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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Perros, M. (1994). Etude de la régulation du cycle réplicatif du virus MVMp : une approche moléculaire des méchanismes de l'oncosuppresion.

(Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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Faculté des Sciences

Laboratoire de Biophysique et Radiobioiogie

Etude de la Régulation du Cycle Réplicatif du Virus MVMp : Une Approche Moléculaire des Mécanismes de

rOncosuppression

Par Manoussos PERROS

Directeur de Thèse : Pr. Jean Rommelaere Mémoire présenté en vue de

l'obtention du Grade Légal de

Docteur en Sciences Chimiques

Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences

Laboratoire de Biophysique et Radiobiologie

Etude de la Régulation du Cycle Réplicatif du Virus MVMp : Une Approche Moléculaire des Mécanismes de

l'Oncosuppression

Par Manoussos PERROS

Directeur de Thèse : Pr. Jean Rommelaere Mémoire présenté en vue de

l'obtention du Grade Légal de

Docteur en Sciences Chimiques

de la thèse annexe ayant pour titre :

Les acquisitions récentes de la cristallographie aux

rayons X devraient contribuer à l'élucidation du mode

d'interaction du régulateur transcriptionnel CytR avec

ses promoteurs cibles.

REMERCIEMENTS

J'aimerais tout d'abord remercier Jean Rommelaere de m'avoir dirigé sans relâche tout au long de ce travail, qu'il a encouragé et soutenu jusqu'au bout.

Je remercie également Dominique Stehelin de m'avoir accueilli dans son équipe, et de m'avoir assuré un cadre de travail agréable et efficace.

Je me souviendrai toujours de mes premiers pas dans la recherche, guidés par Perrine Caillet et Annick Brandenburger, à qui je suis reconnaissant.

Au cours de ce travail, j'ai été amené à rencontrer et à travailler avec beaucoup de personnes, que je voudrais remercier ici de leur contribution :

Zouzou, pour sa bonne humeur et son goût du travail (c'est tout pour aujourd'hui!?), même quand la fin semble lointaine et inespérée (c'est de nouveau le bout du tunnel..). Laurent, pour son efficacité et les discussions scientifiques ou autres (toujours en retard, mais avec de si bonnes excuses, comment lui en vouloir?). Jean-Marc, qui me connaît mieux que tous (Elsinore...). Said, qui est loin, et sans qui la nucléoline n'aurait été qu'une protéine comme les autres. Steffen, pour m'avoir appris la biologie moléculaire, mais aussi que dans la vie, il n'y a pas que le travail (ah bon? quoi d'autre?). Pierre, pour m'avoir donné le goût de l'atténuation.

Nathalie (NH), qui à force d'avoir tort, m'a appris que j'ai tout de même souvent raison (mais si j'ai raison, si!). Béa pour m'avoir attendu (c'est pas du boulot, ça?) et merci à Romu, François et Nathalie pour le coup de main.

Il y a bien sur beaucoup d'autres, qui m'ont toléré parfois tous les jours, et qui

ont partagé leurs connaissances ou leur humour; qui (heureusement pour eux) n'ont

pas dû travailler avec moi de façon régulière, et qui par conséquent m'apprécient

peut-être encore (?) autant que je les estime. J'aimerais leur dire ici que grâce à eux,

je garderai les meilleurs souvenirs de ces années de thèse. Merci à tous.

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jicoç xoaoç jrovoç xoar) ^ cüt ) jrriYav crxr|v a(3uaao

Yia eva jrovKafALao aÔEiavo yia piav E> ievti

FicüpYOç SEqpEpriç, "EX

]"

HpEpo>iOYLO Kaxaoxpœpaxoç, F'

What we call the beginning is often the end And to make an end is to make a beginning.

The end is where we start from.

T. S. Eliot "Little Gidding"

Four Quartets

SOMMAIRE

RESUME... 6

ABREVIATIONS...8

BUT ET DEMARCHE EXPERIMENTALE... 10

1. Contexte... 10

2. But et approche experimentale...11

A. Approche 1 ...11

B. Approche 2... 11

C. Approche 3... 12

D. Approche 4... 13

3. Conclusion... 13

INTRODUCTION... 14

1. Les parvo virus...14

A. Données virologiques...14

(i) Taxonomie...14

(ii) L'origine des Parvovirus... 16

(iii) Spectre d'hôte et pathogénicité... 16

B. La Biologie moléculaire des parvovirus... 18

(i) Adsorption, pénétration et décapsidation des particules parvovirales...18

(ii) Réplication du génome parvoviral...20

a) Structure du génome...20

b) Modèles pour la réplication de l'ADN parvoviral... 20

c) Régulation par des facteurs viraux ou cellulaires... 23

(iii) Transcription des gènes parvoviraux... 24

a) Organisation génomique...24

b) Régulation de la transcription... 25

La région régulatrice amont du promoteur P4... 26

Régulation de la transcription en aval de P4 : l'atténuateur...27

Régulation transcriptionnelle du promoteur P38... 28

(iv) Les protéines parvovirales...29

(v) Le cycle parvoviral : suite et lyse...30

C. Relations entre les parvovirus et le cancer...30

(i) Persistance et surveillance parvovirale de la

tumorigenèse spontanée... 31

(iii) Toxicité des parvovirus autonomes pour les cellules

transformées ...33

(iv) Mort cellulaire et réversion phénotypique induite par les AAV...34

(v) Quelques aspects moléculaires de l'oncosuppression par ^ les parvovirus autonomes... 35

D. Applications potentielles des parvovirus...37

E. Conclusion ... 38

2. La nucléoline...39

A. Quelques généralités sur le nucléole... 39

B. La nucléoline : structure et fonction... 39

i) Le domaine amino-terminal...40

ii) La partie centrale : les motifs de reconnaissance de l'ARN... :... 40

(iii) L'extrémité carboxy-terminale...41

(iv) Fonctions et régulation...42

C. La nucléoline et le parvovirus MVMp...43

3. Les voies de Ras...45

A. La famille des protéines Ras... 45

(i) Synthèse et localisation... 46

(ii) Structure et fonction... 47

(iii) Régulation de l'activité... 49

a) GAP... 49

b) Les facteurs d'échange...52

c) Spécificité et régulation croisée des régulateurs de Ras...54

B. Ras et la transduction du signal... 54

(i) Le rôle de la protéine Ras dans la régulation de la croissance et de la différenciation cellulaire... 55

(ii) Les signaux qui activent Ras : la cascade en amont... 57

(iii) Les signaux délivrés par Ras : la cascade en aval... 59

a) La cascade des MAP kinases... 59

b) La voie de la PKC : interactions avec le métabolisme des phospholipides ...61

c) Intégration des signaux et rétro-régulation...63

C. Ras et la régulation transcriptionnelle... 64

(i) Effets de Ras sur l'activité des facteurs de transcription

et la régulation des gènes qui les codent...65

(ii) Contrôle de la transcription par Ras via les facteurs de

la famille Fos/Jun et ATF/CREB ... 65

a) La superfamille des protéines bZIP... 65

b) Les familles AP-1 et ATF/CREB... 66

c) Régulation de la protéine kinase AMPc- dépendante (PKA) par Ras... 68

d) Régulation des facteurs de la classe bZIP par la phosphorylation... 69

Régulation au niveau transcriptionnel...69

Régulation post-traductionnelle par la phosphorylation ... 71

Le rôle des phosphatases ...72

D. Conclusion...73

RESULTATS ET DISCUSSION... 74

Article I... 75

A. Résumé... 75

B. Commentaire... 84

Article ii... 86

A. Résumé... 86

B. Commentaire...95

Article iii...96

A. Résumé... 96

B. Commentaire... 121

Article iv... 123

~A. Résumé...123

B. Cortimen taire... 140

Article V... 142

A. Résumé...142

B. Commentaire... 184

CONCLUSIONS ... 187

REFERENCES... 189

RESUME

La faible complexité génétique des parvovirus les rend dépendants de facteurs cellulaires pour accomplir leur cycle réplicatif. Cette subordination a comme conséquences notables leur affinité pour des tissus tumoraux (oncotropisme) lors d'infections de mammifères adultes et la lyse sélective des cellules transformées (oncolyse) in vitro. Ces propriétés sont vraisemblablement à l'origine de l'oncosuppression observée dans certains modèles in vivo. Nous avons choisi d'utiliser le parvovirus MVMp comme modèle pour étudier les mécanismes moléculaires responsables de l'oncolyse, mais aussi pour mettre en évidence quelques uns des processus induits par la transformation cancéreuse.

