Pour la plupart des virus, la production de descendance infectieuse requiert
l'accomplissement d'un cycle lytique ou non, dont le but majeur est la production d'une quantité
importante de génomes viraux et l'encapsidation de ces derniers en particules virales. Ceci
implique en général l'adsorption des particules sur la surface de la cellule-hôte, l'internalisation des
virions et la décapsidation du génome. Les étapes ultérieures du cycle sont en général contrôlées
par l'expression d'au moins deux classes de gènes : ceux qui codent des fonctions requises pour la
réplication (telles des polymérases) et ceux qui codent les composants structuraux des capsides.
L'expression de ces gènes est généralement modulée de façon quantitative et temporelle par une
troisième classe de gènes régulateurs. A cet égard, les parvovirus sont semblables à la plupart des
virus et codent pour les protéines de capside (VP) et aussi pour les protéines NS/Rep, qui jouent un
rôle aussi bien au niveau de la réplication du génome viral (74, 323) que de la régulation de
l'expression des gènes (256, 324). Dans les paragraphes qui suivent nous aborderons dans l'ordre
chronologique les aspects moléculaires du déroulement du cycle des parvovirus autonomes (voir
Figure 1) et adéno-associés. Nous nous intéresserons plus particulièrement aux étapes
intracellulaires du cycle viral, qui sont susceptibles d'être modulées par l'état prolifératif et
transformé de la cellule.
(il Adsorption. pénétration et décapsidation des particules parvovirales
L'infection productive est initiée par l'adsorption du virion sur des récepteurs de la surface
de la cellule. En ce qui concerne la majorité des parvovirus, la nature exacte de ces récepteurs est
inconnue. Néanmoins, un travail récent identifie à l'antigène P des érythrocytes (un tetrahéxoside
de ceramide appelé globoside) le récepteur de B19 (45). Contrairement à ce qui est observé pour
B19, le pré-traitement des cellules avec de la neuramidinase ou de la trypsine inhibe l'adsorption
de MVM (311), ce qui suggère que des résidus d'acide N-acetyl neuraminique sont des composants
essentiels de son récepteur et que les signaux reconnus contiennent ou sont exposés sur un support
polypeptidique. Il n'est néanmoins pas clair que les récepteurs pour un sérotype donné de virus
sont d'une seule espèce moléculaire, ou des protéines différentes ayant en commun des chaînes de
carbohydrates spécifiques, comme le suggère le nombre élevé de récepteurs reconnus par MVM
(10^ à 5.1Q5 sites spécifiques par cellule) (186,296). Malgré l'abondance relative de récepteurs sur
la surface des cellules cibles, leur présence semble être dépendante de l'état de différenciation,
puisque certains types cellulaires (tels les lignées lymphocytaires B) n'en possèdent pas et sont
totalement résistantes à l'infection par MVM (296). Il n'en est pas de même pour les dependovirus
qui s'adsorbent et pénètrent dans tous les types cellulaires étudiés à ce jour. De plus, leur ADN
génomique est toujours retrouvé dans les noyaux, ce qui suggère que la régulation de la
permissivité aux AAV ne se fait pas au niveau de la pénétration, de la nucléarisation, ou de la
décapsidation du génome (57).
Nous connaissons peu de choses sur ces trois étapes précoces du cycle parvoviral. Cette
méconnaissance concerne plus particulièrement l'étape de pénétration du virus au travers de la
membrane cytoplasmique. Contrairement aux virus enveloppés, les parvovirus ne sont pas
capables de fusionner avec la membrane cellulaire suite à une chute de pH, même si la présence de
groupements hydrophobes à l'extérieur de la capside semble le suggérer. Le mécanisme fait
probablement intervenir l'internalisation du complexe récepteur-virion, mais aucune donnée n'a été
établie dans ce sens. Quant à la nucléarisation, des études effectuées sur des parvovirus autonomes
révèlent l'existence d'une séquence riche en proline à l'extrémité amino-terminale de la protéine de
capside VP-1. Cette séquence ressemble au signal de nucléarisation de l'antigène grand T de SV40
(151), mais son rôle reste à démontrer. Enfin, en ce qui concerne la décapsidation, des expériences
effectuées in vitro semblent indiquer qu'elle aurait lieu suite à la diminution des interactions
ioniques au sein de la capside (42). L'ADN de MVM reste accroché à cette dernière, et il est
possible que les premières étapes de la réplication du génome viral aient lieu au sein de ce
complexe nucléoprotéique. Contrairement à ce qui a été observé pour les dependovirus, ces étapes
précoces du cycle des parvovirus autonomes peuvent être modulées dans différents types
cellulaires, ce qui constitue à la fois une motivation et un outil pouvant mener à l'élucidatiort des
principes moléculaires qui les sous-tendent.
