B IOLOGIE MOLECULAIRE

8.1.E

XTRACTION DES

ARN–S

OURIS

Les souris ont été euthanasiées par une injection létale de pentobarbital (Exagon) et les hippocampes ont été récupérés par dissection. Chaque hippocampe (un par hémisphère) a été homogénéisé dans un tube contenant 500 µL de TRIzol (Life Sciences). Dans chaque tube, 100 µL de chloroforme (Merck Millipore) ont été ajoutés, avant de les centrifuger pendant 15 min à 12 000×g à 4°C. La phase aqueuse supérieure a été récupérée, et 2 µL de glycogène55 _{(10 µg.µL}-1_{), ainsi que 250 µL d’isopropanol (VWR) y ont} été ajoutés. Les mixtes ont ensuite été énergiquement mélangés à l’aide d’un vortex, avant de centrifuger les tubes durant 15 min à 12 000×g à 4°C. Le surnageant a été retiré, et 500 µL d’éthanol56 _{(VWR) à 75% ont été ajoutés avant une nouvelle centrifugation de 5 min à} 7 600×g à 4°C. Le surnageant a, à nouveau, été retiré et cette dernière étape a été répétée une seconde fois. Le culot d’ARN a finalement été resuspendu dans 20 µL d’eau RNase- free (Gibco) et la quantité d’ARN a été mesurée au spectrophotomètre Nanodrop (NanoDrop-One, Ozyme)

8.2.E

XTRACTION DES

ARN–C

ULTURE PRIMAIRE

Lorsque les cultures ont été prêtes, le milieu de culture a été retiré, et les cellules rincées au PBS 0.1 M. Puis, 500 µL de TRIzol ont été ajoutés dans chaque puits. Les cellules ont été détachées mécaniquement à l’eau d’un râteau et le mixte récupéré dans un tube. Les ARN ont alors été extraits comme décrit dans la partie précédente (voir section 8.1).

8.3.S

YNTHESE DES

ADN

COMPLEMENTAIRES

Les ARN extraits ont d’abord été traités à la DNase I (kit Promega) afin de dégrader l’ADN génomique contaminant. Pour ce faire, 1 µg d’ARN a été dilué dans 8 µL d’eau

RNase-free (Gibco), dans lesquels ont été rajoutés 1 µL de DNase I Rq1 et 1 µL de solution tampon au 10X. Les échantillons ont été incubés 30 min à 37°C, puis la réaction a été arrêtée par l’ajout de 1 µL de solution stop et l’incubation des échantillons 10 min à 65°C. Les ARN sans ADN génomique ont alors été dilués à 25 ng.µL-1 _{par l’ajout de 29 µL d’une} solution tampon de dilution (1/50 dithiothreitol (DTT, Invitrogen), 1/1 000 RNasin (Promega) dans du Tris-EDTA57_).

Les ADN complémentaires (cDNA) de nos ARN ont été synthétisés à l’aide du kit Superscript Vilo (Life Technologies) selon les instructions du fournisseur. A noter qu’un échantillon d’ARN a été incubé sans enzyme afin de servir comme contrôle de la contamination en ADN génomique (échantillon nommé transcription réverse négative, RT-).

55_{Le glycogène permettra de teindre le culot d’ARN en blanc, afin de le visualiser après l’extraction.} 56_{L’ajout d’éthanol permet de purifier et déshydrater les ARN.}

57_{Tris-EDTA : 1/100 Trizma hydrochloride à 1 M, 1/500 EDTA à 0.5 M dans de l’eau RNase-free, pH}

8.4.PCR

QUANTITATIVE EN TEMPS REEL

La PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR) permet de quantifier les ARN messagers de plusieurs gènes définis par l’expérimentateur. Elles ont été réalisées à l’aide du kit iTaq Universal SYBR Green supermix (Bio-Rad). Pour chaque échantillon, 0.7 ng de cDNA a été incubé dans le mixte SYBR green, en présence des amorces spécifiques au gène étudié (3 pmol d’amorces forward et 3 pmol d’amorces reverse, voir table II.10).

L’amplification des cDNA a été réalisée au thermocycleur (Bio-Rad CFX384), selon le programme spécifique suivant :

• Activation de la Taq Platinium : 2 min à 95°C

• Fusion : 15 s à 95°C

• Élongation : 1 min à 60°C

• Dissociation : 60 min à 95°C

Les données obtenues ont été analysées à l’aide du logiciel CFX manager (Bio-Rad). Chaque échantillon a été réalisé en triplicat et leur moyenne a été considérée pour les analyses, si les valeurs obtenues présentaient moins de 5% de variabilité entre elles. L’eau utilisée pour les dilutions ainsi que la RT- ont également été analysées, pour s’assurer de l’absence de contamination. L’abondance des ARN messagers a été quantifiée par la méthode des ∆∆Ct et normalisée par la valeur d’un gène de ménage (Cyclophiline A, Rpl13 et/ou Erp29).