Nous avons tout d'abord identifié les facteurs viraux responsables de la cytotoxicité parvovirale. En plaçant l'unité transcriptionnelle précoce du parvovirus MVMp (codant les protéines régulatrices NSI et NS2) sous le contrôle d'un promoteur inductible, nous avons reproduit les effets létaux d'une infection parvovirale en absence de virus fonctionnel.

Dans un deuxième temps, nous avons tenté d'élucider quelques unes des interactions du virus avec des facteurs cellulaires susceptibles de moduler la production de ces protéines toxiques.

Tout d'abord, nous avons caractérisé une protéine qui reconnaît spécifiquement le génome parvoviral et est extraite préférentiellement des cellules normales. Cette protéine s'est avérée être la nucléoline, un constituant majeur des nucléoles où se réplique l'ADN viral. La région de l'ADN parvoviral interagissant avec la nucléoline forme une structure élaborée dont l'intégrité semble nécessaire à la liaison de la protéine. Par ailleurs, nous avons étudié le reploiement secondaire de l'ADN simple et double brin dans une région (dite atténuateur) qui est responsable de la terminaison précoce de la transcription des ARNm codant les protéines NS. Nous avons démontré son rôle in vivo en produisant des virus recombinants et proposons un modèle qui pourrait expliquer son fonctionnement au cours de la transcription.

En parallèle, nous avons tenté d'identifier des facteurs cellulaires qui seraient responsables

de la transcription accrue des gènes NS dans les cellules transformées. Nous avons effectué des

expériences de footprinting in vivo et in vitro qui nous ont permis de mettre en évidence de

nombreuses zones d'interaction du promoteur précoce P4 avec des facteurs cellulaires. La

transformation des cellules par l'oncogène ras modifie certains de ces complexes qualitativement

et/ou quantitativement. Parmi les régions d'interaction différentielle, nous avons choisi d'étudier

une séquence qui fixe des facteurs de transcription de la famille ATF/CREB. Nous avons

caractérisé les protéines participant à la formation du complexe, et les bases impliquées au niveau

du promoteur. Ces séquences activent la transcription quand elles sont placées en amont d'un

promoteur minimal. Au moyen de mutants du promoteur P4, nous avons montré que les sites CRE

modulent l'activité transcriptionnelle de ce promoteur en fonction de la transformation par Ras et

par une voie qui implique la protéine kinase AMPc-dépendante (PKA). Des études effectuées in

vitro confirment par ailleurs l'implication de cette kinase, puisqu'au moins une partie des effets de

la transformation cellulaire par Ras sur les facteurs qui reconnaissent le promoteur parvoviral peut être expliquée par la diminution de l'activité PKA nucléaire.

En conclusion, la toxicité sélective du parvovirus MVMp pour les cellules transformées

implique plusieurs processus dont l'élucidation, outre l'intérêt qu'elle présente per se, peut nous

renseigner sur la modulation de l'activité de facteurs cellulaires par la transformation.

ABREVIATIONS

MVMp NS/Rep ATF

CREB/CREM PKC/PKA AMPc DNV AAV VP bHLH bZIP AP-1

USF/MLTF NF-Y att nue u^.

Cat Luc NOR CKH cdc2/25 RRM RNP GFR GAP GEF SH2/SH3 NFl Sos BOSS

EGF/PDGF/FGF/NGF TPA

PLC/PLD/PLA Drk

Minute Virus of Mice, souche prototype

Protéines non-structurales des parvovirus autonomes et AAV Activating Transcription Factor

cAMP Responsive Elément Binding factor/Modulator Protein Kinase C/Protein Kinase A

Adénosine Monophosphate cyclique Densonucleosis Virus

Adeno-associated virus Protéines de capside

Basic domain-Helix-Loop-Helix' Basic domain-Leucine Zipper Activating protein-1

Upstream Stimulatory Factor/Major Late transcription Factor Nuclear Factor Y

Région du génome de MVMp responsable de l'atténuation Région du génome de MVMp reconnue par la nucléoline Unité génomique

Chloramphenicol Acetyl Transferase Luciferase

Nucleolar Organizing Région Casein Kinase II

Cellular Division Control 2/25 RNA Récognition Motif Ribonuclear Protein Consensus

Domaine riche en résidus glycine, phénylalanine et arginine GTPase Activating Protein

Guanine nucléotide Exchange Factor Src Homology domains

Neurofibromatosis Factor Son of Sevenless

Bride of Sevenless

Epidermal/platelet-derived/fibroblast/nerve Growth Factors 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate

Phospholipases C, D et A

Downstream of Receptor Kinase

Grb2 Growth factor Receptor-Bound protein

1RS Insulin Receptor Substrate

DAG Diacylglycérol

MMTV Mouse Mammary Tumor Virus

PI Phosphatidylinositol

Pcho Phosphocholine

PC Phosphatidylcholine

MAPK Mitogen Activated Protein Kinase

ERK Extracellular signal Regulated Kinase

MEK MAP/Erk Kinase

TCF Ternary Complex Forming Factor

PIP 2 Phosphoinisitol diphosphate

PA Acide phosphatidique

CK Choline Kinase

CT CTP Choline Transferase

IP 3 Inositol triphosphate

CRE^RE cAMP Responsive Element/TPA Responsive Elément C/RI/Rn Sous-unités catalytiques et régulatrices de la PKA SRE/SRF Sérum Responsive Element/Serum Response Factor

IP-1 Inhibitor Peptide 1

PPl Protein Phosphatase 1

I-l Inhibitor peptide 1

BUT ET DEMARCHE EXPERIMENTALE

1. CONTEXTE

Dès leur découverte, les parvovirus ont été associés au problème du cancer. L'isolement fréquent de ces virus à partir de tumeurs a initialement conduit à leur attribuer un éventuel rôle oncogène. Cette possibilité n'a toutefois pas été étayée par une série de travaux ultérieurs réalisés sur des animaux de laboratoire et montrant que l'infection parvovirale entraîne, au contraire, une réduction de l'incidence de cancers tant spontanés qu'induits par divers traitements (virus oncogènes à ADN et à ARN, agents cancérigènes chimiques et physiques, cellules néoplasiques transplantées). Les parvovirus sont apparemment doués d'un pouvoir d'oncosuppression qui a pour cibles une variété de tumeurs (sarcomes, carcinomes, leucémies) et peut s'exercer en l'absence d'effets délétères secondaires. Il est tentant de rapprocher ce phénomène de l'effet lytique de ces virus pour les cellules néoplasiques ou transformées en culture. Sur base de l'hypothèse que l'oncosuppression parvovirale est tout au moins en partie, due à l'oncolyse observée in vitro, notre équipe a entamé la caractérisation de ce phénomène au niveau moléculaire.