Après l'étape de décapsidation, le cycle des AAV diverge de celui des parvovirus
autonomes. Ce dernier est presque toujours lytique (nous l'aborderons en détail plus loin), alors
que celui des AAV présente généralement une phase de latence. En l'absence de virus aidant,
plusieurs copies du génome des AAV s'intégrent en tandem dans l'ADN de la cellule-hôte (57).
L'abondance des modèles visant à expliquer le mécanisme de cette intégration montre clairement
que ce dernier reste largement incompris . Ce qui semble être certain est que l'intégration se fait à
des sites bien spécifiques du génome cellulaire dont la localisation est encore sujette à discussion :
le chromosome 19 pour certains (168), le chromosome 17 pour d'autres (333). En tous cas,
l'intégration dans le génome cellulaire est stable à long terme, et dans au moins un cas (82) il a
clairement été démontré que les AAV peuvent se transmettre de façon verticale (c.à.d. par les
lignées germinales). La surinfection par un virus aidant (de type adénovirus, herpès ou vaccine) ou
encore le traitement par des carcinogènes chimiques ou des radiations dans certains cas (278,279)
réactive le cycle viral. Il s'en suit l'excision du génome (les extrémités palindromiques semblent
jouer un rôle dans ce phénomène (272,273) mais le mécanisme exact reste de nouveau inconnu) et
la réplication selon un schéma qui par son principe ressemble fortement à celui suivi par les
parvovirus autonomes, et que nous exposerons dans les paragraphes qui suivent.
20
(in Réplication du génome parvoviral
a) Structure du génome
Les virions de parvovirus contiennent une copie unique d'une molécule d'ADN linéaire
d'environ 5 kb de longueur, composée d'une région simple-brin codante (comprenant environ 90%
du génome) flanquée de régions palindromiques plus courtes, capables de former des structures en
"épingle à cheveux". Le brin emballé peut être préférentiellement d'une polarité (invariablement le
complémentaire de la séquence de l'ARNm, c'est le cas de la plupart des parvovirus autonomes) ou
un mélange de brins des deux polarités emballés dans des virions séparés (dans les cas des
Dependovirus, Densovirus et de B19).
Le problème posé par la linéarité du génome (toutes les ADN polymérases ont besoin d'une
amorce pour exercer leur activité princeps) est résolu dans le cas des parvovirus par la présence
des régions palindromiques. Tous les parvovirus analysés à ce jour contiennent des séquences
pouvant former des structures en "épingle à cheveux" stables, aussi bien à l'extrémité 3' que 5'. Le
rôle essentiel de ces structures pendant le processus réplicatif est souligné par la forte pression de
sélection visant à conserver cette région chez les différents membres de la famille. Dans le cas des
Dependovirus, Densovirus et B19, des séquences palindromiques identiques sont présentes aux
deux extrémités sous forme inversée (on parle de Inverted Terminal Repeat, ITR) (9, 222, 298).
Les parvovirus autonomes au contraire, possèdent des séquences uniques en 3' et 5'
(respectivement 115 et 207 nt pour MVMp). Cette divergence au niveau de la structure, se traduit
par des variations au niveau du mécanisme de réplication et conduit aux différences de polarité des
génomes encapsidés par la descendance virale, que nous avons décrites plus haut (310). Les
palindromes parvoviraux possèdent également des structures complémentaires internes. Comme
nous pouvons le voir dans la Figure 3, 103 des 115 premiers nucléotides de MVM peuvent
s'apparier pour former une structure en "oreilles de lapin". Il semble que la contrainte à la dérive
génétique implique la conservation de cette structure globale, et non pas une exigence absolue
quant à la séquence primaire de cette région.
Des études enzymatiques ont montré que les extrémités palindromiques 5' de différents
parvovirus autonomes peuvent se trouver sous deux formes alternatives appelées "flip" et "flop" .
