la valeur de r sera égale à 0, à ce pH. Les difficultés expéri­ mentales ne permettent généralement pas d’effectuer des mesiires en dessous de pH 3. Les points relevés aux environs de ce pH sont entachés de larges erreurs.

Fig 1-2

Courbes de titration calculées à 40°C a partir de l'équation (1) a) 1 groupe 7,26)

b) 1 groupe imidazole (pK 6.44)

20.

6. Comptage des groupes carboxyliques titrés.

Les informations les plus directes apportées par les courbes de titration proviennent du comptage du nombre de groupes titrés. Le procédé convient particulièrement dans le cas présent. Comme il avait été remarqué plus haut, les courbes de titration des échan­ tillons altérés, se différencient dans la branche acide, les carac­ téristiques de l’unique résidu histidine et du groupe a-aminé, ne semblent pas avoir été modifiés au cours du traitement thermique de la protéine. A l'aide de la relation de Linderstr)?(m-Iang (voir paragraphe 7), on calcule les courbes de titration théoriques du groupe imidazole (histidine) et du groupe a-ai^iné (lysine N-ter­ minale). A 25° C, le pK de ces groupes dans le lysozyme est respec­ tivement égal à 6,8 et 7,8 (Tanford et Wagner, 1954). Ces valeurs ont subi des corrections pour une température de titration de 40° C

(Smith _et al., 1937). A cette température le pK du groupe imidazole est égal à 6,44; le pK du groupe a-aminé est ramené à la valeur 7,26. Les deux courbes théoriques sont sommées (fig. 1-2). La cour­ be résultante de l’équilibre ionique de 1’histidine et du groupe

a-aminé est déduite de la courbe expérimentale de la protéine ■(fig. 1-3). Le résultat de cette opération, détermine sur la courbe

expérimentale le début de la titration des groupes carboxyles. En effet, à partir du plateau qui en résulte, il est aisé de compter le nombre de groupes carboxyliques titrés dans la protéine. Le point final de la titration est évidemment représenté par le point extrapolé à pH 2.

7. L’équation de Linderstr^(m-Lang.

Fig 1-3

Coijrbe de titration du lysozyme Sigma à 40°C en solution KCl 0,025 M et CaCl2 0,05 M. Le plateau résulte de la soustraction entre pH 5

F

ig

21

Le pK intrinsèque 1® facteur électrostatique (w), des groupes de chaque classe, peuvent se calculer à partir de la relation classique de Linderstr/î^m-Lang :

log r.

+ 0,868 s? Z

₍

₁

₎

où n^^ est le nombre total de groupes dans la classe i

r^ = nombre de groupes ionisés à un pH donné provenant de la classe i de n groupes identiques,

Z = la charge nette de la molécule à ce pH.

étant un rapport de concentrations et non d’activités. ^i - r^

K. n’est donc pas une réelle constante thermodynamique. A une force ^ 61H0

ionique donnée ©s't la constante du i type de groupes io-nisables de la macromolécüle. l’équation implique donc que tous les groupes de type i sont identiques.

Le facteur d’interaction électrostatique w s’exprime par l’équation :

2

w = --- ^--- (1--- ) (2)

LRKT 1 + Ka

où e représente la charge unitaire de l’électron L la constante diélectrique du solvant

K la constante de Boltzman T la température

te paramètre de Debye-Hückel (qui est fonction de la force ionique)

R rayon de la sphère représentant la molécule protéique a rayon d’exclusion, c’est-à-dire la distance minimum d’ap­

22

Le facteur w peut être calculé à partir de la relation (2), si l'on connaît le rayon de la sphère représentant la molécule

protéique. On constate que w augmente lorsque le rayon de la sphère diminue, w augmente également lorsque la force ionique de la solu­ tion diminue.

En principe w est identique pour tous les groupes titrahles. Le facteur électrostatique subira toutefois des variations si les dimensions et la forme de la molécule évoluent en fonction du pH. Les groupes de même type n'ayant pas un environnement électri­ que identique, seront également caractérisés par un facteur w va­ riable. Ces situations peuvent être en pratique traduites par une valeur de "anormale". Ce dernier étant aisément calculable si le facteur électrostatique est maintenu constant.

8. Application de la relation de Linderstrg^m-Lang au lysozyme. Tanford et Wagner (1954) ont montré que les groupes carboxy- les du lysozyme ont une valeur w assez inattendue. Etant donné les tailles identiques du lysozyme et de la ribonucléase, la valeur prévue de w aux forces ioniques 0,03, 0,15 et 1,00 serait respec­ tivement 0,11, 0,08 et 0,05. Néanmoins, les courbes expérimentales donnent des valeurs bien plus élevées : 0,23, 0,175 et 0,11.

Fig 1-4

23.