Dans l'introduction de ce mémoire, nous présentons d'abord les propriétés biologiques des parvovirus, puis les données moléculaires relatives à la régulation de leur cycle. Nous mettons l'accent sur les aspects en rapport direct avec l'objet de notre étude, c.à.d. la toxicité sélective des parvovirus pour les cellules de mammifères engagées dans la voie de la transformation néoplasique. Deux sous-familles sont susceptibles d'infecter les mammifères : les parvovirus autonomes et les Dependovirus. Nous décrirons plus en détail le premier de ces groupes, dont fait partie le virus MVMp utilisé comme modèle expérimental, et ne faisons référence au second que dans la mesure où la compréhension des observations ou hypothèses relatives à notre sujet s'en trouve facilitée. La première partie de l'introduction se termine par un exposé succinct des propriétés antitransformantes des parvovirus (oncosuppression et oncolyse) suivi de quelques considérations sur leurs applications potentielles.

Notre travail a mis en évidence l'interaction de la nucléoline avec le génome parvoviral. Le second chapitre de l'introduction est donc consacré à cette protéine, en particulier ses propriétés de fixation aux acides nucléiques et les différentes fonctions qui lui sont attribuées dans la biogenèse des ribosomes.

Enfin, une partie de notre travail concerne la comparaison d'une lignée de cellules

transformées par l'oncogène ras avec son homologue normal. Nous clôturerons donc l'introduction

de ce mémoire par un exposé de synthèse sur l'expression et les propriétés de Ras. Pour replacer

11 cette protéine dans son contexte physiologique normal, nous ne nous sommes pas limités aux étapes situées en "aval" dans la voie de la transduction du signal à laquelle Ras participe, mais nous donnons aussi un bref aperçu des facteurs intervenant en "amont", notamment les récepteurs de type tyrosine kinase. Un paragraphe est consacré aux facteurs de transcription qui répercutent les signaux provenant du cytoplasme (généralement par le biais des cascades de phosphorylation) sous la forme d'activation ou d'inhibition transcriptionnelle de gènes cibles. Nous traitons en particulier des familles de facteurs Fos/Jun et ATF/CREB, qui sont impliqués dans la régulation du promoteur P4.

2. BUT ET APPROCHE EXPERIMENTALE

Le but général de notre travail a été de contribuer à la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels la transformation sensibilise les cellules à l'effet lytique des parvovirus.

Pour aborder cette question nous avons utilisé plusieurs approches, visant à identifier d'une part les facteurs viraux responsables de la cytotoxicité, et d'autre part les mécanismes de la régulation différencielle de leur production.

A. Approche 1

Nous nous sommes d'abord attaché à identifier les produits parvoviraux responsables de la lyse cellulaire. Des travaux antérieurs suggérant que les protéines NS pourraient jouer ce rôle, nous avons placé l'unité transcriptionnelle correspondante sous contrôle d'un promoteur inductible par les glucocorticoïdes et établi des lignées capables d'exprimer les protéines virales après induction. Dans ces conditions, nous avons reproduit les effets cytotoxiques observés lors d'infections de ces cellules par du virus sauvage, ce qui nous a conduit à conclure que les polypeptides NS sont les facteurs viraux responsables de la lyse cellulaire en fin de cycle infectieux.

B. Approche 2

Cette identité étant établie, nous avons cherché à identifier les facteurs cellulaires

susceptibles de stimuler la production de ces protéines toxiques dans les cellules transformées, par

comparaison aux cellules normales. La régulation de la quantité de protéines NS dans la cellule

infectée peut se faire à plusieurs stades du cycle viral, notamment la réplication et la transcription

dirigée par le promoteur précoce P4. Des travaux antérieurs de notre laboratoire faisaient état

d'une protéine capable de reconnaître spécifiquement la forme monocaténaire du génome de

MVMp en aval de P4, dans les extraits de cellules normales et résistantes aux effets lytiques du

parvovirus. Cette interaction n'était pas décelable dans le cas des cellules transformées, ce qui a pu

ultérieurement être imputé à l'agglomération de la protéine lors de la préparation des extraits

transformation sur l'état (en l'occurrence la phosphorylation) d'une protéine formant un complexe défini avec le génome parvoviral. Des approches diverses (reconnaissance par des anticorps monoclonaux, criblage de banque d'ADNc) ont démontré que la protéine qui nous intéresse est la nucléoline, protéine majeure des nucléoles qui sont également les sites de la réplication parvovirale. La majorité des fonctions de la nucléoline dépendent de sa fixation à des molécules d'acides nucléiques (ADN ou ARN). Bien qu'établie pour l'ARN, la spécificité de reconnaissance de la nucléoline envers les séquences d'ADN restait à évaluer. Nous avons démontré qu'une région bien délimitée du génome parvoviral est reconnue par la nucléoline, et que cette fixation ne dépend pas uniquement de la séquence primaire, mais aussi d'une structure secondaire élaborée qui, par sa complexité, rappelle celles reconnues par diverses protéines se liant à l'ARN. Des travaux visant à évaluer le rôle physiologique de la fixation de la nucléoline sur le génome parvoviral, et l'éventuelle incidence de sa phosphorylation différentielle sur le cycle réplicatif sont actuellement cours.

C. Approche 3

Une autre étape du cycle lytique de MVMp sujette à régulation par la transformation cellulaire, est la transcription des messagers précoces qui codent les protéines cytotoxiques NS.

L'étude de la régulation de l'unité de transcription NS est intéressante à plus d'un égard, puisque ces protéines sont non seulement cytotoxiques, mais stimulent également l'activité du promoteur tardif P38, jouant ainsi le rôle de pivot entre les étapes précoces et tardives du cycle viral.

Une des régions du génome qui semble impliquée dans la succession des étapes du cycle viral se situe immédiatement en aval du promoteur précoce P4 et contient des séquences inverses- complémentaires qui peuvent s'hybrider pour former des structures palindromiques semblables à celles rencontrées dans les sites d'atténuation transcriptionnelle. Effectivement, l'élongation d'un transcrit sur quatre initiés au niveau du promoteur P4 se termine prématurément dans cette région in vitro aussi bien qu' in vivo. La levée de ce blocage requiert la présence de facteurs du complexe de transcription qui sont présents uniquement dans les cellules permissives et dont l'effet est inhibé par la présence de quantités importantes de produits NS. Pour établir le rôle de cette région in vivo, nous avons élaboré des virus recombinants exprimant un gène rapporteur à la place des protéines NS. Nous avons observé que la présence de l'atténuateur entre le promoteur et le gène rapporteur diminue l'expression de ce dernier d'un facteur compris entre trois et quatre, ce qui suggère que ce fragment d'ADN détermine l'atténuation dans des conditions d'infection naturelle.

Nous avons par ailleurs confirmé l'existence des structures prédites par ordinateur au niveau des

molécules d'acides nucléiques simple-brin, mais également double-brin. Sur base de ces

observations, nous proposons un modèle pour expliquer la prédominance de la forme atténuée par

rapport à celle qui permet l'élongation au cours de l'infection.

13 D. Approche 4

Nous avons également investigué le rôle de la région située en amont du promoteur précoce P4. Des expériences effectuées par d'autres membres de notre équipe ont montré que l'activité de ce promoteur est stimulée dans les cellules transformées par Ras. Dans le but d'identifier des zones d'interaction différencielle entre le promoteur P4 et les facteurs de transcription présents dans les cellules normales et leurs dérivés transformés par Ras, nous avons effectué des expériences de footprinting in vivo et in vitro. Parmi les sites d'interaction différencielle mis en évidence, nous avons choisi de poursuivre l'étude de séquences ressemblant au consensus de fixation des facteurs de la famille ATF/CREB. A l'aide d'approches moléculaires diverses (empreinte à la nucléase chimique, interférence de méthylation et carboxyéthylation, pontage ADN-protéines aux UV, immunoprécipitation de protéines par des anticorps spécifiques) nous avons caractérisé les protéines qui participent aux complexes formés et les bases de l'ADN qu'elles reconnaissent. Il semble notamment que la structure inhabituelle de la séquence nucléotidique de fixation et/ou le statut de phosphorylation des partenaires protéiques conduit à la formation d'hétérodimères entre ATFl et ATF2, pouvant stimuler la transcription de manière plus efficace que les homodimères et hétérodimères de ATFl et CREE 1 qui reconnaissent aussi les mêmes sites. La transformation par Ras stimule la transcription à partir du promoteur P4 en favorisant la formation d'hétérodimères ATF1/ATF2. Des expériences effectuées aussi bien in vivo (par l'utilisation d'un analogue de l'AMPc) qu'm vitro (avec la sous-unité catalytique de la PKA) montrent que l'effet de Ras pourrait être dû à la diminution de l'activité de la protéine kinase AMPc-dépendante (PKA). Comme dans d'autres systèmes. Ras semble agir en stimulant la PKC (par accumulation de son activateur majeur: le diacylglycérol), qui inhibe la translocation nucléaire des sous-unités catalytiques de la PKA.