Des inversions de séquence de ce type sont également présentes aux deux extrémités des AAV ,
mais sont absentes des extrémités 3' des parvovirus autonomes. Ces inversions de séquence sont
apparentes uniquement grâce à la présence de petites asymétries dans ces palindromes autrement
parfaitement appariés. Leur signification physiologique n'est pas encore claire, mais les modèles
proposés pour décrire le mécanisme de réplication des parvovirus se doivent d'en tenir compte.
b) Modèles pour la réplication de l'ADN parvoviral
Le modèle retenu aujourd'hui pour la réplication des parvovirus a été introduit pour ses
lignes principales vers le milieu des années '70 (313). Depuis, des études moléculaires effectuées
Les séquences 3' et 5' terminales du génome monocatenaire sont respectivement désignées par les lettres
A-B et E-F-G. Les majuscules et minuscules correspondantes marquent des séquences complémentaires.
Les lignes épaisses représentent l'ADN néosynthétisé, et la flèche le sens de l'élongation. Le palindrome
3' est représenté à gauche (ABa). VP^r et VPtog, brin viral parental et fils respect!vemen; C, brin
complémentaire. Pour la description et références, voir le texte.
21
sur les différentes formes de l'ADN parvoviral aussi bien in vitro que in vivo ont ajouté plus de
détails au modèle initial, qui reste néanmoins à la base de celui proposé par Astell et collaborateurs
en 1985 (10). Ce modèle, faisant intervenir le "déplacement d'une structure en épingle à cheveux"
{rolling hairpin) rend compte de la plupart des formes réplicatives observées et de l'hétérogénéité
du palindrome 5'-terminal (séquences "flip" et "flop"). Néanmoins, les auteurs supposent
l'existence d'intermédiaires transitoires qui n'ont jamais été observés à ce jour, et postulent un
certain nombre de ligations et de coupures simple-brin ("nicks ") qui sont aussi peu élucidées que
les enzymes et protéines auxiliaires impliquées. Un ensemble quasiment infini de variations sur le
mécanisme initial pourrait donc être proposé, mais nous nous limiterons ici à la description du
modèle minimal tel qu'il a été énoncé par Astell et collaborateurs et mis à jour par Tattersall et
collaborateurs (Figure 2) (310).
En bref, l'extrémité 3' du génome viral sert d'auto-amorce pour la synthèse du brin
complémentaire. L'ADN est ainsi converti en une forme réplicative (RF) double-brin
monomérique fermée de façon covalente à l'extrémité gauche (3'). Cette étape est probablement
suivie de la ligation des extrémités 3' et 5' [étape 2] et de la coupure du brin complémentaire 18
nucléotides en amont du site de ligation [3]. Cette dernière étape est catalysée par une activité
enzymatique qui semble impliquer la protéine NSI (pour les parvovirus autonomes) ou Rep 68
(pour les AAV) (77,293). Par ailleurs, ces protéines restent fixées à la nouvelle extrémité 5' ainsi
créée. Bien que les sites de coupure postulés par le modèle de la réplication des AAV soient
différents de ceux décrits pour les parvovirus autonomes, les activités "nickase" des deux protéines
sont interchangeables, comme l'indiquent des expériences de complémentation effectuées in vitro
(J. Schlehofer, communication personnelle). L'extrémité -OH 3' créée par cette coupure sert
ensuite d'amorce pour la synthèse du brin complémentaire et le déplacement simultané du
palindrome 5' [4, 5]. Ce déplacement engendre une forme réplicative monomérique (RFI) portant
une séquence de 18 nucléotides supplémentaires (notée e) à une extrémité. A l'étape 6, se forme
une structure en "oreilles de lapin", qui sert d'amorce à une nouvelle synthèse par déplacement de
brin [7] pour engendrer une forme dimérique [8], dans laquelle les deux extrémités 3' des brins
viraux se superposent au centre d'une molécule linéaire double-brin {"dimer bridge"), alors que les
palindromes 5' se retrouvent aux extrémités. Ensuite, la répétition des étapes 4 à 8 peut engendrer
des formes tétramériques dont les deux extrémités sont reliées par une forme linéaire de l'extrémité
5' virale Ç'tetramer bridge"). Pour des raisons de simplicité de présentation, nous ne détaillerons
pas le mécanisme qui permet le passage des tétramères aux formes dimériques. Les séquences des
ponts tétramères étant les mêmes que celles des palindromes 5', le mécanisme qui permettrait leur
résolution serait identique. Quant aux ponts dimères (constitués par les palindromes 3'), leur
ouverture doit se faire de façon à conserver une seule orientation à l'extrémité 3' des brins de la
descendance virale. Les auteurs du modèle proposent qu'une brèche est introduite dans le brin viral
parental par une enzyme ayant une activité topoïsomérase [étape 9]. Comme il est crucial que cette
coupure se fasse au niveau du brin parental uniquement (et non pas sur le brin viral néosynthétisé,
faute de quoi les extrémités ainsi engendrées auraient les deux orientations possibles), les auteurs
proposent que la préférence de brin pourrait être déterminée par l'asymétrie qui résulte de
l'existence de nucléotides mésappariés dans le centre du palindrome. L'extrémité 3' engendrée par
la coupure serait ensuite utilisée pour l'extension du brin parental viral dans la direction 5' vers 3',
avec déplacement du palindrome 3' (maintenant associé au brin complémentaire [étape 10]). Les
auteurs postulent que la "nickase" reste associée à l'extrémité 5' de la brèche pendant que le
palindrome se reforme et jusqu'à ce qu'elle rencontre sur le brin viral néosynthétisé une séquence
de reconnaissance (marquée X). A ce moment, aurait lieu une deuxième coupure sur le brin viral
néosynthétisé, suivie d'une soudure pour former une épingle à cheveux complète ([11], molécule
de droite), alors que la nickase serait transférée sur l'extrémité 5' du brin complémentaire ([11],
monomère de gauche). Ce modèle rend compte du rapport 1:1 entre les molécules monomères à
extrémités ouvertes et fermées, et de l'existence d'une seule orientation du palindrome 3'.