Le calcul des interactions électrostatiques proposé par Tanford et Kirkwood nécessite cependant des données qui ne sont pas actuellement en notre possession. L'analyse requiert en effet, la localisation précise au sein de la protéine des groupes titra- bles. Bien que d'une portée approximative, la seule équation di­ rectement applicable aux courbes de titration reste donc celle de Linders tr^m-Lang.

Pour tout groupe titrable le procédé pratique d'application de l'équation (l) aux résultats expérimentaux est le suivant ;

on porte en graphique pH - log _{n - r} en fonction de Z. (fig, 4). A l'intersection de Z = 0 la courbe indique la valeur de

La valeur w est obtenue à partir de la pente de cette courbe. Si le point Z = 0 ne figure pas dans le domaine de titration du type de groupe considéré, on détermine par extrapolation de la courbe à la valeur Z = 0 (cf. Pig. 4).

Le tracé de la droite de régression de la variable

y = pH - Ig --- par rapport à la variable x = 2, est déterminé n - r

par la méthode des moindres carrés (voir p. ex. Cramer, 1946). Nous donnons ci-après les formules qui ont été utilisées pour le calcul du coefficient de régression b = w et de l'ordonnée à l'origine a = pK^ à Z = 0 de la droite de régression.

Ces formules correspondent à la régression utilisée générale­ ment de la variable y par rapport à la variable x, pour laquelle y représente la variable dépendante et x la variable indépendante.

où X est la moyenne arithmétique de n valeurs/et y la moyenne arithmétique de n valeurs de y.

r est le coefficient de corrélation que l'on calcule à l'aide de

la relation r “* r

Z xy - X ly r

24

Sx et Sy sont les écarts-types de x et de y. Sx et Sy dérivent respectivement de la dispersion des valeurs des variables x et y :

r 2 — 2, X - X Ix n S ly^ - y Ix n

A partir des relations indiquées il est aisé d’estimer l’écart moyen aa sur l’ordonnée à l’origine (a) ainsi que l’écart moyen ab sur le coefficient de régression (b)..:

nous déterminons premièrement la dispersion sur le droite de régression :

ôi

=ai

(1

-

p2)

^ O

l’écart moyen °a est alors oa = ' -V n-2 a

l’écart moyen ab est ab = ---S V n-2

X

Plusieurs critères permettent de tester la validité de ainsi obtenu. L’un des plus importants est la dépendance de la titration vis-à-vis de la force ionique. Théoriquement, ne serait que faiblement influencé par des variations de la concentra­ tion saline. Bien plus, les erreurs expérimentales excéderaient généralement cet effet.

les groupes carboxyliques du lysozyme furent titrés à trois forces ioniques différentes (Tanford, 1962). En appliquant la re­ lation (l) on constate une pente anormalement grande. D’autre part, à chaque valeur de force ionique une intersection différente est obtenue à Z = 0. Peu de signification est à attribuer au

ainsi extrapolé. En d’autres termes, la région des groupes carboxy­ liques n'obéit pas à l'équation (l). On ne peut donc pas considérer tous les groupes carboxyliques comme ayant la même valeur de

l’existence de groupes carboxyles "cachés" sous forme d'ions, soulève la question de la charge positive maximum de la protéine

25

Le procédé consiste à estimer le point zéro de charge nette au pH 11,1, Ce pH n’a pu être déterminé qu'électrophorétiquement

(Tanford et Wagner, 1954) étant donné que le lysozyme précipite par déssalage (le procédé normal de détermination de ce point de référence est donc impossible). A l'aide de ce pH la charge posi­ tive maximum est égale à 19. Ce nombre correspond aux groupes cationiques déterminés par analyse chimique. Si,comme il a déjà été mentionné, il existe dans le lysoz3nae natif trois groupes car- boxyles sous forme anionique au point final de la titration, la

26

B. RESULTATS ET DISCUSSION.

1. Titration du lysozyme natif ; conparaison d'échantillons d'ori­ gines diverses.

a) Stoechionétrie.

Les courbes de titration du lysozyne natif ont révélé l'exis­ tence de deux phénomènes caractéristiques de la région des groupes carboxyles.

1) Le nombre de groupes carboxyliques comptés varie d'une pré­ paration à l'autre,

2) Trois groupes carboxyles supplémentaires apparaissent dans des solvants dénaturants tels que des solutions concentrées d'urée ou de chlorure de guanidinium.