Table II.10 – Amorces PCR pour la quantification des ARN messagers correspondants par

RT-qPCR. Tous les couples d’amorces ont été précédemment validés par une RT-qPCR sur des dilutions sérielles de cDNA (0.004 ng à 14 ng). La linéarité du signal permet de quantifier l’efficacité des amorces. Toutes nos amorces ont une efficacité comprise entre 80% et 105%.

Gène ciblé Sens Séquence 5’ ® 3’

Erp29 Erp29 ITR ITR Forward Reverse Forward Reverse

CCT TCC CTT GGA CAC AFT CAC T GTC GAA CTT CAC CAA GAC GAA CTT GGA ACC CCT AGT GAT GGA GTT CGG CCT CAG TGA GCG A

Phgdh

Phgdh Forward _Reverse AAG TTC ATG GGG ACA GAG CTG AAC _{CCT TCA CCA TGT CCA ACT GGA} Psat1

Psat1 Forward _Reverse GGG GTC ACG GTG ATT GTC _{TGA TGG GCA CTC TCT GAG CGA} Psph

Psph Forward _Reverse CGG AAC CGA GAA GAC CAG C _{GGA GAC CAT CCT GGG AAG TTT T} Rpl13

Rpl13 Forward _Reverse CTG AAG CCT ACC AGA AAG TTT GC _{GGT ACT TCC ACC CGA CC CAT} Sr

Sr Forward _Reverse GTA GGA GGA GGA GGA ATG GTT _{TTC GGT GAC AGT GAA GAC ATC}

9.B

IOCHIMIE

9.1.E

XTRACTION DES PROTEINES

–S

OURIS

Les souris ont été euthanasiées par une injection létale de pentobarbital (Exagon) et les hippocampes ont été récupérés par dissection. Chaque hippocampe (un par hémisphère) a été pesé puis 10 µL.mg-1 _{de tampon de lyse, préalablement préparé}58_{, a été} ajouté.

Les échantillons ont ensuite été soniqués59 _{5 fois dans la glace afin d’obtenir un} homogénat. Ces homogénats ont alors été centrifugés pendant 20 min à 16 000×g à 4°C, et le surnageant, contenant les protéines, a été conservé à -80°C jusqu’à utilisation.

9.2.E

XTRACTION DES PROTEINES

–C

ULTURE PRIMAIRE

Lorsque les cultures ont été prêtes, le milieu de culture a été retiré, et les cellules rincées au PBS 0.1 M. Puis, 150 µL de tampon de lyse ont été ajoutés dans chaque puits. Les cellules ont été détachées mécaniquement à l’aide d’un râteau et le mixte récupéré dans un tube. Les protéines ont alors été extraites comme décrit dans la partie précédente

(voir section 9.1).

9.3.E

XTRACTION DES PROTEINES

–H

UMAINS

La biobanque GIE-NeuroCEB (voir section 4.1) nous a également fourni des échantillons de cerveaux humains, congelés en copaux. Ces échantillons, comme pour les coupes histologiques, incluent l’hippocampe, le gyrus parahippocampique et le gyrus fusiforme, de patients atteints de la maladie d’Alzheimer (n=5 par groupes ; Contrôles ; Alzheimer de stade Braak II-IV et Alzheimer de stade Braak VI). Les données démographiques concernant les patients sont résumées dans la table II.3.

Les échantillons ont été pesés, puis les homogénats et l’extraction des protéines ont été réalisés de la même façon que décrite précédemment (voir section 9.1).

9.4.W

ESTERN

-B

LOTS

Les quantités de protéines extraites précédemment ont été mesurées à l’aide du kit BCA Pierce (Thermo Fischer Scientific), selon les instructions du fournisseur.

58_{Tampon de lyse : Tris-HCl 50 mM, 100 mM NaCl, 1% SDS, pH ajusté à 7.4, dans lesquels deux}

pastilles d’inhibiteurs de protéases et d’inhibiteurs de phosphatases (Roche) ont été dissoutes. Le même tampon de lyse a été utilisé pour toutes les extractions de protéines.