A ce stade, les molécules telles que le produit de droite de l'étape 11 peuvent se réinsérer
dans le cycle réplicatif, comme le montre la longue flèche à droite de la Figure 2. Un résultat
important de cette boucle est la production de deux formes de brins viraux fils, de séquence FGf et
Fgf ("flip" et "flop") à leur extrémité 5', et la conservation d'une seule séquence à l'extrémité 3'.
Les molécules telles que celle qui est montrée à droite de l'étape 11 peuvent soit recommencer le
cycle réplicatif en formant des "oreilles de lapin" à chacune des extrémités, soit produire des
génomes viraux destinés à être emballés, comme le montre l'étape 12. Le mécanisme exact des
dernières étapes précédant l'encapsidation des brins viraux n'est pas élucidé, mais il se pourrait
qu'une "nickase" spécifique introduise une coupure 18 nt à l'intérieur du brin viral. Les 18
nucléotides restants serviraient d'amorce à la synthèse de brins viraux de la descendance, qui
seraient encapsidés quasi simultanément, grâce à la présence de la protéine NS 1 associée de façon
covalente à l'extrémité 5' (77, 79). Cette protéine reste associée à l'ADN viral et en dehors de la
coque protéique après formation du virion (78, 97). Néanmoins, elle ne joue pas de rôle
prépondérant au cours de l'infection et serait éliminée au cours des processus de maturation
ultérieurs.
Astell et collaborateurs ont proposé que les différentes "nickases" et topoïsomérases
évoquées dans ce modèle (T rond et T carré) seraient la même protéine (10). La raison majeure
pour ceci est la présence de courtes séquences répétées (ACCAAC et CTATTCA) près des sites de
clivage putatifs. Puisque le mécanisme proposé pour la réplication des extrémités 3' de l'ADN viral
requiert que l'enzyme se lie au brin parental plutôt qu'au brin viral, les auteurs évoquent le contrôle
différentiel par des séquences proches de ces motifs conservés. En effet, six bases en amont de la
séquence ACCAAC du brin viral, se trouve la séquence GAA, alors que dans le brin néosynthétisé,
celle-ci est remplacée par TC. A l'extrémité 5', la séquence GAA est de nouveau présente et permet
donc la reconnaissance par la topoïsomérase. En outre, des données plus récentes suggèrent
fortement que l'activité topoïsomérase impliquerait les protéines virales NSl/Rep68 (77, 293).
Dans le cas des AAV, les deux palindromes ont des séquences similaires, les séquences
voisines des deux sites potentiels de coupure sont identiques et la "nickase" pourrait reconnaître
aussi bien le brin parental que le brin néosynthétisé. Ceci engendre des isomorphes "flip" et "flop"
aux extrémités 5' et 3' avec une efficacité égale. De même, le signal de l'encapsidation étant porté
par les palindromes terminaux et les protéines qui s'y associent, des virus tels que les AAV ou B19
ayant des extrémités identiques encapsident avec une fréquence égale les deux brins.