CourLcc ce titrât ccn eu lysozyr.'Æ iipTra et V.orthinnton (ligne

27

TABLEAU I-l

Lysoz^Tne "natif" L3'Soz3TDe

d'énatur? Origine Amour Donovan et al. 1260, 1261) Uorthington ce travail Amîour Tanford (1362) Sigm.a ce travail Armour dans 5IÎ GHCl + 1,2 h ur^e (a) Donovan et al. nombre de carbox3*les titrables 9 10 10,5 11 12 f“tnt - 5,32*0,05 5,2 4,86*0,02 4,6 w - 0,020^^^*0,020 0.175<« 0,051^^^*0,007 0,052^*^^ _______________! 47,75° - 53,0° ^^^84,5°

(e.) GliCl = chlorure de jjuanidinium

(b) ir.esures effectuées par Kanarek (1962) (c) à force iorirue 0.175

(d) à force ioniouc 0.150

(e) ir.esuré par Jirgersons(1252) : l3rsosjTne en solution 5 h en chlorure de

28.

b) Le facteur d’interaction électrostatique.

Si l'on considère tous les paramètres qui caractérisent les groupes carboxyles du lysozyme natif, on constate que les divers échantillons ne présentent pas uniquement des différences au ni­ veau du nom.bre des groupes carboxyles titrables; le facteur élec­ trostatique et le peuvent également varier d'une prépara­ tion à l'autre. Notons néanmoins que nos conditions de titration, qui seront discutées plus loin, diffèrent à certains égards des expériences rapportées ici.

En dehors de différences chimiques pouvant exister dans les lysozymes d'origines diverses, des variations de l'organisation spatiale pourraient égalem.ent être prises en considération. Nos données confrontées avec celles de Tanford (1962) et de Donovan

(i960) montrent qu'il pourrait exister dans le lysozyme une rela­ tion entre le nombre de groupes carboxyliques titrables et le fac­ teur électrostatique w. On constate que lorsque le nombre de grou­ pes carboxyles titrables augmente, w tend à diminuer. La dim.inu- tion du facteur électrostatique peut rendre compte d'un déroule­ ment ou de l'expansion de la molécule, permettant au solvant de

pénétrer dans le domaine moléculaire (Tanford, 1955 h, 1961).

Il en est bien ainsi lorsque la protéine est titrée en pré­ sence d'un agent dénaturant. Tous les groupes carboxyles étant

titrés, le facteur électrostatique accuse alors la valeur la plus réduite (tableau I-l). Les mesures de pouvoir rotatoire ainsi que d'échange deuterium-hydrogène et relatifs aux échantillons V/or- thington et Signa vont donc dans le sens de nos résultats (Kanarek, 1962

).

29

des liaisons de la structure tertiaire qu'indique l'augmentation du taux d'échange deuteriun-hydrogène. Ces altérations provien­ draient essentiellement de l'âge différent des préparations d'en­ zyme. En outre, certains échantillons évoluent au cours du temps plus ou moins rapidement.

Notons aussi que les altérations suite au vieillissement peu­ vent apparemment être rendues réversibles par chauffage modéré de la solution d'enzyme.

Toutefois, les variations de pouvoir rotatoire ne pourraient à elles seules rendre compte des faibles valeurs du facteur élec­ trostatique observées ici. Dans l'ensemble, les valeurs de w, tant pour le lysozyme Worthington, que pour l'échantillon Sigma sont moins élevées que la valeur obtenue par Tanford (tableau I-l). De plus, il est surprenant que l'échantillon Sigma même "vieilli" possède une valeur w pratiquement égale à celle du lysozyme mis en présence de chlorure de guanidinium. (5M) et d'urée (2M). En effet, si l'on se réfère à la valeur du pouvoir rotatoire obtenue par Jirgensons (1952) pour le lysozym.e en solution aqueuse 5M en chlo­ rure de guanidinium. :

= - 84,5° à 55°C

on constate que la protéine est de loin plus altérée que ne l'est l'échantillon Sigma :

[dj = 53”

30.

La théorie de Linderstr;(m-Lang, exprinée par l’équation (1) prédit d'une manière adéquate l'effet des sels sur la courbe de titration de protéines, le traitement nathém.atique considère non seulement l'influence de la force ionique sur le facteur électro­ statique w, nais aussi l'effet des ions liés sur la charge nette

(Z) de la molécule, les protéines en solution se combinent aux anions et cations autres que les ions hydrogène et hydroxyles.

L'effet de telles combinaisons sur la charge nette des pro­ téines ainsi que sur la pente de la courbe de titration n'avait pas été considéré dans nos calculs étant donné le manque d'infor­ mations précises. Il est en tout cas bien connu grâce aux travaux de Carr (1953) que le lysozyme se lie fortement aux ions chlorure. De ce fait, des corréctiorsapportées aux valeurs de la charge Z auraient pour conséquence d'élever la valeur de w (Tanford, 1962),

D'autre part, la température de titration et la nature de l'électrolyte utilisé ici différencient nos expériences de celles rapportées dans le tableau I-l.

