Les expériences de culture primaire ont été menées dans l’équipe de Juan Pedro Bolaños, à l’Institut de Biologie fonctionnelle et Génomique de Salamanque, Espagne, lors d’un séjour de recherche de 3 mois de septembre à décembre 2019. Toutes les cultures ont été réalisées à partir de souris C57BL/6.
7.1.C
ULTURE PRIMAIRE D’
ASTROCYTESPour chaque culture, huit souriceaux (P0 ou P1) ont été sacrifiés par décapitation en zone non stérile. Les têtes ont été plongées dans une solution de EBSS. Sous PSM, les cerveaux ont été extraits, puis le cervelet et les méninges retirés. Les cerveaux ont ensuite été transférés dans une solution d’EBSS contenant 1.4% de BSA (bovine serum albumin) et 1% de DNase48, dans laquelle ils ont été finement découpés. Après décantation, la solution a été retirée et remplacée par 9 mL de la même solution, additionnée de 0.4% de Trypsine49. Le mixte a été incubé 10 min dans un bain-marie à 37°C. L’effet de la trypsine a ensuite été arrêté par l’ajout de 10% de sérum de vœu fœtal (SVF, Sigma). Le mixte a été centrifugé 5 min à 700×g à TA, afin de retirer le surnageant pour le remplacer par 12 mL de la première solution (sans trypsine). Les cellules contenues dans la solution ont été individualisées par 10 pipetages/refoulages lents, à l’aide d’une pipette Pasteur stérile et dont l’intérieur a été préalablement recouvert de silicone50. Le surnageant a été récupéré dans un falcon stérile, et l’opération répétée une nouvelle fois après l’ajout de 12 nouveaux mL de la première solution (sans trypsine). Puis le surnageant récupéré a été centrifugé pendant 5 min à 700×g à TA. Le culot cellulaire obtenu a été resuspendu dans 1 mL de milieu de culture
Dubelcco’s modified eagle mediumlow glucose (DMEM, Sigma D5546, glucose5.5 mM) préalablement préparé (voir table II.7). Deux flasques de culture de 75 cm2 ont été remplies de 39.5 mL de DMEM et ensemencées avec 0.5 mL des cellules précédemment resuspendues. Les flasques ont été doucement homogénéisées puis placées à l’incubateur (37°C, 5% CO2) pour laisser les cellules se développer.
Table II.7 – Préparation du milieu de culture DMEM
pour culture primaire d’astrocytes. Toutes mentions de DMEM fait référence à ce mélange spécifique. Le DMEM est toujours chauffé au bain-marie à 37°C avant utilisation.
48 La DNase permet de dégrader l’ADN libre, formant des clusters avec les morceaux de tissu et
compliquant ainsi la dissociation des cellules.
49La trypsine permet la dissociation des cellules. 50Les cellules adhèrent au verre mais pas au silicone.
Produit Concentration DMEM SVF Glutamine Pénicilline Streptomycine Amphotéricine Plasmocine Selon besoin 10% 4 mM 0.1 U.mL-1 0.1 µg.mL-1 0.25 ng.mL-1 2.5 µg.mL-1
Les cultures ont ensuite été entretenues pendant deux semaines afin de sélectionner les astrocytes parmi toutes les espèces cellulaires et d’obtenir une densité de cellules matures suffisante pour les expériences (voir table II.8).
Jour51 Entretien Commentaires
J+1 J+7 J+8 J+15
Renouvellement du DMEM
Mise de la flasque sous agitation (180 rpm, 16 h)
Seeding dans plaques de culture 6 puits Culture prête
Puis tous les deux jours
Permet de détacher les microglies 100 000 cellules.cm-2
Table II.8 – Protocole d’entretien des cultures primaires d’astrocytes.
Une fois la culture prête, les ARN (voir section 8.2) ou les protéines (voir section 9.2) ont été extraits pour analyse.
7.2.C
ULTURE PRIMAIRE DE NEURONESUne souris enceinte depuis 15.5 jours a été sacrifiée par dislocation cervicale, afin de récupérer les embryons en zone non stérile. Les embryons ont été sortis de leur saccule, puis transférés dans une solution d’EBSS. Sous PSM, le même protocole que précédemment (voir section 7.1) a été réalisé afin d’obtenir un culot cellulaire resuspendu dans 1 mL.
A noter que les neurones sont cultivés dans du Neurobasal™-A (Sigma, #10888022) et non du DMEM (voir table II.9) et que le pipetage/refoulage doit être réalisé avec grande délicatesse, les progéniteurs neuronaux étant beaucoup plus fragiles que les astrocytes.
Table II.9 – Préparation du milieu de culture
Neurobasal™-A pour culture primaire de neurones. Toutes mentions de Neurobasal fait référence à ce mélange spécifique. Le Neurobasal est toujours chauffé au bain-marie à 37°C avant utilisation.
Les cellules resuspendues dans 1 mL de Neurobasal ont été comptées à l’aide d’une lame de Malassez, puis ensemencées dans des plaques 6 puits53à une densité de 200 000 cellules.cm-2, avant d’être placées à l’incubateur pour laisser les cellules se développer (J0). Le milieu a été renouvelé une seule fois à J+1, et la culture décrétée prête à J+7. Une fois 51J0 correspond au premier jour de la culture, i.e. au jour du sacrifice des animaux.
52Minus antioxidant (MAO), id est sans vitamine E, acétate de vitamine E, superoxyde dismutase,
catalase, glutathione (Life Technologies).
53Les puits de culture doivent préalablement être recouverts de poly-D-lysine pendant au moins 15
min à TA afin de faciliter l’adhérence des neurones.
Produit Concentration Neurobasal™-A B-27 MAO52 Glutamine Glucose Pyruvate Pénicilline Streptomycine Amphotéricine Plasmocine Selon besoin 2% 2 mM 5.5 mM 0.25 mM 0.1 U.mL-1 0.1 µg.mL-1 0.25 ng.mL-1 2.5 µg.mL-1
la culture prête, les ARN (voir section 8.2) ou les protéines (voir section 9.2) ont été extraits pour analyse.
7.3.C
O-
CULTURE PRIMAIRE DE NEURONES ET D’
ASTROCYTESPour les co-cultures, il a été nécessaire d’utiliser des plaques de culture spécifiques54, munies d’un insert semi-perméable, permettant au milieu d’être en contact à la fois avec les neurones (cultivées au fond du puits) et avec les astrocytes (cultivés dans l’insert, qui sera placé au-dessus des neurones). Les cultures précédemment décrites ont été commencées de sorte que le J+11 des astrocytes corresponde au J+3 des neurones.
A J0 des neurones, les neurones ont été ensemencés directement au fond des puits de la plaque Corning (préalablement recouverte de poly-D-lysine) dans du Neurobasal. Le milieu a été renouvelé à J+1.
A J+8 des astrocytes, les astrocytes ont été ensemencés dans les inserts, dans du Neurobasal. Le milieu a été renouvelé à J+9.
A J+11 des astrocytes et J+3 des neurones, le milieu a été renouvelé pour chaque culture, puis l’insert contenant les astrocytes a été placé au-dessus des neurones. Quatre jours plus tard (J+15 des astrocytes, J+7 des neurones), la co-culture est prête et les ARN
(voir section 8.2) ou les protéines (voir section 9.2) ont été extraits pour analyse.