Pour évaluer la concentration en différents acides aminés (L-sérine, D-sérine, et Glutamate) dans l’hippocampe des souris, nous avons collecté le milieu extracellulaire par microdialyse durant 24 h (Figure II.3), puis analysé sa composition par LC-MS/MS (chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem). Les microdialyses ont été réalisées sur animaux vigiles, afin d’éviter toutes perturbations potentiellement dues aux anesthésiants et analgésiques.
Avant toutes procédures, les souris ont été habituées au set-up de microdialyse en plaçant les animaux dans le bol d’hébergement (STANK/WF, Instechlabs) 15 min par jours, pendant 3 jours. Elles ont également été habituées au Solid Drink® (Genobios), généralement donnés aux souris en post-opératoire pour faciliter leur hydratation, afin de limiter une potentielle néophobie développée à cause d’une chirurgie traumatisante.
Figure II.3 – Schéma explicatif de la microdialyse, [267]. Le guide d’implantation de la
membrane est placé lors d’une chirurgie de façon à ce que la membrane puisse atteindre la région d’intérêt à microdialyser. Lors de l’expérience, la membrane de microdialyse est descendue le long du guide et perfusée d’aCSF (artificial cerebrospinal fluid). Un échange osmotique se met en place au niveau de la membrane afin d’équilibrer les concentrations entre aCSF et milieu extracellulaire microdialysé. L’analyse ultérieure du microdialysat permet d’extrapoler la composition du milieu extracellulaire microdialysé.
10.1.C
HIRURGIE D’
IMPLANTATION DU GUIDE DE MICRODIALYSEAfin de dialyser le milieu extracellulaire, il a d’abord été nécessaire de placer un guide d’insertion de la membrane de microdialyse dans le cerveau des souris. Ce guide est
placé de façon à ce que la membrane de microdialyse atteigne la région d’intérêt (Figure II.3).
Les souris ont été analgésiées par une injection sous-cutanée pré-opératoire de buprénorphine (0.05 mg.kg-1, Vétergésic). L’anesthésie profonde a ensuite été atteinte par une injection intra-péritonéale d’un mélange kétamine (100 mg.kg-1) et xylazine (10 mg.kg- 1). Une anesthésie locale a également été appliquée par l’injection de 50 µL de lidocaïne 0.5% (Xylovet), en sous-cutanée, au niveau du crâne. Une hydratation préventive a également été réalisée par l’injection sous-cutanée de 300 µL de NaCl 0.9% à 37°C. Durant toute la procédure, la température de l’animal a été monitorée et maintenue à 37°C.
Les souris ont été fixées sur un cadre de stéréotaxie. La tête a été nettoyée à la bétadine savon (50% diluée dans de l’eau PPI) puis à la bétadine solution. Le crâne a ensuite été découvert à l’aide d’un scalpel stérile et nettoyé. Le guide a été positionné au niveau du Bregma. Pour atteindre la région CA1 de l’hippocampe, le guide a été déplacé selon les coordonnées décrites en table II.12. Aux coordonnées définies, le crâne a été foré pour atteindre la dure mère, à partir de laquelle le guide a été descendu pour atteindre la région d’intérêt (voirtable II.12). Le guide a ensuite été maintenu en place par un ciment dentaire photo-polymérisé aux UV (Tetric EvoFlow, Megadental). Pour que le ciment dentaire adhère correctement au crâne, celui-ci été préalablement recouvert d’un agent adhésif (OptiBond FL, Dentaltix). La peau du crâne a ensuite été recousue à l’aide d’un fil de soie 6.0, autour du chapeau en ciment dentaire. Les souris ont alors été laissées en rémission durant 5 jours avant de procéder à la microdialyse.
Direction Référence Coordonnées
Antéro-postérieure
Latérale Bregma Bregma - 2 mm +2 mm
Ventrale Dure-mère - 1 mm
Table II.12 – Coordonnées des sites d’implantation du guide de microdialyse. A noter que
la membrane de microdialyse dépasse de 1 mm du guide, permettant ainsi d’atteindre la région d’intérêt.
10.2.M
ICRODIALYSEPré- et post-microdialyse, la membrane de microdialyse a été plongée dans une solution de calibrage, composée des acides aminés recherchés, à concentration extracellulaire physiologique théorique (10 µM L-sérine, 2 µM D-sérine, 10 µM Glycine, 100 µM Glutamate, 1 mM Lactate). Le dosage des dialysats de calibrage permet de définir le rendement de la membrane. Les concentrations extracellulaires finales en acides aminés ont été obtenues par extrapolation des valeurs mesurées à l’aide de la valeur de rendement.
Pour tous les animaux, les microdialyses ont commencé aux alentours de 13 h. La souris a été endormie par inhalation d’isoflurane, afin de pouvoir descendre la membrane de microdialyse (CMA 7, 1 mm cuprophane (6 kD), CMA P000082) dans le guide. La membrane a été continuellement irriguée par un flux constant (1 µL.min-1) d’aCSF (artificial
fluid CNS sterile, CMA) durant 24 h62 (Figure II.3). Les dialysats ont été collectés toutes les heures à l’aide d’un collecteur de fractions réfrigéré (MAB85, Microbiotech), puis congelés à -80°C jusqu’à utilisation.
La position de la membrane de microdialyse a été vérifiée par un marquage de Nissl (voir section 4.3) à la fin de l’expérience.
10.3.
C
HROMATOGRAPHIE LIQUIDE ET SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM(LC-MS/MS)
La détermination simultanée des concentrations extracellulaires en L-sérine, D-sérine et L-glutamate a été réalisée par chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à une spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) [268] par nos collaborateurs de la plateforme SMArt-MS du CEA. Le système LC-MS/MS est composé d’un appareil UPLC (ultra-high performance liquid chromatography) Acquity I-CLASS et d’un spectromètre de masse triple quadripôle Xevo-TQ-XS (Waters SAS). La séparation chromatographique chirale a été réalisée à l’aide d’une colonne CROWNPAK CR-I(+) (5 mm, 3 mmID, 150 mm, Daicel Corporation) à une température oscillant entre 0 et +1°C. La phase mobile était composée d’acide trifluoroacétique à 0.3% dans une solution d’acétonitrile à 10% et maintenue à un flux constant de 0.15 mL.min-1, permettant ainsi une élution isocratique63.
Les échantillons ont été dilués dans la phase mobile (1/2) et 10 mL ont été injectés dans le système LC-MS/MS. Dans ces conditions, les temps de rétention sont de respectivement 4.60, 4.82 et 11.00 min pour la D-sérine, la L-sérine et le L-glutamate.
La spectrométrie de masse en tandem a été réalisée en mode MRM (multiple reaction monitoring) permettant la quantification des molécules préalablement séparées.
62La membrane étant permissive aux molécules de taille inférieure ou égale à 6 kD, un équilibre
osmotique se met en place au niveau de la membrane entre le milieu extracellulaire (où la membrane est placée) et l’aCSF (irriguant la membrane). Le dialysat récupéré correspond donc à de l’aCSF, dans lequel ont diffusé les molécules (<6 kD) présentes dans le milieu extracellulaire du cerveau, selon un ratio propre à chaque molécule et déterminé par la valeur de rendement.
63L’élution isocratique (phase mobile de composition et paramètres identiques tout au long de