23
c) Régulation par des facteurs viraux ou cellulaires
La réplication de l'ADN viral passe par trois phases distinctes : synthèse du brin
complémentaire parental, amplification des formes d'ADN double-brin, et production suivie
d'encapsidation des molécules d'ADN simple-brin de la descendance virale. De ces trois étapes, la
première semble être relativement précoce (2 à 6h après infection dans des cellules partiellement
synchronisées) et dépend de facteurs exprimés préférentiellement durant la phase S du cycle
cellulaire (311). Les étapes ultérieures qui requièrent la présence des protéines virales NS sont
relativement tardives (le pic de la réplication se trouve après 30 h p.i.) (310).
L'identification des autres acteurs participant au processus de réplication du génome a
initialement été effectuée sur les AAV, principalement grâce à l'efficacité de transfection obtenue
avec les clones moléculaires de ces virus. Les palindromes terminaux sont requis (143) et servent
probablement d'origine de réplication, de site de reconnaissance pour les protéines virales NS/Rep
et pour des facteurs cellulaires en grande partie inconnus (8, 148). Des travaux de l'équipe de P.
Tattersall (communication personnelle) suggèrent l'implication possible de facteurs de la famille
ATF/CREB dans le processus de résolution des ponts dimères (extrémités 3' du génome de MVM).
Par ailleurs, des protéines Rep68/78 (AAV) mutées dans le domaine de reconnaissance de l'ATP
sont capables de se fixer sur les séquences palindromiques, mais incapables d'activer la réplication
comme le font les protéines sauvages (235, 236). L'importance de ce domaine a également été
démontrée pour les protéines NSI des parvovirus H-1 (183) et MVM (288). Les autres protéines
non-structurales des AAV (Rep 50/42) ne semblent requises que pour les étapes ultérieures de la
réplication car leur absence n'entrave pas le démarrage du cycle réplicatif mais inhibe
l'accumulation de l'ADN simple-brin de la descendance (61). Enfin, en ce qui concerne les AAV, il
semble que des facteurs codés par le génome des virus aidants soient impliqués dans le processus
réplicatif (notamment les produits E4 et ElB de l'adénovirus) (58). Néanmoins, il n'est pas encore
clair si ces protéines agissent directement sur le cycle viral ou si elles induisent simplement les
facteurs cellulaires appropriés.
En tous cas, pour les parvovirus autonomes aussi bien que pour les Dependovirus, la
réplication de l'ADN semble être largement fondée sur l'activité de facteurs cellulaires. Ainsi, la
topoïsomérase I est requise pour la réplication du parvovirus H-1, et son activité semble être
stimulée au cours de l'infection par ce dernier (127) Par ailleurs, différents travaux effectués aussi
bien in vivo que in vitro suggèrent l'implication de l'ADN-polymérase a (167) ou y (166, 259) dans
le cycle de la réplication parvovirale.
0 lo'oo 20'00 30'00 40'00 5000 nucléotides
3' 10
---[H> pW>
as' ADN
AA/
AA/ (3^ kb) ARNm
AA/
NSI UZ
NS2 Q]
VPl
VP2
□0 D^2
3-^nii I
(84 kDa)
(25 kDa)
(83 kDa)
(64 kDa)
Protéines
FIGURE 3 : Organisation génomique de MVMp.
La taille du génome est donnée en nucléotides et unités génomiques (u.g.).
Les boites □ représentent les palindromes terminaux. A/\j , séquence
de polyadénylation. Les chiffres dans les cadres ouverts de lecture des
protéines sont les phases employées lors de la traduction.
24
Ciü') Transcription des gènes parvoviraux
Les parvovirus ont des génomes relativement petits (environ 5 kb) et utilisent leur ADN
avec beaucoup de parcimonie. Ils exploitent des séquences superposées et différents cadres de
lecture pour exprimer les ARN messagers codant les protéines structurales et non structurales, dans
des rapports molaires précis et dans un ordre temporel défini. Bien que le mécanisme détaillé de
cette régulation diffère parmi les membres de la famille, leur organisation génomique est
essentiellement identique. Dans le chapitre qui suit, nous aborderons en premier lieu l'organisation
génomique des parvovirus autonomes et des dependovirus. Nous discuterons ensuite la régulation
de la transcription par des facteurs cellulaires et les mécanismes par lesquels le virus contrôle
temporellement l'expression de ses différents produits.
a) Organisation génomique
Chez les parvovirus connus à ce jour, la totalité des régions codantes se trouve sur un des
deux brins (appelé par convention brin positif). Le brin encapsidé par la plupart des parvovirus
autonomes est le brin négatif, il semble néanmoins que les premières étapes de la réplication
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