5.1.P
ERFUSION,
FIXATION ET MONTAGE DES COUPESLes souris ont été euthanasiées par une injection létale de pentobarbital (Exagon) avant de recevoir une perfusion transcardiaque froide de fixateur (8 mL.min-1 pendant 10 min), composé de 4% de PFA dans du PBS 0.1 M. Les cerveaux ont ensuite été récupérés et post-fixés durant la nuit dans le même fixateur, avant d’être rincés dans une solution de PBS 0.1 M à 4°C pendant au moins 24h.
Pour les analyses concernant les neurones, les cerveaux ont été coupés et scellés comme décrit en section 3.
Pour les reconstructions d’astrocytes, les hémisphères ont ensuite été séparés et inclus dans des blocs d’agar 2% (Sigma). Le bloc a été glué à la plateforme d’un vibratome (Leica VT1000 S), et des coupes de 100 µm d’épaisseur ont été réalisées. Les coupes ont été stockées dans une solution de PBS 0.1 M et 0.1% azide.
Les coupes ont été montées sur lame dans du Vectashield (H-1000, Vector) et scellées d’une lamelle #1.7 avec du vernis à ongles transparent. Elles ont ensuite été placées 24 h à 4°C, pour que le Vectashield puisse imprégner toute l’épaisseur de la coupe.
5.2.A
CQUISITION HAUTE-
RESOLUTIONDes stacks d’images ont été acquis au microscope confocal (Leica, SP8), avec des paramètres d’acquisition stricts et répétés pour toutes les acquisitions (voir table II.4). Les images ont été acquises dans la région CA1 de l’hippocampe. Une fois acquises, les images ont été déconvoluées à l’aide du logiciel AutoQuant X3 (Media cybernetics) et sauvegardées au format 8 bit.
Paramètres Valeurs Objectif Résolution Vitesse d’acquisition 63X 2048×2048 px 600 Hz
Espacement des images 0.26 µm
Nombre de moyennages par image Intensité du laser
Compensation du bleaching
Vectashield
3
GFP=3% ; TdTomato=1%
z-compensation via detector gain
Indice de réfraction=1.45
Table II.4 – Paramètres d’acquisition des images haute-résolutions d’astrocytes pour
reconstruction 3D. L’acquisition finale d’un astrocyte correspond en moyenne à la superposition de 180 à 320 images (stack), pour une taille de fichier d’environ 1 Go.
5.3.R
ECONSTRUCTION3D
DES ASTROCYTESLes images ont d’abord été pré-traitées pour faciliter la reconstruction 3D. La brillance et le contraste ont été ajustés sur Fiji, selon les seuils prédéfinis par le logiciel, de sorte que l’astrocyte soit le plus visible possible. Puis, l’image a été importée dans le logiciel
Vaa3D (The Allen Institute, [258]) et un filtre anisotropique a été appliqué sur l’image. Ce filtre permet, par diffusion, de compléter les espaces entre les images du stack (images espacées de 0.26 µm), afin d’obtenir un astrocyte continu de bout en bout.
La reconstruction 3D a été réalisée à l’aide du plug-in neuron-tracing. Un marqueur est placé dans le soma de l’astrocyte, une valeur-seuil, permettant de faire la distinction entre astrocyte et bruit de fond, est définie, et la reconstruction se lance. A la fin, une étape de vérification est nécessaire, et un élagage de la reconstruction, par superposition avec l’image originale, est souvent à réaliser. Le fichier de la reconstruction a été enregistré au format .swc grâce au plug-in sort neuron swc.
La reconstruction générée ne tient pas compte de l’échelle de l’image, il a donc été nécessaire de procéder à une étape de recalibrage des valeurs. Le fichier .swc a été ouvert dans un éditeur de texte, et les valeurs x, y, z et r43ont été multipliées par les valeurs de la résolution de l’image (x, y et r=0.09014 ; z=0.26131) dans un fichier excel. Les nouvelles valeurs ont été insérées à la place des anciennes dans le fichier .swc.
5.4.A
NALYSE DE LA RECONSTRUCTION3D
Une première analyse a été réalisée à l’aide du logiciel L-measure (Lm v5.3, George Mason University, [259]), qui permet une caractérisation quantitative des différents éléments de l’astrocyte (voir http://cng.gmu.edu:8080/Lm/help/index.htm pour le détail
des éléments mesurables).
Nous nous sommes également intéressés au territoire total couvert par l’astrocyte. L-measure ne rendant pas compte de cette donnée, nous avons analysé la reconstruction à l’aide du logiciel Matlab (MathWorks). Pour pouvoir importer et traiter le fichier .swc dans Matlab, il a été nécessaire d’installer le plug-inTrees (Hermann Cuntz, [260]). Le territoire couvert par l’astrocyte a été modélisé par une analyse convex hull44 (voir table II.5), aboutissant à un volume (µm3) que nous avons pu comparer entre les différents groupes.
Commandes Commentaires
Load_tree Importer le fichier .swc
[K, V] = chull_tree Modélisation convex hull
Modélisation convex hull [Kv, Vv] = convhull(V.XYZ(:,1),V.XYZ(:,2),V.XYZ(:,3))
Vv
Vhull_tree Affiche la valeur du volume Affiche la modélisation
Table II.5 – Code Matlab pour la modélisation convex hull du territoire couvert par les
astrocytes.
43 x, y et z correspondent aux coordonnées dans l’espace des différentes structures reconstruites et
r au rayon de ces structures.
44L’analyse convex hull permet de joindre toutes les extrémités de la cellule, afin de modéliser le
volume total qu’elle couvre. Le volume couvert est différent du volume réel, puisqu’il prend en compte les espaces entre les prolongements astrocytaires, qui n’appartiennent pas à l’astrocyte per se, mais qui sont sous surveillance de ce dernier, et donc, appartiennent à son territoire.
5.5.A
NALYSE DES NEURONESLes neurones ont été analysés à l’aide du logiciel NeuronStudio (Icahn school of medicine [261]). Les boutons synaptiques ont été quantifiés manuellement le long des axones des neurones CA3 dans le stratum radiatum de CA1. Les épines dendritiques des neurones pyramidaux de CA1 ont été automatiquement détectées et classées selon leur morphologie, par le logiciel. Toutes ces données ont été normalisées par la longueur de la neurite, calculée par le logiciel, permettant ainsi d’obtenir la densité de l’élément mesuré.