3. CONCLUSION

La régulation du cycle parvoviral par la transformation néoplasique et la cytotoxicité

sélective qui en résulte sont des processus complexes, faisant intervenir de nombreux facteurs

cellulaires et viraux. Si notre travail a contribué à la compréhension de certains aspects de cette

thématique, il pose également de nombreuses questions. Ainsi, la fixation de la nucléoline sur le

génome viral et le reploiement des formes bicaténaires de l'ADN viral en structures complexes,

sont deux des nombreux événements dont le rôle reste à élucider. Par ailleurs, il serait intéressant

de savoir si l'activation de la transcription du promoteur P4 via des éléments ATF/CREB est une

conséquence directe de l'expression de Ras, ou si des processus intermédiaires communs à d'autres

types de transformation néoplasique, sont responsables des modifications que nous avons

observées.

INTRODUCTION

D'une simplicité génétique exceptionnelle (seulement quatre polypeptides codés et un dérivant d'une modification post-traductionnelle), les parvovirus dépendent largement des fonctions de la cellule hôte pour accomplir leur cycle réplicatif. Cette simplicité est par ailleurs à l'origine de l'intérêt que nous leur portons, puisque les propriétés oncosuppressives et oncolytiques des parvovirus sont généralement interprétées en termes de croissance opportuniste aux dépens de cellules-hôtes en division active. L'élucidation des mécanismes qui sous-tendent cette relation virus-hôte particulière nécessite donc l'étude de facteurs aussi bien viraux que cellulaires. Ceci pourrait expliquer que notre travail, amorcé initialement par l'étude d'un parvovirus bien défini {Minute Virus of, prototype strain [MVMp], soit "Petit Virus de la Souris, souche prototype"), se soit étendu à l'élucidation de la fonction et de la régulation de facteurs essentiellement cellulaires, aussi peu apparentés que la nucléoline (protéine majeure nucléolaire, comme son nom l'indique) et le chemin de transduction du signal qui mène de Ras à la Protéine Kinase dépendant de l'AMP cyclique (AMPc). L'hétérogénéité de l'Introduction qui suivra est donc nécessaire à la compréhension de tous les aspects traités par les études que nous présenterons par la suite.

1. LES PARVOVIRUS

A. Données virologiques

ffl Taxonomie

La famille des Parvoviridae constitue un groupe clairement distinct, puisque les parvovirus sont les seuls virus à ADN linéaire simple-brin. D'autres virus à ADN simple-brin existent dans différentes espèces mais ils possèdent tous un génome circulaire qui se réplique suivant une stratégie distincte de celle utilisée par les parvovirus. Les membres de la famille des Parvoviridae partagent également d'autres caractéristiques structurales, telles que la présence de palindromes terminaux nécessaires à le réplication du génome, la taille et la simplicité de leur capside (de forme icosaèdrique, non-enveloppée, 15 à 28 nm de diamètre) et leur stricte dépendance des fonctions de la cellule-hôte ou d'un virus aidant pour accomplir leur cycle réplicatif. Cette dépendance est une conséquence directe de la faible taille de leur génome (entre 4 et 6 kb) et du nombre réduit des protéines qu'il code. Le statut taxinomique des parvovirus est donc bien établi, et il a semblé pendant longtemps qu'il serait de même pour les trois genres de cette famille (voir plus bas).

Néanmoins, avec la compréhension de la biologie moléculaire de ces virus et la détermination de

15 la séquence primaire de leur génome, il est apparu que le système de classification officiel a ses limites. Néanmoins, le système alternatif proposé par K.I Berns (30) n'est pas encore adopté, et pour ce mémoire nous retiendrons et présenterons la taxonomie publiée en 1984 par le Comité International pour la Taxonomie des Virus (ICTV). Selon cette taxonomie, les genres sont définis sur base de leur hôte naturel (vertébrés pour les Parvovirus et les Dependovirus, invertébrés pour les Densovirus) et de la dépendance ou non de leur cycle réplicatif vis-à-vis de la présence d'un virus aidant. La subdivision de la famille des Parvoviridae selon ces critères génère trois genres :

- Les Densovirus (ou DNV pour Densonucleosis Virus) infectent les arthropodes, mais forment un ensemble plutôt hétérogène par leurs autres caractéristiques. Suite au développement récent de la propagation de ces virus en culture cellulaire, les premières données moléculaires commencent à paraître (315). Néanmoins, le degré de connaissance que nous avons de ces virus reste encore relativement faible.

- Les Dependovirus (appelés fréquemment AAV pour Adeno-Associated Virus, ou encore parvovirus défectifs) ont été initialement isolés comme contaminants de préparations d'Adénovirus. Ils ont longtemps été considérés comme dépendant de la présence d'un virus de type Adéno ou Herpès pour accomplir leur cycle réplicatif (49). Il est néanmoins clair aujourd'hui que les AAV peuvent se répliquer de façon autonome, c'est à dire en absence de tout virus aidant, à condition que des conditions de croissance particulières soient utilisées (341). En absence de virus aidant ou d'autre facteur cellulaire palliatif, le génome des Dependovirus peut s'intégrer à des sites spécifiques du génome de la cellule infectée et rester en état quiescent jusqu'à l'avènement de conditions favorables à la poursuite de son cycle réplicatif (168,274, 333).

- Les Parvovirus (ou parvovirus autonomes) regroupent par définition tous les membres de la famille qui de par leurs caractéristiques biologiques et structurales ne peuvent être classés dans aucun des deux premiers genres, c.à.d. les parvovirus de vertébrés pouvant se répliquer en l'absence de virus aidant. Il n'est pas surprenant que le besoin d'une classification plus élaborée se fasse sentir au sein de ce groupe. En effet, ses membres présentent des disparités aussi bien au niveau des protéines de capside que de la structure de leurs séquences palindromiques terminales et de leur organisation transcriptionnelle. Néanmoins, il existe à l'intérieur de ce genre des groupes de virus présentant un degré d'homogénéité élevé, comme MVMp (souris) et H-1 (rat ? homme ?) ou encore FPV (félins) et ses variants MEV, CPV et RPV qui infectent le vison, le chien et le ragondin respectivement .Comme nous le verrons plus loin, ces derniers virus ont évolué à partir du FPV à un moment relativement récent.

Le travail que nous présentons dans ce mémoire a été effectué sur le parvovirus autonome

MVMp. Ainsi, au cours des quelques pages d'introduction qui suivent, nous ne ferons référence

aux genres de Densovirus et Dependovirus que dans la mesure où cela facilitera la compréhension

des propriétés biologiques et moléculaires du genre des Parvovirus. La présentation que nous

ferons de ce dernier groupe ne se veut en aucun cas exhaustive, mais a pour but de faciliter la

lecture du travail que nous exposerons par la suite.