L'addition de chlorure de calcium à la solution de lysozyme, (justifiée p. 16) influence sans doute aussi les courbes de titra­ tion.

Des exemples multiples d'altération des propriétés de groupes acides des protéines par combinaiaon aux ions bivalents sont dé- crits dans la littérature

31.

La liaison des ions bivalents aux protéines a pour conséquence fréquente le déplacement du pH vers des valeurs plus faibles. C'est ainsi que Duke _et ^ (1952) ont pu montrer que les ions calcium ou magnésium augmentent l'acidité des groupes carboxyliques de la trypsine entre pH 3,5 et 5. Ils en concluent que les groupes carbo­ xyliques ont été chélatés à ces ions. Des conclusions similaires

pourraient être avancées à l'examen des courbes de titration du lysoz3n:ie (fig. 1-5).

c) pK intrinsèque.

Dans l'ensemble, les valeurs de des groupes carboxyli­ ques sont anormalement élevées (tableau I-l). Comme il avait déjà été mentionné, ces anom*alies proviendraient du fait que la région des groupes carboxyles n'obéit pas à l'équation de linderstr^m-lang si l'on considère que ces groupes ont un identique.

Une valeur de anormale n'est d'ailleurs pas exclusive­ ment obseirvée dans le cas du lysozyme, le chymotrypsinogène et la ribonucléase, protéines riches également en groupes basiques, pré­ sentent des écarts semblables, la cause pourrait en être une distri bution spatiale irrégulière des groupes basiques par rapport aux groupes carboxyliques.

32

fig 1-6

33

RESULTATS.

lysozynes altérés par la chaleur.

TABLEAU 1-2

Lysozyne Worthinp;ton chauffé à 43° C

Les échantillons ont été préchauffés au pH nentionné en solu­ tion 0,1 M en KCl.

Les courbes de titration furent relevées à 40° G, à force ionique 0,175.

A. __ n^^^ fixé gai* la valeur à pH 2 pH de préchauffage n _P^int w ' 5,2 6 5,28 + 0,02 0,144 + 0,017 4,75 6 5,55 + 0,02 0,147 + 0,013 7,00 8 5,34 + 0,02 0,112 + 0,012 8,7 9 5,34 + 0,03 0,107 + 0,012

B. n fixé par le lysozyne natif

3,2 10 5,78 + 0,01 0,223 + 0,007

4,75 10 6,00 + 0,04 0,232 + 0,028

7,00 10 5,60 + 0,04 0,154 + 0,021

8,7 10 5,51 + 0,04 0,131 + 0,017

(1) nonbre de groupes carboxyliques.

Fig 1-7

Equlv/mole

34

TABLEAU 1-3

Les échantillons ont été préchauffés au pH mentionné en solution Ojl M en KOI.

Les courbes de titration furent relevées à 40° G à force ionique 0,175.

Lysozyme Worthington chauffé à 36° G

n^^^ fixé par la valeur à pH 2

pH de préchauffage n Phnt W "t ^ ) 3,2 5 6,34 + 0,02 0,264 + 0,018 4,75 7 5,81 + 0,01 0,168 + 0,006 7,0 9 5,67 + 0,01 0,132 + 0,008 8,7 10 5,38 + 0,03 0,095 + 0,019

B„ n f j.xé par le lysozyme natif

C M 1 ______ 10 6,85 + 0,02 0,371 + 0,015 4,75 10 6,10 + 0,02 0,224 + 0,012 7,0 10 5,87 + 0,02 0,160 + 0,012 8,7 10 5,38 + 0,03 0,095 + 0,019

(1) nombre de groupes carboxyliques

Equiv/rnole

35

TABLEAU 1-4

Les échantillons ont été préchauffés au pH mentionné, en so­ lution 0,1 M en KOI.

Les courbes de titration furent relevées à 40° 0 à force ionique 0,175.

Lysozyme Worthin^ton chauffé à 70° C

A. n^^^ fixé par la valeur à pH 2

pH de préchauffage n w to^ ^ ^ 3,2 4,75 7,0 8,7^^^ 6 9 10 6,08 + 0,02 5,88 + 0,01 5,41 + 0,02 0,240 + 0,014 0,200 + 0,009 0,103 + 0,010

B. n fixé par le lysozyme natif

3,2 4,75 7,00 8,7^^^ 10 10 10 6,29 + 0,02 5,89 ± 0,01 5,41 + 0,02 0,299 ± 0,013 0,209 + 0,009 0,103 + 0,010

(1) nombre de groupes carboxyliques.

(2) l'intervalle de confiance correspond à une probabilité de 95 (3) le lysozyme à pH 8,7 soumis durant 4 heures à cette température devient totalement insoluble. Nous n'avons donc pas pu relever

Fig 1-9

I

î Lysozyice Vforthington ; ccjurbes de titration à 40°C d'échantillons chauffés à

TABLEAU 1-5

36

Les échantillons ont été préchauffés au pH mentionné en solu­ tion 0,1 M en KOI.

