Notre étude présente certaines limites devant être reconnues. Elle a été conduite sur un seul modèle murin de la maladie d’Alzheimer. Il serait utile de la réaliser sur d’autres modèles afin de déterminer si la diminution en L-sérine extracellulaire dans l’hippocampe est une caractéristique générale de la pathogenèse de la maladie d’Alzheimer.
Le nombre d’échantillons humains analysés est assez faible, il serait souhaitable de pouvoir l’accroître, ainsi que d’avoir accès à d’autres régions du cerveau.
Les reconstructions 3D d’astrocytes et de synapses ainsi que le comptage et la classification des épines dendritiques ont été réalisées manuellement. De nouvelles méthodes permettent de réaliser une imagerie volumétrique des réseaux synaptiques à large échelle et de s’affranchir des biais dus à l’expérimentateur [312].
L’effet de la supplémentation en L-sérine n’a été étudié qu’à l’âge de 6 mois. Il serait important de vérifier que les effets bénéfiques de la supplémentation en L-sérine sont durables dans le temps.
5.C
ONCLUSIONNotre étude est la première à montrer les effets bénéfiques d’une supplémentation en L-sérine dans le contexte de la maladie d’Alzheimer. Un essai clinique est actuellement en cours afin de valider cette option thérapeutique dans la maladie d’Alzheimer (identifiant NCT : 03062449 [313]).
Notre étude place également la L-sérine au centre d’un hub métabolique essentiel à la physiologie du cerveau. Elle met en avant l’intérêt d’étudier le métabolisme de la L-sérine dans les pathologies neurodégénératives et/ou liées au métabolisme du glucose. A côté du lactate, la L-sérine représente une autre molécule de signalisation astrocytaire issue du métabolisme glycolytique.
En se basant sur la littérature et les résultats obtenus lors de ce projet, nous soumettons un schéma récapitulatif du modèle que nous proposons (voir schéma bilan). Ce schéma reprend les différents points abordés et suggère un nouveau lien mécanistique entre le métabolisme énergétique et l’activité synaptique. Notre modèle ne se base pas sur l’altération de la production d’ATP pour expliquer les déficits cognitifs observés dans la maladie d’Alzheimer. Nous émettons l’hypothèse que la diminution du flux glycolytique astrocytaire conduit à une diminution de la production de L-sérine, ayant de multiples conséquences influant sur l’homéostasie cellulaire, la neurotransmission et la plasticité synaptique. De nombreuses expériences sont encore requises pour confirmer notre hypothèse (voir section 6).
6.P
ERSPECTIVESDe nombreuses autres pistes sont encore à suivre pour identifier les mécanismes pouvant rendre compte des effets bénéfiques de la L-sérine. Notamment ceux concernant la production de GSH, d’H2S, des lipides et l’homéostasie mitochondriale. Il est probable que la diminution de la biodisponibilité en L-sérine dans la maladie d’Alzheimer affecte ces points clefs du métabolisme cellulaire (voir schéma perspectives).
SCHEMA BILAN :
1La consommation de glucose est altérée dans l’hippocampe [175].
2La production de lactate est réduite dans les astrocytes de l’hippocampe [175].
3Le PP est altéré dans les astrocytes humains, possiblement murins.
4Les concentrations extracellulaires de L- et D-sérine sont diminuées dans l’hippocampe [175].
5L’hypoactivité NMDA conduit à des déficits cognitifs.
6 La L-sérine impacte la taille des astrocytes mais pas la couverture astrocytaire ni 7la densité synaptique.
SCHEMA PERSPECTIVES :
1 & 2 L’homéostasie rédox pourrait être impactée par la diminution de la production de NADH (via la réduction des flux glycolytiques, pentoses phosphates et folate) et de glutathion, nécessitant la L-sérine comme précurseur
3 La diminution de la biodisponibilité en L-sérine pourrait induire une diminution de la production de H2S, modulant les NMDA-R et la SR [221].
4La L-sérine est nécessaire à l’intégrité mitochondriale [229]. La diminution de sa biodisponibilité pourrait altérer les voies métaboliques mitochondriales.
CHAPITRE V
ANNEXES &
COMMUNICATIONS
ANNEXES &COMMUNICATIONS 137
ANNEXE 1.FONCTIONNEMENT DES SONDES FRET 139
ANNEXE 2.COMPOSITION DES CROQUETTES ALTROMIN1324 MODIFIÉES POUR CONTENIR 10% DE L-
SÉRINE 141
ANNEXE 3. DÉTAIL DES P-VALUES CONCERNANT LES COMPARAISONS MULTIPLES ET ANALYSES DE
DISTRIBUTION 143
COMMUNICATION 1.CHRONIC L-SERINE SUPPLEMENTATION IMPROVES COGNITIVE BEHAVIOR AND LONG-
TERM POTENTIATION IN 3XTG-AD MICE, AN ALZHEIMER’S DISEASE MOUSE MODEL 145
COMMUNICATION 2. IMPAIRMENT OF GLYCOLYSIS-DERIVED L-SERINE PRODUCTION IN ASTROCYTES
CONTRIBUTES TO COGNITIVE DEFICITS IN ALZHEIMER’S DISEASE 147
A
NNEXE1.F
ONCTIONNEMENT DES SONDESFRET
Exemple de la sonde FRET laconic dont les résultats sont présentés en Figure I.19
Figure adaptée de [175], [314].