(in L'origine des Parvovirus

Sur base de séquences nucléotidiques de 4 parvovirus (MVM, H-1, AAV2 et Bombyx DNV), Bando et collaborateurs (17) ont établi un arbre phylogénétique pour les Parvoviridae. Ils ont suggéré que l'ordre de branchement au sein de cette famille suit celui de leurs organismes hôtes, ce qui supposerait une co-évolution virus-hôte. Cette caractéristique est reminiscente de la capacité des parvovirus de suivre l'évolution de leur cellule-hôte in vitro (261), mais il se peut que l'analogie observée avec l'arbre phylogénétique ne soit qu'une simple coïncidence.

Quant à l'origine des parvovirus, l'hypothèse dominante est que les différents éléments qui composent ces virus (origines de réplication, séquences palindromiques terminales, séquences régulatrices, gènes des protéines structurales et non-structurales) ont été excisés à partir de modules ancestraux différents, appartenant à leurs hôtes respectifs (314). Ces modules ancestraux ayant acquis des capacités parasitaires, ils auraient évolué de façon parallèle, mais suffisamment semblable pour que les différents virus qui en ont résulté puissent être regroupés au sein d'une même famille. Cette théorie rejoint et étend à des éléments génétiques tels que l'origine de réplication, celle énoncé par Gilbert (119) pour la corrélation "exon-domaine". L'hypothèse de l'évolution parallèle à partir de modules ancestraux différents pourrait expliquer la divergence des membres de cette famille au niveau de la structure des différents éléments viraux (forme et taille des palindromes, épissage des protéines...) et l'homogénéité observée au niveau de leurs fonctions.

(iii) Spectre d'hôte et pathogénicité

L'isolement des premiers parvovirus à la fin des années '50-début des années '60 a coïncidé avec l'utilisation croissante d'organes, tissus et de cultures de cellules animales dans la recherche biologique. De façon typique, ces virus ont été isolés à partir de tissus tumoraux humains après transplantation chez la souris (320), de cultures de cellules d'origines diverses (285) et comme contaminants de stocks d'adénovirus préparés sur de tels substrats (31). Les circonstances de l'isolement des parvovirus ont été à l'origine de nombreuses spéculations concernant leur rôle dans la formation de tumeurs; néanmoins, comme il est maintenant connu, les corrélations observées sont dues à la présence quasi-ubiquitaire de ces virus dans les populations de leurs hôtes naturels, à leur capacité de persister dans l'organisme infecté même en présence de réponse immunitaire aiguë, et surtout à leur dépendance vis-à-vis des fonctions fournies par la cellule en cours de division ou par un virus aidant, pour accomplir leur cycle réplicatif. Cette dernière caractéristique se traduit par deux propriétés typiques des parvovirus : la restriction du spectre d'hôte et l'oncotropisme (dont nous parlerons plus loin).

En effet, à quelques exceptions près, l'infection par les parvovirus est restreinte à une seule

espèce animale, ou tout au plus à des espèces animales proches au sein d'une même famille. Des

exceptions controversées à cette règle sont les virus HB et H-1. Concernant ce dernier, la

séropositivité atteint 80% de la population sauvage chez le rat, mais son isolement à partir de

tumeurs humaines (320) et la séropositivité d'une faible partie de la population humaine (3%)

17 suggèrent qu'il pourrait s'agir d'une zoonose, c.à.d. d'un virus animal, que sous des conditions propices peut se développer chez l'homme (286). Il existe néanmoins deux vrais exceptions à la restriction d'hôte des parvovirus. Il semble en effet que CPV (Canine Parvovirus, provoquant des myocardites et des entérites chez le chien) et MEV (Mink Enteritis Virus, une des menaces majeures pour les élevages de visons) soient des variants de FPV (Feline Parvovirus). Bien que les parvovirus puissent faire preuve d'une capacité d'adaptation à la cellule hôte dans le contexte d'une culture in vitro (261-263), la reproduction du même phénomène in vivo est difficilement concevable, puisque dans ce cas, les parvovirus infectant de façon endémique des élevages de chats (FPV), visons (MEV), porcins (PPV) pour ne citer que quelques exemples, se seraient depuis longtemps étendu à d'autres espèces, y compris l'homme. Il est donc probable que l'adaptation FPV/MEV/CPV ait eu lieu au sein d'une culture hétérologue infectée de façon accidentelle ou volontaire, comme il est souvent procédé pour la préparation de virus atténué, dans le but de la production d'un vaccin (322).

La pathogénicité restreinte induite par l'infection parvovirale reflète la même propriété fondamentale que la restriction du spectre d'hôte, en d'autres rnots, les exigences de ces virus quant à l'état de différenciation et de prolifération des cellules. En effet, à l'opposé d'autres virus à ADN, les parvovirus sont incapables d'induire la mitose dans la cellule qu'ils infectent et ne peuvent donc se répliquer que dans les cellules à haute activité mitotique. Ainsi, la majorité des pathologies en corrélation avec la présence de parvovirus concernent les tissus qui prolifèrent, principalement au cours de la période embryonnaire, néonatale et plus rarement adulte. La capacité des parvovirus à traverser la barrière placentaire et d'infecter l'embryon a été démontrée pour plusieurs membres de cette famille. L'infection in utero résulte généralement en la mort embryonnaire, suite à la résorption des tissus foetaux. L'inoculation de parvovirus durant les stades tardifs du développement peut être viable, mais induit de graves lésions cranio-faciales, accompagnées éventuellement d'hypoplasie cérébelleuse et d'entérite ou hépatite.

La relative quiescence de la majorité des tissus chez l'organisme adulte protège ce dernier des effets pathologiques de l'infection parvovirale. La plupart des tissus sensibles à l'infection parvovirale durant le stade embryonnaire ou néonatal, deviennent résistants chez l'adulte, à l'exception occasionnelle du tissu épithélial de l’intestin (FPV, CPV et MPV induisent des entérites aiguës qui peuvent être létales, (247, 248, 283)) et des lignées-souches du système hématopoïétique (B 19, le parvovirus humain qui est à l'origine de la cinquième maladie, peut provoquer des crises d'aplasie aiguë chez des sujets atteints d'anémie hémolytique, (316)). Par ailleurs, l'induction de la prolifération anormale de certains tissus suite à un traumatisme (hépatectomie, fracture des os) les rend sensibles à l'effet pathogène des parvovirus, qui peuvent ainsi interférer avec le processus de régénération. Enfin, les parvovirus interfèrent, et éventuellement suppriment un autre type de prolifération anormale, à savoir les néoplasies (260).

En règle générale, si la prolifération est un prérequis à l'accomplissement du cycle

parvoviral, le niveau de différenciation cellulaire semble également être déterminant. Ainsi, la

plupart des tissus prolifératifs chez l'adulte sont résistants à l'infection parvovirale, alors que des

cellules de tératocarcinome (tumeurs ressemblant par leurs propriétés au cellules embryonnaires

Synthèse des protéines virales 8-18 heures PI

FIGURE 1 : Le cycle lytique de MVMp.

Les étapes du cycle cellulaire sont définies en heures après infection (PI).

18 non-différenciées des premiers stades du développement) ne deviennent sensibles à l'effet lytique de MVM qu'après différenciation partielle en des cellules qui ressemblent aux fibroblastes (76).

C'est sans doute grâce à cette exigence des parvovirus quant à l'état de différenciation cellulaire que la majorité de ces derniers sont inoffensifs pour l'organisme adulte.

B. La Biologie moléculaire des parvovirus

Pour la plupart des virus, la production de descendance infectieuse requiert l'accomplissement d'un cycle lytique ou non, dont le but majeur est la production d'une quantité importante de génomes viraux et l'encapsidation de ces derniers en particules virales. Ceci implique en général l'adsorption des particules sur la surface de la cellule-hôte, l'internalisation des virions et la décapsidation du génome. Les étapes ultérieures du cycle sont en général contrôlées par l'expression d'au moins deux classes de gènes : ceux qui codent des fonctions requises pour la réplication (telles des polymérases) et ceux qui codent les composants structuraux des capsides.