Les courbes de titration furent relevées à 40° C à force ionique 0,175.

Lysozyme V/orthin^ton chauffé à 88° C.

pH de^^^

préchauffage „(2)

3,2 11

4,75

13-(1) Le lysozyme à pH 7 et 8,7 soumis durant 4 heures à cette tem­ pérature devient totalement insoluble. Nous n'avons donc pas pu relever les courbes de titration de ces échantillons.

Les courbes de titration des échantillons préchauffés en mi­ lieu acide ne permettent que l'estimation du nombre de groupes car- boxyliques titrables. L'altération des échantillons au cours de l'expérience ne nous a pas permis de relever les courbes de titra­ tion dans un réel état d'équilibre. Il n'a donc pas été possible d'appliquer le traitement mathématique à ces résultats.

... ... Fig î-iO '...

Equiv./moiff

37. 2. Lysozymes altérés par la chaleur,

a) Stoechiométrie.

Nous constatons que les échantillons prétraités jusqu'à 70° G présentent dans l’ensemble une forte diminution du nombre de grou­ pes carboxyliques titrables à pH 3 par rapport au lysozyme de ré­ férence (fig. I - 6,7 et 8). le phénomène est particulièrement mar­ quant à pH acide. Il est encore très net à pH neutre (fig. 10) et alcalin, pour autant que la température ne dépasse pas 56° G. D’autre part à température égale, une élévation de pH accroît le nombre de groupes acides titrables à pH 3. La molécule devient également plus accessible à la titration lorsque la température de préchauffage s’élève, et ce n’est qu’à partir de 56° G et en so­ lution neutre ou alcaline que l’on retrouve le nombre de groupes carboxyles titrables dans le lysozyme de référence.

Si toutefois la température de préchauffage à pH acide dépas­ se 70° G le nombre total de groupes acides titrés à pH 3 s’élève rapidement (fig. 1-9). Il correspond alors à la valeur analytique des résidus glutamiques et aspartiques sous forme acide dans le lysozyme

Il est bien connu qu’une valeur limite d’ions hydrogène liés est approchée dans la plupart des courbes de titration entre pH 1 et 2. les résultats expérimentaux étant sujets à des larges fluc­ tuations dans cette région de pH, il est souvent nécessaire d’es­ timer par extrapolation la fin de la titration.

Fig I-ll

Fig 1-12

hys''zyrv.e Worthington : évolution du facteur w en fonction de la température de chauffage. Les courbes ont toutes pour origine la valeur w correspondant à la protéine non traitée. Le facteur électrostatique est obtenu par analyse graphi­ que de l'équation (1) appliquée aux groupes carbojq^liques dans l'hypothèse A

Fig 1-13

Lysozyne Vforthington : évolution de des groupes carboîQ^liques en fonction de la température de chauffage. L'origine des courbes correspond au des groupes carbojç^liques de la protéine non traitée. Les valeurs de pK^^ ont été obtenues par analyse graphique de l'équation (1) dans l'hypothèse A (où n est fixé par la valeur à pH 2).

Fig 1-15

38. On voit que les variations qui affectent le nombre de groupes carboxyliques titrables sont énormes lorsqu'on applique la méthode d'extrapolation à pH 2. l'hypothèse A introduit des abérrances sur la stoechiométrie de la réaction.

Nous avons également envisagé l'hypothèse (B) où la stoechio­ métrie de la réaction resterait inchangée; le nombre total de grou­ pes carboxyles titrables étant fixé par le lysozyme natif (Worthing- ton).

le facteur d'interaction électrostatique et le pK intrinsèque ont été calculés pour chaque hypothèse.

l'effet du préchauffage sur le facteur électrostatique est il­ lustré par les figures I-ll, 12 et 13. On remarque que w, exprimant l'état d'expansion de la molécule, évolue tant en fonction du pH qu'en fonction de la température de préchauffage.

Certains échantillons traités à pH neutre ou alcalin précipi­ tent au cours du chauffage. D'autres tels les échantillons chauffés à 88° et en milieu acide s'avèrent instables et difficiles à ti­ trer. Pour ces raisons les courbes exprimant l'évolution du fac­ teur électrostatique n'ont pu être complétées. L'allure générale du diagramme semble néanmoins indiquer que w passe par une valeur maximum à des températures d'autant plus élevées que le pH de pré­ traitement est acide. Il est dès lors possible de déterminer, à chaque pH, la température qui confère au lysozyme la configuration la plus compacte.