Les sondes FRET
correspondent à deux fluorophores liés par un
linker capable de reconnaître spécifiquement un ligand. Lorsque le premier fluorophore (id est
celui avec la plus basse
longueur d’onde
d’excitation) est excité, il émet une longueur d’onde capable d’exciter le deuxième fluorophore, qui se met à son tour à émettre. Ce transfert d’énergie n’est réalisable que si les deux
fluorophores sont
suffisamment proches. Le principe de la sonde FRET réside donc dans la fixation du ligand qui va induire un changement
conformationnel de celle-ci
et, ainsi, rapprocher ou éloigner les deux fluorophores (A). Le ratio de la fluorescence émise par les deux fluorophores permet d’extrapoler la concentration cellulaire du ligand. Malheureusement, surtout in vivo, la calibration des sondes FRET reste très ardue et ne permet d’obtenir que des concentrations relatives.
Les sondes FRET ont l’avantage de pouvoir être génétiquement encodées : elles peuvent être constitutives ou délivrées par un vecteur viral. Dans le cas de la sonde laconic
utilisée par notre équipe, un AAV a été utilisé pour transduire les astrocytes de l’hippocampe des souris. Pour ce faire, la séquence laconic est sous le contrôle du promoteur astrocytaire GFAabc1d (B) et l’AAV est injecté par stéréotaxie directement dans l’hippocampe. mTFP est excité à 458 nm et émet à 492 nm (bleu) tandis que Venus est excité à 515 nm et émet à 528 nm (vert) (C). En présence de lactate, mTFP est éloigné de Venus et émet plus que Vénus. En absence de lactate, mTFP transfert son énergie à Venus qui émet alors plus que mTFP. Ainsi, le calcul du ratio Fluorescence-émise- mTFP/Fluorescence-émise-Venus permet de rendre compte de la concentration intracellulaire relative en lactate.
A
NNEXE2.
C
OMPOSITION DES CROQUETTESALTROMIN
1324
MODIFIEES POUR CONTENIR10%
DEL-
SERINEA
NNEXE3.
D
ETAIL DES P-
VALUES CONCERNANT LES COMPARAISONS MULTIPLES ET ANALYSES DE DISTRIBUTIONFigure III.1 – Expression relative des ARNm du PP et de la protéine PHGDH dans des cultures et co-cultures primaires d’astrocytes et de neurones.
2-way ANOVA – Comparaison de Tukey Phgdh Psat1 Psph Sr PHGDH
Astrocytes vs. Neurones 0.0003 0.0004 0.1644 0.0106 0.0173
Astrocytes vs. Astrocytes co-cultivés 0.9771 0.1451 0.0027 0.9969 0.9224 Astrocytes vs. Neurones co-cultivés 0.0001 0.0003 0.0407 0.0297 0.0036
Neurones vs. Astrocytes co-cultivés 0.0030 <0.0001 <0.0001 0.0172 0.0264
Neurones vs. Neurones co-cultivés 0.9994 0.9916 0.9594 0.8747 0.9869 Astrocytes co-cultivés vs. Neurones co-
cultivés
0.0015 <0.0001 <0.0001 0.0450 0.0037
Figure III.4 – Quantification de l’expression de PHGDH, PSAT1 et de l’actine dans l’hippocampe de patients atteints de la maladie d’Alzheimer.
Régression linéaire à effets multiples PHGDH PSAT1 Actine
A vs. AD4 0.0001 0.0028 0.0590
A vs. AD6 0.0003 0.0039 0.3132
AD4 vs. AD6 0.6358 0.7453 0.3321
Figure III.7 – Analyse de la distribution de la fluorescence de PHGDH dans l’hippocampe en fonction de l’âge.
!2 sur contingence WT 3xTg-AD
6 mois vs. 12 mois <0.0001 <0.0001
12 mois vs. 18 mois <0.0001 <0.0001
Figure III.8 – Analyse de la distribution de la fluorescence de la PHGDH dans l’hippocampe.
!2 sur contingence Hippocampe
WT vs. 3xTg-AD 6 mois <0.0001
WT vs. 3xTg-AD 12 mois <0.0001
WT vs. 3xTg-AD 18 mois <0.0001
Figure III.9 – Analyse de la distribution de la fluorescence de la PHGDH dans les sous-régions de l’hippocampe.
!2 sur contingence CA1 CA3 Hilus
WT vs. 3xTg-AD 6 mois <0.0001 <0.0001 <0.0001
WT vs. 3xTg-AD 12 mois <0.0001 0.0066 <0.0001
Figure III.11 – Analyses morphométriques des astrocytes.
Nested t-test WT vs. 3xTg
Nombre de branches - Soma 0.9998
Nombre total de branches 0.9999
Nombre de terminaisons Convex Hull
0.9985
0.0056
Figure III.12 – Analyses morphométriques des neurones.