L'expression de ces gènes est généralement modulée de façon quantitative et temporelle par une troisième classe de gènes régulateurs. A cet égard, les parvovirus sont semblables à la plupart des virus et codent pour les protéines de capside (VP) et aussi pour les protéines NS/Rep, qui jouent un rôle aussi bien au niveau de la réplication du génome viral (74, 323) que de la régulation de l'expression des gènes (256, 324). Dans les paragraphes qui suivent nous aborderons dans l'ordre chronologique les aspects moléculaires du déroulement du cycle des parvovirus autonomes (voir Figure 1) et adéno-associés. Nous nous intéresserons plus particulièrement aux étapes intracellulaires du cycle viral, qui sont susceptibles d'être modulées par l'état prolifératif et transformé de la cellule.

(il Adsorption. pénétration et décapsidation des particules parvovirales

L'infection productive est initiée par l'adsorption du virion sur des récepteurs de la surface

de la cellule. En ce qui concerne la majorité des parvovirus, la nature exacte de ces récepteurs est

inconnue. Néanmoins, un travail récent identifie à l'antigène P des érythrocytes (un tetrahéxoside

de ceramide appelé globoside) le récepteur de B19 (45). Contrairement à ce qui est observé pour

B19, le pré-traitement des cellules avec de la neuramidinase ou de la trypsine inhibe l'adsorption

de MVM (311), ce qui suggère que des résidus d'acide N-acetyl neuraminique sont des composants

essentiels de son récepteur et que les signaux reconnus contiennent ou sont exposés sur un support

polypeptidique. Il n'est néanmoins pas clair que les récepteurs pour un sérotype donné de virus

sont d'une seule espèce moléculaire, ou des protéines différentes ayant en commun des chaînes de

carbohydrates spécifiques, comme le suggère le nombre élevé de récepteurs reconnus par MVM

(10^ à 5.1Q5 sites spécifiques par cellule) (186,296). Malgré l'abondance relative de récepteurs sur

la surface des cellules cibles, leur présence semble être dépendante de l'état de différenciation,

puisque certains types cellulaires (tels les lignées lymphocytaires B) n'en possèdent pas et sont

totalement résistantes à l'infection par MVM (296). Il n'en est pas de même pour les dependovirus

qui s'adsorbent et pénètrent dans tous les types cellulaires étudiés à ce jour. De plus, leur ADN génomique est toujours retrouvé dans les noyaux, ce qui suggère que la régulation de la permissivité aux AAV ne se fait pas au niveau de la pénétration, de la nucléarisation, ou de la décapsidation du génome (57).

Nous connaissons peu de choses sur ces trois étapes précoces du cycle parvoviral. Cette méconnaissance concerne plus particulièrement l'étape de pénétration du virus au travers de la membrane cytoplasmique. Contrairement aux virus enveloppés, les parvovirus ne sont pas capables de fusionner avec la membrane cellulaire suite à une chute de pH, même si la présence de groupements hydrophobes à l'extérieur de la capside semble le suggérer. Le mécanisme fait probablement intervenir l'internalisation du complexe récepteur-virion, mais aucune donnée n'a été établie dans ce sens. Quant à la nucléarisation, des études effectuées sur des parvovirus autonomes révèlent l'existence d'une séquence riche en proline à l'extrémité amino-terminale de la protéine de capside VP-1. Cette séquence ressemble au signal de nucléarisation de l'antigène grand T de SV40 (151), mais son rôle reste à démontrer. Enfin, en ce qui concerne la décapsidation, des expériences effectuées in vitro semblent indiquer qu'elle aurait lieu suite à la diminution des interactions ioniques au sein de la capside (42). L'ADN de MVM reste accroché à cette dernière, et il est possible que les premières étapes de la réplication du génome viral aient lieu au sein de ce complexe nucléoprotéique. Contrairement à ce qui a été observé pour les dependovirus, ces étapes précoces du cycle des parvovirus autonomes peuvent être modulées dans différents types cellulaires, ce qui constitue à la fois une motivation et un outil pouvant mener à l'élucidatiort des principes moléculaires qui les sous-tendent.

Après l'étape de décapsidation, le cycle des AAV diverge de celui des parvovirus autonomes. Ce dernier est presque toujours lytique (nous l'aborderons en détail plus loin), alors que celui des AAV présente généralement une phase de latence. En l'absence de virus aidant, plusieurs copies du génome des AAV s'intégrent en tandem dans l'ADN de la cellule-hôte (57).

L'abondance des modèles visant à expliquer le mécanisme de cette intégration montre clairement

que ce dernier reste largement incompris . Ce qui semble être certain est que l'intégration se fait à

des sites bien spécifiques du génome cellulaire dont la localisation est encore sujette à discussion :

le chromosome 19 pour certains (168), le chromosome 17 pour d'autres (333). En tous cas,

l'intégration dans le génome cellulaire est stable à long terme, et dans au moins un cas (82) il a

clairement été démontré que les AAV peuvent se transmettre de façon verticale (c.à.d. par les

lignées germinales). La surinfection par un virus aidant (de type adénovirus, herpès ou vaccine) ou

encore le traitement par des carcinogènes chimiques ou des radiations dans certains cas (278,279)

réactive le cycle viral. Il s'en suit l'excision du génome (les extrémités palindromiques semblent

jouer un rôle dans ce phénomène (272,273) mais le mécanisme exact reste de nouveau inconnu) et

la réplication selon un schéma qui par son principe ressemble fortement à celui suivi par les

parvovirus autonomes, et que nous exposerons dans les paragraphes qui suivent.

20 (in Réplication du génome parvoviral

a) Structure du génome

Les virions de parvovirus contiennent une copie unique d'une molécule d'ADN linéaire d'environ 5 kb de longueur, composée d'une région simple-brin codante (comprenant environ 90%

du génome) flanquée de régions palindromiques plus courtes, capables de former des structures en

"épingle à cheveux". Le brin emballé peut être préférentiellement d'une polarité (invariablement le complémentaire de la séquence de l'ARNm, c'est le cas de la plupart des parvovirus autonomes) ou un mélange de brins des deux polarités emballés dans des virions séparés (dans les cas des Dependovirus, Densovirus et de B19).

Le problème posé par la linéarité du génome (toutes les ADN polymérases ont besoin d'une amorce pour exercer leur activité princeps) est résolu dans le cas des parvovirus par la présence des régions palindromiques. Tous les parvovirus analysés à ce jour contiennent des séquences pouvant former des structures en "épingle à cheveux" stables, aussi bien à l'extrémité 3' que 5'. Le rôle essentiel de ces structures pendant le processus réplicatif est souligné par la forte pression de sélection visant à conserver cette région chez les différents membres de la famille. Dans le cas des Dependovirus, Densovirus et B19, des séquences palindromiques identiques sont présentes aux deux extrémités sous forme inversée (on parle de Inverted Terminal Repeat, ITR) (9, 222, 298).

Les parvovirus autonomes au contraire, possèdent des séquences uniques en 3' et 5' (respectivement 115 et 207 nt pour MVMp). Cette divergence au niveau de la structure, se traduit par des variations au niveau du mécanisme de réplication et conduit aux différences de polarité des génomes encapsidés par la descendance virale, que nous avons décrites plus haut (310). Les palindromes parvoviraux possèdent également des structures complémentaires internes. Comme nous pouvons le voir dans la Figure 3, 103 des 115 premiers nucléotides de MVM peuvent s'apparier pour former une structure en "oreilles de lapin". Il semble que la contrainte à la dérive génétique implique la conservation de cette structure globale, et non pas une exigence absolue quant à la séquence primaire de cette région.

