2.1.D
ESIGN DES PLASMIDESNos plasmides ont été synthétisés par la technique de clonage Gateway (Life Technologies) (Figure II.1). Les promoteurs et transgènes d’intérêt, flanqués de séquences attB, ont été produits par PCR puis intégrés dans des pDONR via recombinaison BP, selon le protocole du fournisseur. Les pENTR alors obtenus, portant soit le promoteur, soit le transgène, ainsi que le gène de résistance à la kanamycine, ont été utilisés pour transformer des bactéries E. coli DH10β par électroporation. Les bactéries ont ensuite été étalées sur boîte de Pétri (Life Technologies) contenant un milieu LB-agar-kanamycine, et permettant ainsi la sélection des clones transformés. Une colonie par boîte a été isolée et amplifiée dans un petit volume de LB-kanamycine. Les pENTR ainsi amplifiés ont pu être récupérés puis purifiés grâce au kit Monarch plasmid miniprep (NEB) et vérifiés par digestions enzymatiques spécifiques et séquençage.
Les séquences d’intérêt ont ensuite été transférées dans un pDEST, contenant les séquences ITR37 ainsi que le gène de résistance à l’ampicilline, par recombinaison LR, selon le protocole du fournisseur. Les pAAV alors obtenus, portant le promoteur, le transgène, ainsi que le gène de résistance à l’ampicilline38, ont été utilisés pour transformer des bactéries E. coli DH10β par électroporation. Les bactéries ont ensuite été étalées sur boîte de Pétri contenant un milieu LB-agar-ampicilline, et permettant ainsi la sélection des clones transformés39. Une colonie par boîte a été isolée et amplifiée dans un petit volume de LB- ampicilline. Les pAAV ainsi amplifiés ont pu être récupérés puis purifiés grâce au kit Monarch plasmid miniprep et vérifiés par digestions enzymatiques spécifiques.
Les pAAV validés ont été amplifiés dans un grand volume de LB-ampicilline puis purifiés grâce au kit Nucleobond Xtra EF Maxiprep (Macherey-Nagel) pour la production des AAV.
37 Les séquences ITR (inverted terminal repeats) sont de courtes séquences (145 pb) formant des
structures palindromiques essentielles pour la réplication du génome viral et son encapsidation. Ce sont les seules séquences d’origine virale du plasmide.
38Les pAAV possèdent également des séquences régulatrices. Le promoteur est stabilisé par l’intron
de la β-globine et le transgène est suivi d’une séquence de régulation post-transcriptionnelle WPRE (Woodchuck hepatitis virus Post-transcriptional Regulatory Element), permettant d’augmenter son expression.
39 Il y a ici une double sélection pour s’assurer que seules les bactéries transformées par le pAAV se
développent sur la boîte de Pétri. Les bactéries transformées par les pENTR ne possèdent pas le gène de résistance à l’ampicilline et les bactéries transformées par le pDEST possèdent le gène RFA, entraînant le suicide de la bactérie.
Figure II.1 – Stratégie de clonage Gateway par recombinaison two-sites, adaptée de[1]. Les produits de PCR sont insérés dans un plasmide pDONR via recombinaison BP. Les plasmides pENTR
sont ensuite
transférés dans un plasmide pDEST par recombinaison LR, formant ainsi un plasmide pAAV contenant le promoteur et le transgène.
2.2.P
RODUCTION DES VECTEURS VIRAUXAAV
Les plasmides pAAV produits (voir Table II.1) ont été co-transfectés, par chlorure de calcium, dans des cellules HEK-293T à 70-90% de confluence, accompagnés d’un plasmide codant pour la capside du vecteur viral, ainsi qu’un plasmide helper (pXX6-80). Nous utilisons principalement la capside PHP.eB qui permet à l’AAV de traverser la BHE après injection intraveineuse. De plus, l’expression du transgène est 40 à 90 fois supérieure à une capside AAV2/9 (dans le cerveau, en fonction de la région étudiée) [255].
Table II.1 – pAAV
produits et leur capside pour la production d'AAV.
40 Le promoteur GFA-abc1d est une version raccourcie du promoteur endogène humain GFAP,
permettant une expression accrue et spécifique du transgène dans les astrocytes [320].
41Le promoteur CBA permet une expression ubiquitaire du transgène dans le cerveau, avec une
forte expression dans les neurones [321].
Nom du plasmide Promoteur Transgène Capside
GFA-GFP GFA-abc1d40 GFP PHP.eB
GFA-Tomato GFA-abc1d Td-Tomato PHP.eB
CBA-GFP CBA41 GFP PHP.eB
Afin de récolter les vecteurs viraux, à 72 h post-transfection les cellules ont été détachées de la plaque de culture et centrifugées 10 min à 1 500 rpm à 4°C. Le surnageant et le culot ont été récupérés.
Dans le surnageant, une solution de polyéthylène glycol à 5X (40% PEG, 2.5 M NaCl) a été ajoutée, puis le mixte a été laissé à 4°C pour 2 h, avant d’être centrifugé 20 min à 3 700×g à 4°C. Le culot a été mis de côté pour la suite du protocole.
Dans le premier culot récupéré, les cellules ont été lysées par l’ajout d’un tampon de lyse (NaCl 0.15 M, Tris-HCl 50 mM, pH=8.5) et par la réalisation de 3 cycles de congélation-décongélation (congélation : dans la carboglace ; décongélation : au bain- marie à 37°C). Le lysat ainsi obtenu a été ajouté au culot précédemment mis de côté.
Une solution de DNaseI (Roche, 20 mg.mL-1, 1/200) et de MgCl
2 (1 M, 1/100) a été ajoutée au mixte précédent, avant de le laisser incuber 30 min à 37°C. Après incubation, le mixte a été centrifugé 20 min à 3 700×g à 4°C. Le surnageant a été récupéré et transféré dans des tubes d’ultracentrifugation, préalablement préparés pour contenir un gradient discontinu d’iodixanol 15%-25%-40%-60% (Sigma). L’ultracentrifugation permettant la séparation zonale en gradient discontinu a été réalisée pendant 1.5 h à 59 000 rpm à température ambiante (TA).
La fraction AAV obtenue par ultracentrifugation a été purifiée à l’aide du kit Amicon Ultra-15 PL100 (Merck Millipore), selon le protocole du fournisseur. La solution finale ainsi obtenue contient les AAV dilués dans un volume défini par l’expérimentateur de PBS (phosphate-buffered saline 0.1 M) contenant 0.001% de Pluronic (Sigma). La concentration en particules virales a été déterminée par RT-qPCR (voir sections 8.4 pour plus de détails) ciblant les séquences ITR (voir Table II.10) et par comparaison avec une gamme étalon. Les titres ainsi obtenus sont exprimés en génomes viraux par millilitre (VG.mL-1).
2.3.I
NJECTIONS RETRO-
ORBITAIRESLes souris ont été anesthésiées par inhalation continue d’isoflurane. Une seringue à insuline (aiguille 30 G), chargée de 50 µL de PBS-Pluronic contenant 1011 particules virales, a été utilisée pour atteindre le sinus rétro-orbitaire, et ainsi injecter les AAV dans le système sanguin.