Nested t-test WT vs. 3xTg
Densité boutons synaptiques 0.7600
Densité épines dendritiques totales 0.6419
Densité épines de type mushroom Densité épines de type stubby
Densité épines de type thin
0.8304 0.9731 0.1028
Figure III.13 – Analyse de la densité synaptique par microscopie électronique.
Multiple t-test WT vs. 3xTg
Densité synaptique totale 0.2571
Densité des synapses asymétriques 0.4875
Densité des synapses symétriques 0.6443
Figure III.14 – Analyse de la couverture astrocytaire des synapses.
Multiple t-test WT vs. 3xTg
Densité synaptique totale 0.9960
Densité des synapses de classe 1 0.9899
Densité des synapses de classe 2 0.3808
Densité des synapses de classe 3 0.3182
!2 sur contingence Distribution des classes
WT vs. 3xTg-AD 0.1246
Figure III.16 – La supplémentation chronique en L-sérine restaure le territoire couvert par les astrocytes des souris 3xTg-AD au niveau de celui des souris contrôles.
Nested 1-way ANOVA Convex Hull
WT vs. 3xTg-AD 0.0062 WT vs. WT+L 0.5007 WT vs. 3xTg-AD+L 3xTg-AD vs. WT+L 3xTg-AD vs. 3xTg-AD+L 3xTg-AD+L vs. WT+L 0.3353 0.1016 0.2486 0.9754
C
OMMUNICATION1.
C
HRONICL-
SERINE SUPPLEMENTATION IMPROVES COGNITIVE BEHAVIOR AND LONG-
TERM POTENTIATION IN3
XT
G-AD
MICE,
ANA
LZHEIMER’
S DISEASE MOUSE MODELPoster présenté au(x) :
XIV European Meeting on Glial Cells in Health and Disease – Porto, du 10 au 13 juillet 2019 8ème rencontres de la Fondation Alzheimer – Paris, les 19 et 20 novembre 2019
Pierre-Antoine Vigneron1, Marianne Maugard1, Marco Matos2, Stéphane H.R. Oliet2, Aude Panatier2 and Gilles Bonvento1
1 Commissariat à l’énergie atomique et aux énergies alternatives (CEA), Département de la Recherche Fondamentale, Institut François Jacob, Molecular Imaging Research Center (MIRCen), CNRS UMR 9199, Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, Fontenay-aux- Roses, France.
2 Neurocentre Magendie, INSERM U1215, Université de Bordeaux, Bordeaux, France Subtle losses of memory or changes in behavior are the first outward signs of Alzheimer’s disease (AD). AD patients often display concomitant reduced glucose metabolism as observed by 18F- fluorodeoxyglucose PET. Whether such energy metabolism deficit contributes to cognitive impairment in AD is still not known. In the brain, oxidative use of glucose provides most of the ATP requires to fuel synaptic activity. However, recent observations suggest that changes in aerobic glycolysis prevail in the early phase of AD. Some glycolytic intermediates can be used as substrates for other metabolic pathways. The phosphorylated pathway diverts 3-phosphoglycerate from the glycolytic flux, to produce
de novo L-serine through the action of three enzymes (Phgdh, Psat1 and Psph). We and others have found that astrocytes are the main source of L-serine in the brain. Amongst other fates, L-serine can be racemized by serine racemase into D-serine, which is recognized as the major co-agonist of N- methyl-D-aspartate receptors in the hippocampus, making it a mediator of long-term synaptic plasticity (LTP and LTD). We made the hypothesis that a dysfunction in astrocyte L-serine production, resulting from an altered energy metabolism, could participate in the synaptic and cognitive deficits observed in AD. We used 3xTg-AD mice, a mouse model that recapitulates metabolic and synaptic deficits in addition to classical AD hallmarks such as neurofibrillary tangles and amyloid plaques. We confirmed that young 3xTg-AD mice display an impaired synaptic plasticity, with a reduced HFS- induced LTP when compared to controls. To test our hypothesis, we supplemented our mice (control and 3xTg-AD) with a 10%-L-serine- enriched diet during 2 months and performed electrophysiological recordings. We found that L-serine diet rescued 3xTg-AD LTP to control levels. We then performed the Morris Water Maze (MWM) task which involves hippocampus-relying spatial memory. During the training phase, 3xTg-AD mice learned the task as controls but are unable to distinguish between the four quadrants during the probe test, 72h after the training phase. L-serine supplementation rescued these deficits, and 3xTg-AD mice spent the same time in the target quadrant as control mice. Together, these results suggest a critical role for astrocyte L-serine in long-term synaptic plasticity and spatial memory.
C
OMMUNICATION2.I
MPAIRMENT OFG
LYCOLYSIS-D
ERIVEDL-
SERINEP
RODUCTIONI
NA
STROCYTESC
ONTRIBUTES TOC
OGNITIVED
EFICITS INA
LZHEIMER’
SD
ISEASE Publié le 3 mars 2020, dans Cell MetabolismCell Metabolism