39 dans ces conditions dans des sens divers. Ces données suggèrent qu'il y a au moins deux effets en compétition. En effet, les figu­ res 12 et 13 montrent que les variations du facteur électrostatique en fonction de la température passent par un maximum.

c) pK intrinsèque,

Pour des raisons déjà discutées les valeurs de pK intrinsèque obtenues par extrapolation graphique, ne peuvent pas représenter de réelles constantes des groupes acides du lysozyme. On remarque cependant sur le plan comparatif, que les valeurs les plus élevées sont obtenues pour les échantillons préchauffés en milieu acide

(fig. 14 et 15). Par contre le prétraitement thermique en milieu neutre ou alcalin ne change que peu la valeur de pK intrinsèque par rapport à la valeur obtenue pour le lysozyme de référence,

3. Discussion.

Nous pouvons dès à présent conclure que ni l'hypothèse A ni l'hypothèse B ne trouvent des justifications physiques. En effet, on voit mal dans le premier cas, tant de groupes cachés désobéir à la théorie électrostatique. De son côté, l'hypothèse de la

stoechiométrie inchangée est incompatible avec les changements de structure intervenant dans la protéine.

Il est probable que chacun de ces facteurs intervient dans une certaine mesure dans les phénomènes étudiés. L'influence d'autres facteurs dont il n'avait pas été tenu compte dans l'application de la relation de Linderstr)z(m-Lang, va être maintenant envisagée.

40. 1. Phénomènes intervenant au cours du préchauffage %

Il est certain que les altérations irréversibles que subit la protéine au cours du prétraitement dépendent de la température et du pH de préchauffage. Mais étant donné qu'une transition thermique, fonction du pH, caractérise le lysozyme (Barel, 1964), nos expé­ riences se différencient les unes des autres en ce qu'elles ont été effectuées avant, pendant ou au-delà de la température de transi­ tion. Elles sont donc difficiles à comparer vu la complexité des phénomènes intervenant à ces trois stades.

En dehors des changements purement structuraux des altérations chimiques pourraient s'être produites au cours du traitement deé. échantillons, la désamidation partielle des groupes carboxyles

amidés pourrait rendre compte de l'augmentation du nombre de groupes acides titrables après chauffage à 88° C.

2, Phénomènes influençant la titration :

les groupes titrables de la protéine peuvent se combiner à des substances autres que les ions hydrogène. Si au cours de l'analyse de la courbe de titration, il n'a pas été tenu compte d'un tel phé­ nomène d'association, les paramètres calculés sont altérés, les possibilités de complexion par les ions calcium présents dans la solution, ne sont pas à exclure dans le cas du lysozyme.

41 Sil’altération subie par le lysozyme natif par suite du phé­ nomène de vieillissement se traduit par un relâchement de la struc­ ture secondaire ainsi que par la rupture d’un certain nombre de liaisons stabilisant la structure tertiaire, on peut se demander quel est le niveau d'organisation de la protéine principalement affecté par le chauffage.

Les mesures de pouvoir rotatoire indiquent que le chauffage modéré n'affecte que peu la structure secondaire de la molécule. L'effet de températures ne dépassant pas 70° C, sur la sensibilité à la protéolyse du lysozyme, confirme encore cette constatation

(voir chapitre II). Par contre, certaines données d'échange deu- terium-hydrogène (Kanarek, 1962) ainsi que la titration des groupes carboxyles montrent de leur côté que la molécule subit au cours du traitement thermique une réorganisation rendant les hydrogènes moins échangeables et probablement certains groupes carboxyles inaccessi­ bles à la titration. Ces deux techniques décèlent également un effet marquant du pH de préchauffage sur la structure de la protéine. Les valeurs de w calculées sont également en désaccord avec les données polarimétriques. On se rappellera toutefois les nombreuses influ­ ences que subissent ces paramètres. Ces effets rendent l'interpré­ tation des résultats difficile, et ne permettent pas de conclusion définitive.

42.

En effet, dans un dérivé où les charges des lysines ont été abo­ lies, (par exemple par acétylation ou par désamination) les ions carboxylates deviennent accessibles à la titration. Dans le cas contraire, tel que le lysozyme guanidylé, les groupes carboxyliques ne sont pas titrés.

Si l'explication de ce phénomène est un effet électrostatique, deux cas doivent être envisagés ;

1) un effet direct des résidus lysine sur les ions carboxyli­ ques .

2) les résidus lysine sont, en interaction avec une autre région de la molécule masquant indirectement les ions carboxyliques. Deux résultats plaident en faveur de la première explication.

1) les pK observés des groupes lysines sont normaux (Tanford et Wagner, 1954). Cette constatation semble éliminer tout effet

autre que les effets électrostatiques généraux de ces grou­ pes .