9.4.1.W

ESTERN

-B

LOT SUR DES DILUTIONS SERIELLES DE PROTEINES

Les quantités de protéines obtenues à partir de tissus murins et humains nous ont permis de réaliser des dilutions sérielles pour la quantification en western-blot. Cette technique permet de s’affranchir d’un gène de ménage60_{, mais également de vérifier que} notre protocole expérimental conduit bien à une réponse linéaire du signal, en fonction de la quantité de protéines chargée. La précédente doctorante de notre équipe, Marianne MAUGARD, a donc défini un protocole de western-blot basé sur 4 dilutions sérielles par échantillons (2.5 µg.µL-1_{, 2 µg.µL}-1_{, 1.5 µg.µL}-1_{, 1 µg.µL}-1_{), permettant ainsi la quantification} précise d’une protéine, parmi toutes celles présentes dans cet échantillon [1]. Cette technique a déjà fait l’objet de plusieurs publications par d’autres équipes [264]–[266].

Les dilutions ont été réalisées dans le tampon de lyse de façon à obtenir des tubes contenant 25, 15, 10 et 5 µg de protéines par échantillons. Les protéines ont ensuite été dénaturées à 90°C pendant 10 min, après l’ajout d’agent réducteur NuPage 10X et de tampon LDS NuPage 4X (Invitrogen). Les échantillons dénaturés ont ensuite été chargés sur un gel Criterion TGX Stain-free 4-20% (Bio-Rad), les protéines ont été séparées par électrophorèse, puis transférées sur une membrane de nitrocellulose à l’aide du système de transfert TransBlot Turbo Transfer (Bio-Rad).

La membrane a ensuite été bloquée dans une solution de TBS (tris-buffered saline

0.1 M) contenant 0.1% de Tween 20 et 5% de BSA, pendant 1 h à TA, sous agitation. Puis la membrane a été incubée avec l’anticorps primaire (voir table II.11) pendant 16 h, dans la même solution de blocage. Après trois rinçages au TBS, la membrane a été incubée avec l’anticorps secondaire fluorescent anti-lapin infrarouge 700 (1/5 000, Li-Cor), dans la même solution de blocage, pendant 3 h. Après rinçages, la fluorescence a été détectée à l’aide du système d’imagerie Odyssey CLX (Li-Cor).

La quantification de la fluorescence a été réalisée à l’aide du logiciel Image Studio 5.2 (Li-Cor). Chaque bande a été manuellement délimitée et son intensité de fluorescence quantifiée par le logiciel. Les 4 dilutions par échantillons ont permis de déterminer la pente pour chaque échantillon par régression linéaire. Les données sont présentées sous forme de moyenne des pentes pour chaque groupe.

Table II.11 – Liste des anticorps primaires utilisés pour les western-blots.

60_{La normalisation par un gène de ménage est source d’erreurs lors de la quantification.}

Cible de l’anticorps Espèce Référence fournisseur Dilution

ACTINE

PHGDH Lapin _Lapin Sigma, A2066 _{Frontier, AB_2571653 1/10 000} 1/5 000

9.4.2.W

ESTERN

-B

LOT STAIN

-

FREE

Les quantités de protéines obtenues à partir des cultures cellulaires n’ont pas été suffisantes pour nous permettre de réaliser des dilutions sérielles. Afin de toujours s’affranchir de l’utilisation d’un gène de ménage nous avons opté pour la normalisation de nos données par la quantité totale de protéines présentes dans l’échantillon (western-blot

stain-free).

Au lieu d’une dilution sérielle, 5 µg de protéines par échantillons ont été chargés dans le gel. Après migration des protéines, le gel a été placé 5 min aux UV (ChemiDoc XRS+ accompagné du logiciel Image Lab, Bio-Rad), puis le transfert a été réalisé sur membrane de nitrocellulose. La membrane a, à son tour, été placée aux UV en auto- exposure, afin d’obtenir une image de toutes les protéines contenues sur la membrane61_. Cette image a été sauvegardée pour servir de normalisateur lors de la quantification. La suite du protocole a été réalisée de la même façon que décrite précédemment (voir section 9.4.1).

Pour la quantification, la valeur d’intensité de fluorescence donnée par le logiciel Image Studio a été normalisée par la valeur de gris moyen donnée par le logiciel Image Lab. Les données sont présentées sous forme de moyenne des ratios pour chaque groupe.

61 _{Les UV permettent d’activer les tryptophanes contenus dans les protéines, et ainsi de révéler}

toutes les protéines présentes. Une mesure du niveau de gris moyen rend compte de la quantité totale relative de protéines dans chaque échantillon.

Dans le document Le métabolisme astrocytaire de la L-sérine et ses implications dans la maladie d'Alzheimer : une potentielle approche thérapeutique (Page 92-97)