Des études enzymatiques ont montré que les extrémités palindromiques 5' de différents parvovirus autonomes peuvent se trouver sous deux formes alternatives appelées "flip" et "flop" . Des inversions de séquence de ce type sont également présentes aux deux extrémités des AAV , mais sont absentes des extrémités 3' des parvovirus autonomes. Ces inversions de séquence sont apparentes uniquement grâce à la présence de petites asymétries dans ces palindromes autrement parfaitement appariés. Leur signification physiologique n'est pas encore claire, mais les modèles proposés pour décrire le mécanisme de réplication des parvovirus se doivent d'en tenir compte.

b) Modèles pour la réplication de l'ADN parvoviral

Le modèle retenu aujourd'hui pour la réplication des parvovirus a été introduit pour ses

lignes principales vers le milieu des années '70 (313). Depuis, des études moléculaires effectuées

Les séquences 3' et 5' terminales du génome monocatenaire sont respectivement désignées par les lettres A-B et E-F-G. Les majuscules et minuscules correspondantes marquent des séquences complémentaires.

Les lignes épaisses représentent l'ADN néosynthétisé, et la flèche le sens de l'élongation. Le palindrome

3' est représenté à gauche (ABa). VP^r et VPtog, brin viral parental et fils respect!vemen; C, brin

complémentaire. Pour la description et références, voir le texte.

21 sur les différentes formes de l'ADN parvoviral aussi bien in vitro que in vivo ont ajouté plus de détails au modèle initial, qui reste néanmoins à la base de celui proposé par Astell et collaborateurs en 1985 (10). Ce modèle, faisant intervenir le "déplacement d'une structure en épingle à cheveux"

{rolling hairpin) rend compte de la plupart des formes réplicatives observées et de l'hétérogénéité du palindrome 5'-terminal (séquences "flip" et "flop"). Néanmoins, les auteurs supposent l'existence d'intermédiaires transitoires qui n'ont jamais été observés à ce jour, et postulent un certain nombre de ligations et de coupures simple-brin ("nicks ") qui sont aussi peu élucidées que les enzymes et protéines auxiliaires impliquées. Un ensemble quasiment infini de variations sur le mécanisme initial pourrait donc être proposé, mais nous nous limiterons ici à la description du modèle minimal tel qu'il a été énoncé par Astell et collaborateurs et mis à jour par Tattersall et collaborateurs (Figure 2) (310).

En bref, l'extrémité 3' du génome viral sert d'auto-amorce pour la synthèse du brin

complémentaire. L'ADN est ainsi converti en une forme réplicative (RF) double-brin

monomérique fermée de façon covalente à l'extrémité gauche (3'). Cette étape est probablement

suivie de la ligation des extrémités 3' et 5' [étape 2] et de la coupure du brin complémentaire 18

nucléotides en amont du site de ligation [3]. Cette dernière étape est catalysée par une activité

enzymatique qui semble impliquer la protéine NSI (pour les parvovirus autonomes) ou Rep 68

(pour les AAV) (77,293). Par ailleurs, ces protéines restent fixées à la nouvelle extrémité 5' ainsi

créée. Bien que les sites de coupure postulés par le modèle de la réplication des AAV soient

différents de ceux décrits pour les parvovirus autonomes, les activités "nickase" des deux protéines

sont interchangeables, comme l'indiquent des expériences de complémentation effectuées in vitro

(J. Schlehofer, communication personnelle). L'extrémité -OH 3' créée par cette coupure sert

ensuite d'amorce pour la synthèse du brin complémentaire et le déplacement simultané du

palindrome 5' [4, 5]. Ce déplacement engendre une forme réplicative monomérique (RFI) portant

une séquence de 18 nucléotides supplémentaires (notée e) à une extrémité. A l'étape 6, se forme

une structure en "oreilles de lapin", qui sert d'amorce à une nouvelle synthèse par déplacement de

brin [7] pour engendrer une forme dimérique [8], dans laquelle les deux extrémités 3' des brins

viraux se superposent au centre d'une molécule linéaire double-brin {"dimer bridge"), alors que les

palindromes 5' se retrouvent aux extrémités. Ensuite, la répétition des étapes 4 à 8 peut engendrer

des formes tétramériques dont les deux extrémités sont reliées par une forme linéaire de l'extrémité

5' virale Ç'tetramer bridge"). Pour des raisons de simplicité de présentation, nous ne détaillerons

pas le mécanisme qui permet le passage des tétramères aux formes dimériques. Les séquences des

ponts tétramères étant les mêmes que celles des palindromes 5', le mécanisme qui permettrait leur

résolution serait identique. Quant aux ponts dimères (constitués par les palindromes 3'), leur

ouverture doit se faire de façon à conserver une seule orientation à l'extrémité 3' des brins de la

descendance virale. Les auteurs du modèle proposent qu'une brèche est introduite dans le brin viral

parental par une enzyme ayant une activité topoïsomérase [étape 9]. Comme il est crucial que cette

coupure se fasse au niveau du brin parental uniquement (et non pas sur le brin viral néosynthétisé,

faute de quoi les extrémités ainsi engendrées auraient les deux orientations possibles), les auteurs

proposent que la préférence de brin pourrait être déterminée par l'asymétrie qui résulte de

l'existence de nucléotides mésappariés dans le centre du palindrome. L'extrémité 3' engendrée par la coupure serait ensuite utilisée pour l'extension du brin parental viral dans la direction 5' vers 3', avec déplacement du palindrome 3' (maintenant associé au brin complémentaire [étape 10]). Les auteurs postulent que la "nickase" reste associée à l'extrémité 5' de la brèche pendant que le palindrome se reforme et jusqu'à ce qu'elle rencontre sur le brin viral néosynthétisé une séquence de reconnaissance (marquée X). A ce moment, aurait lieu une deuxième coupure sur le brin viral néosynthétisé, suivie d'une soudure pour former une épingle à cheveux complète ([11], molécule de droite), alors que la nickase serait transférée sur l'extrémité 5' du brin complémentaire ([11], monomère de gauche). Ce modèle rend compte du rapport 1:1 entre les molécules monomères à extrémités ouvertes et fermées, et de l'existence d'une seule orientation du palindrome 3'.

A ce stade, les molécules telles que le produit de droite de l'étape 11 peuvent se réinsérer dans le cycle réplicatif, comme le montre la longue flèche à droite de la Figure 2. Un résultat important de cette boucle est la production de deux formes de brins viraux fils, de séquence FGf et Fgf ("flip" et "flop") à leur extrémité 5', et la conservation d'une seule séquence à l'extrémité 3'.

Les molécules telles que celle qui est montrée à droite de l'étape 11 peuvent soit recommencer le cycle réplicatif en formant des "oreilles de lapin" à chacune des extrémités, soit produire des génomes viraux destinés à être emballés, comme le montre l'étape 12. Le mécanisme exact des dernières étapes précédant l'encapsidation des brins viraux n'est pas élucidé, mais il se pourrait qu'une "nickase" spécifique introduise une coupure 18 nt à l'intérieur du brin viral. Les 18 nucléotides restants serviraient d'amorce à la synthèse de brins viraux de la descendance, qui seraient encapsidés quasi simultanément, grâce à la présence de la protéine NS 1 associée de façon covalente à l'extrémité 5' (77, 79). Cette protéine reste associée à l'ADN viral et en dehors de la coque protéique après formation du virion (78, 97). Néanmoins, elle ne joue pas de rôle prépondérant au cours de l'infection et serait éliminée au cours des processus de maturation ultérieurs.