2) La tentative effectuée en vue de convertir les ions carbo­ xylates en groupes carboxyliques non ionisés avait échoué. L'expérience réalisée par dialyse du chlorure de guanidi­ nium 8 M d’une solution de lysozyme à pH 2 contre une solu­ tion de HCl de pH 2 suggère que ces groupes ne peuvent être masqués que sous forme d'ions carboxylates.

45

Des difficultés expérimentales ne nous ont pas permis d'obtenir toutes les données acido-basiques concernant les échantillons pré­ traités au délà de la zone de transition thermique du lysozyme; néanmoins, l'augmentation du nombre de groupes acides titrables par rapport au lysozyme de référence pourrait bien indiquer une désorganisation structurale de la molécule. Des conclusions analo­ gues peuvent être émises à partir des mesures cinétiaues présen­ tées dans le chapitre suivant.

Par ailleurs, dans ces conditions de traitement, la température a sur le lysozyme un effet semblable à celui du chlorure de guani­ dinium ou de l'urée. En effet, le lysoz3rme titré en présence de l'un ou l'autre de ces agents dénaturants, exhibe un nombre de groupes carboxyles égal à la valeur analytique des résidus acides.

4. Conclusions.

Deux hypothèses distinctes sur la stoechiométrie de la titra­ tion ont été envisagées pour calculer le facteur d'interaction électrostatique et la constante d'ionisation intrinsèque des grou­ pes carboxyliques des échantillons de lysozyme traités thermiquement

L'analyse des courbes de titration conduit à des paramètres al­ térés et souvent en désaccord avec d'autres données structurales.

les paramètres caractérisant la titration des groupes carboxy­ liques du lysozyme modifié par la chaleur, subissent l'influence de nombreux facteurs. Intervenant d'une manière complexe dans les phénomènes étudiés, ils rendent l'interprétation des résultats compliquée.

44 CHAPITRE II

Etude de 1 *hydrolyse trypsiaue des lysozymes altérés.

A. Partie expérimentale.

1. Préparations utilisées. 2. Produits.

3. Méthodes utilisées.

4. Calcul et interprétation des résultats.

B. Résultats.

1. lysozyme Sigma et lysozyme Worthington. 2. lysozymes altérés par la chaleur.

3. lysozymes altérés par l'urée et par le chlorure de guanidinium.

C. Discussion.

1. lysozyme natif %

a) Conditions de protéolyse et méthodes de détection. b) lysozyme Sigma et lysozyme Worthington.

2. lysozymes altérés par la chaleur.

a) Influence de la température de préchauffage. b) Influence du pH.

c) Influence des sels.

45.

Cette étude est basée sur l'hypothèse émise par Mihalyi et Harrington (1959) ; les parties déroulées d'une chaîne polypepti­ dique sont plus susceptibles que les parties hélicoïdales d'être attaquées par les enzymes protéolytiques. En particulier, de nom­ breux travaux ont montré l'incapacité de la trypsine et de la

chymotrypsine à hydrolyser les protéines à l'état natif (voir p. ex. I Spaclonan et al, I960), la sensibilité à l'attaque protéoly­ tique permet donc de déceler les altérations provoquant le relâche­ ment de la structure organisée de la chaîne polypeptidique.

Il semble qu'il existe une certaine indépendance des divers niveaux structuraux de la molécule du lysozyme. Il est difficile de décider si le traitement auquel est soumise la protéine exerce une action réellement dénaturante. En effet, un traitement donné peut fort bien renforcer certaines structures tout en détruisant d'autres.

la protéolyse nous a paru donc une méthode pouvant aider à mieux préciser la nature des modifications subies par la protéine sous l'effet de divers traitements,

A, .

1. Préparations utilisées.

lysozyme ; deux préparations commerciales furent utilisées ; lysozyme Sigma et lysozyme Worthington (W) (voir chapitre l).

lysozymes altérés par la chaleur.

la préparation des échantillons fut décrite précédemment (p,.i5). Certains échantillons furent chauffés en l'absence de sels.

lysozyme altéré par l'urée.

Fig II-l

Fig II-2

Fig II-3

T«mpon phosphate pH 7,18

Fig II-4

T

100

200

300

Volume en millilitres

Fig. ïï - 4

par Godfrine (l96l). Nous donnerons donc brièvement un aperçu de la méthode.

Incubation dans l'urée : le lysozyme à une concentration de 20 mg par ml de solution saturée en urée (environ 9,1 M/l) et de pH 8,5 (tampon borate 0,06 M) est incubé à 15° 0 pendant 28 jours. Après ce traitement la solution est soumise à une dialyse de 16 heures, puis désionisée sur la résine MB3• La protéine est ensuite lyophilisée, puis soumise à la chromatographie sur résine Amberlite IRC-50, l'élution se fait au moyen du tampon phosphate à pH 7,18. Un gradient continu de concentration variant de 0,128 M a 0,2 M est réalisé au cours de l'opération.

la figure II-l illustre un fractionnement typique, les diffé­ rents pics chromatographiques sont déssalés et lyophilisés séparé­ ment .

3. lysozyme altéré par le chlorure de guanidinium.

On incube le lysozyme dans une solution 5 M en chlorure de gua­ nidinium. la concentration en protéine est de 20 mg/ml, le pH 8,5

(tampon borate 0,06 M) et la température de 15° C. Après un traite­ ment de 21 jours la solution est soumise à une dialyse de 16 heures puis désionisée et enfin séchée par lyophilisation.

Afin de déceler une éventuelle hétérogénéité de la protéine ainsi traitée, l'échantillon fut soumis à une chromatographie à différentes conditions d'élution.

a) Chromatographie sur Amberlite IRC-50, tampon phosphate 0,2 M pH 7,18 (fig. II-2). Précisons que ce sont les conditions préco­ nisées par Tallan et Stein (1953) pour le fractionnement du lyso­ zyme natif.

b) Chromatographie sur Amberlite IRC-50 avec changement discon­ tinu de la force ionique (fig. II-3). l'élution s'effectue au moyen du tampon phosphate pH 7,18 prenant successivement la concentration de 0,128 M/l et 0,2 M/l. Ces conditions, utilisées par Godfrine et léonis (1961), permettent le fractionnement du lysozyme incubé dans l'urée concentré en six composants distincts.

47.

c) Chromatographie sur carhoxymethylcellulose : (fig. II-4). Ce support convient également au fractionnement du lysozyme et à ses produits d'altération (Barel et Léonis, 1961).

2. Produits.

Trypsine Worthington, 2 x cristallisée,

1-leucine s chromatographiquement homogène (Calhiochem). Ninhydrine % Merck, pour analyse.

Methylcellosolve i distillé avant l'emploi. L'absence de peroxyde dans le distillât a été confirmée par le test à l'iodure de potas­ sium.

Autres produits et réactifs % Tous sont de pureté analytique. Solutions ;

La préparation des solutions et la détermination exacte de la concentration furent décrits au chanitre I (p. 16 ).

Le pH-mètre fut étalonné au moyen des tampons de référence déjà cités (p.l6 ),

3. Méthodes utilisées.

La cinétique de la digestion du lysozyme par la trypsine fut suivie par deux techniques différentes. Dans la première méthode nous avons effectué la réaction en milieu tamponné et mesuré l'éten­ due de la trypsinolyse par coloration à la ninhydrine ou par préci­ pitation à l'acide trichloracétique. La majorité des cinétiques enzymatiques furent cependant suivies par la seconde méthode, en mesurant la consommation de base dans un pH-stat au cours de la trypsinolysG.

a) BrOtéolyse_en_milieu_tamponné.

48.

tionnel est de 20 celle de la trypsine est de 1 les aliquotes, prélevées du mélange réactionnel après des périodes définies, sont immédiatement diluées, à la concentration adéquate pour les dosages ultérieurs. D'autre part, la température ambiante à laquelle se font ces déterminations est suffisamment basse pour arrêter prati­ quement la protéolyse. En effet, l'action de la trypsine sur le lysozyme natif est presque nulle à 25° C (Gorini et 1953).

Le dosage à la ninhydrine a été effectué selon la méthode de Cocking et Yemm (1954). Les résultats ont été exprimés en équiva­ lents de leucine. Cet acide aminé a en effet servi à établir la courbe d'étalonnage.

Les produits d'hydrolyse furent également dosés par mesure de l'extinction à 280 nm dans le liquide surnageant. Ce dernier est obtenu après centrifugation du mélange résultant de l'addition de 5 ml d'acide trichloracétique à 5 à 3 ml du milieu réactionnel.

b)

La libération des ions hydrogène au cours de la protéolyse est suivie au moyen d'un pH-stat du type décrit par Jacobsen - Léonis (cf. Jacobsen et ^., 1957). Le pH-mètre est de la marque Radiometer, Modèle TTT 1; l'enregistreur est entièrement comparable à l'appareil

construit par OLE DICH (Copenhague, Danemark).

20 mg de lysozyme sont dissous dans 4 ml de solution 0,05 M en CaCl2. La cellule contenant la protéine est fixée aux électrodes et l'ensemble est placé dans un thermostat à 40° 0. Pour les détails du montage on se référera aux indications données page 16. Ici éga­ lement, une atmosphère d'azote est maintenue au dessus du milieu

9 Fig II-5

Relevé t^.'pique au pH-stat

A) Consoîiiration de base au cours de la digestion trypsi.quo d' lysozyme altéré par la chaleur.