Astell et collaborateurs ont proposé que les différentes "nickases" et topoïsomérases évoquées dans ce modèle (T rond et T carré) seraient la même protéine (10). La raison majeure pour ceci est la présence de courtes séquences répétées (ACCAAC et CTATTCA) près des sites de clivage putatifs. Puisque le mécanisme proposé pour la réplication des extrémités 3' de l'ADN viral requiert que l'enzyme se lie au brin parental plutôt qu'au brin viral, les auteurs évoquent le contrôle différentiel par des séquences proches de ces motifs conservés. En effet, six bases en amont de la séquence ACCAAC du brin viral, se trouve la séquence GAA, alors que dans le brin néosynthétisé, celle-ci est remplacée par TC. A l'extrémité 5', la séquence GAA est de nouveau présente et permet donc la reconnaissance par la topoïsomérase. En outre, des données plus récentes suggèrent fortement que l'activité topoïsomérase impliquerait les protéines virales NSl/Rep68 (77, 293).

Dans le cas des AAV, les deux palindromes ont des séquences similaires, les séquences voisines des deux sites potentiels de coupure sont identiques et la "nickase" pourrait reconnaître aussi bien le brin parental que le brin néosynthétisé. Ceci engendre des isomorphes "flip" et "flop"

aux extrémités 5' et 3' avec une efficacité égale. De même, le signal de l'encapsidation étant porté

par les palindromes terminaux et les protéines qui s'y associent, des virus tels que les AAV ou B19 ayant des extrémités identiques encapsident avec une fréquence égale les deux brins.

23

c) Régulation par des facteurs viraux ou cellulaires

La réplication de l'ADN viral passe par trois phases distinctes : synthèse du brin complémentaire parental, amplification des formes d'ADN double-brin, et production suivie d'encapsidation des molécules d'ADN simple-brin de la descendance virale. De ces trois étapes, la première semble être relativement précoce (2 à 6h après infection dans des cellules partiellement synchronisées) et dépend de facteurs exprimés préférentiellement durant la phase S du cycle cellulaire (311). Les étapes ultérieures qui requièrent la présence des protéines virales NS sont relativement tardives (le pic de la réplication se trouve après 30 h p.i.) (310).

L'identification des autres acteurs participant au processus de réplication du génome a initialement été effectuée sur les AAV, principalement grâce à l'efficacité de transfection obtenue avec les clones moléculaires de ces virus. Les palindromes terminaux sont requis (143) et servent probablement d'origine de réplication, de site de reconnaissance pour les protéines virales NS/Rep et pour des facteurs cellulaires en grande partie inconnus (8, 148). Des travaux de l'équipe de P.

Tattersall (communication personnelle) suggèrent l'implication possible de facteurs de la famille ATF/CREB dans le processus de résolution des ponts dimères (extrémités 3' du génome de MVM).

Par ailleurs, des protéines Rep68/78 (AAV) mutées dans le domaine de reconnaissance de l'ATP sont capables de se fixer sur les séquences palindromiques, mais incapables d'activer la réplication comme le font les protéines sauvages (235, 236). L'importance de ce domaine a également été démontrée pour les protéines NSI des parvovirus H-1 (183) et MVM (288). Les autres protéines non-structurales des AAV (Rep 50/42) ne semblent requises que pour les étapes ultérieures de la réplication car leur absence n'entrave pas le démarrage du cycle réplicatif mais inhibe l'accumulation de l'ADN simple-brin de la descendance (61). Enfin, en ce qui concerne les AAV, il semble que des facteurs codés par le génome des virus aidants soient impliqués dans le processus réplicatif (notamment les produits E4 et ElB de l'adénovirus) (58). Néanmoins, il n'est pas encore clair si ces protéines agissent directement sur le cycle viral ou si elles induisent simplement les facteurs cellulaires appropriés.

En tous cas, pour les parvovirus autonomes aussi bien que pour les Dependovirus, la

réplication de l'ADN semble être largement fondée sur l'activité de facteurs cellulaires. Ainsi, la

topoïsomérase I est requise pour la réplication du parvovirus H-1, et son activité semble être

stimulée au cours de l'infection par ce dernier (127) Par ailleurs, différents travaux effectués aussi

bien in vivo que in vitro suggèrent l'implication de l'ADN-polymérase a (167) ou y (166, 259) dans

le cycle de la réplication parvovirale.

0 lo'oo 20'00 30'00 40'00 5000 nucléotides

3 ' 10 ---

[H>

W>

as' ADN

AA/ AA/ (3^ kb) ARNm

AA/

NSI UZ NS 2 Q]

VPl VP 2

□0 D^2

3-^nii I

(84 kDa) (25 kDa) (83 kDa) (64 kDa)

Protéines

FIGURE 3 : Organisation génomique de MVMp.

La taille du génome est donnée en nucléotides et unités génomiques (u.g.).

Les boites □ représentent les palindromes terminaux. A/\j , séquence

de polyadénylation. Les chiffres dans les cadres ouverts de lecture des

protéines sont les phases employées lors de la traduction.

24 Ciü') Transcription des gènes parvoviraux

Les parvovirus ont des génomes relativement petits (environ 5 kb) et utilisent leur ADN avec beaucoup de parcimonie. Ils exploitent des séquences superposées et différents cadres de lecture pour exprimer les ARN messagers codant les protéines structurales et non structurales, dans des rapports molaires précis et dans un ordre temporel défini. Bien que le mécanisme détaillé de cette régulation diffère parmi les membres de la famille, leur organisation génomique est essentiellement identique. Dans le chapitre qui suit, nous aborderons en premier lieu l'organisation génomique des parvovirus autonomes et des dependovirus. Nous discuterons ensuite la régulation de la transcription par des facteurs cellulaires et les mécanismes par lesquels le virus contrôle temporellement l'expression de ses différents produits.

a) Organisation génomique

Chez les parvovirus connus à ce jour, la totalité des régions codantes se trouve sur un des deux brins (appelé par convention brin positif). Le brin encapsidé par la plupart des parvovirus autonomes est le brin négatif, il semble néanmoins que les premières étapes de la réplication parvovirale (synthèse de la forme réplicative monomère) se fassent de façon précoce, et que les molécules double-brin servent de matrice transcriptionnelle (73). On se rapportera à la Figure 3 qui illustre l'organisation génomique de MVM. La moitié "gauche" du génome (extrémité 3' du brin viral) porte des séquences codant les protéines non-structurales (NS) qui contrôlent le déroulement des différentes étapes du cycle viral. Chez les parvovirus autonomes, un seul promoteur (P4 pour MVM) situé entre 4 et 6 unités génomiques (1 u.g. : 1% de la longueur totale du génome) dirige l'expression d'un ARN génomique, rapidement épissé en deux ARN messagers majeurs (RI et R2, dont les tailles sont respectivement 4,8 et 33 kb chez MVM). RI porte les séquences codant la protéine NSI d'un poids moléculaire apparent de 83 kDa.

L'épissage du grand intron (entre les nucléotides 515 et 1990 chez MVM) produit l'ARNm R2, à partir duquel est traduite la protéine NS2 (25 kDa pour MVM, jamais observée dans la famille des virus FPV-CPV-RPV-MEV). NS2 partage avec NSI les 84 aa N-terminaux. Le site donneur d'épissage utilisé contient un consensus relativement défavorable, et il n'est pas encore expliqué pourquoi la machinerie d'épissage n'utilise pas l'un ou l'autre des trois sites donneurs situés en amont (281), et par quel mécanisme ce site d'epissage défavorable fonctionne de manière efficace (puisque R2 s'accumule plus rapidement que RI). Il serait intéressant d'élucider les facteurs qui déterminent cette balance qui pourrait être critique pour le cours de l'infection, puisqu'elle influence le rapport molaire entre les différentes protéines régulatrices.

Outre le grand intron, les ARNm sont également épissés autour des bases 2300-2400 (petit intron). Deux sites donneurs (nt 2280 et 2317 pour MVM) et deux sites accepteurs (nt 2377 et 2399) potentiels ont été détectés (12, 245). Parmi les quatre combinaisons théoriquement possibles, seules trois ont été mises en évidence dans les ARNm, en des proportions variées (215).

L'absence de la forme intronique 2317-2377 pourrait être expliquée par la difficulté d'épisser un