Structure et Catalyse

2.1. Organisation générale

La structure de CASP-2 comprend deux copies de monomères p19/p12. L’organisation générale est la même que pour les autres Caspase avec un cœur formé de 12 brins b centraux organisés en deux feuillets tête-bêche, entourés de quatorze hélicesa. En termes d’identité de séquence la CASP-9 est le membre le plus proche de la CASP-2. De plus, la CASP-2 présente une longue extrémité structurée N-terminale de la large sous-unité p19, une propriété partagée uniquement avec la CASP-1. Cette dernière, comme la CASP-2 présente un pont disulfure qui permet de stabiliser cette extension. L’édifice global est maintenu par des interactions au travers de l’interface de dimérisation, essentiellement entre les résidus des brins b centraux, portés par les petites sous-unités p12.

2.2. Structure

2.2.1. Topologie du site actif

Au sein du dimère, chaque monomère de CASP-2 possède un site actif, contrairement à la CASP-9 où une gêne stérique entre les résidus Tyr-331 et Phe-390 empêche la formation de deux sites actifs fonctionnels au sein du dimère (Renatus M. et al., 2001). En Figure 12C la liaison du site actif avec l’inhibiteur Ac-LDESD-CHO révèle les détails de l’interaction entre les sous-site de l’enzyme et l’inhibiteur. La composition du sous-site S1 est strictement conservé entre Caspase, compte tenu de la spécificité stricte de clivage après un Asp en P1. La chaîne de l’Asp est enfouie dans une poche profonde, chargée positivement et est stabilisée par des interactions électrostatiques avec les Arg-179 et Arg-341 ainsi que par liaison hydrogène avec Gln-283. L’oxygène du carbonyle en C-ter interagit avec le groupement imidazole de l’His-237 ainsi qu’avec le proton de l’amide de la Gly-238 qui forme en partie le trou oxyanion.

La poche S2 de l’enzyme n’est pas restrictive et tolère une grande variété de chaînes latérales, son implication dans la reconnaissance du substrat est donc considérée mineure.

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La majorité des Caspases accommodent préférentiellement un glutamate en P3 qui est stabilisé par interaction électrostatique avec l’Arg-341.

La poche S4 est décrite comme la plus sélective et par conséquent la plus déterminante pour la spécificité de substrat. En tant que Caspase du groupe II, CASP-2 tolère uniquement un Aspartate en P4. Le sous-site S4 de CASP-2 forme un tunnel très étroit où les deux oxygènes du carboxyle forme des liaisons hydrogènes avec Tyr-382, Asn-342, Trp-348 et par l’intermédiaire d’une molécule eau ordonnée avec Glu-380 et Arg-381 (Figure 12C).

Pour la CASP-2 la reconnaissance d’un résidu en P5 joue un rôle crucial dans la catalyse, contrairement aux autres Caspases. Une analyse de surface du site actif de CASP-2 a révélé une extension du site de liaison du substrat en N-ter formant ainsi un sous-site de reconnaissance supplémentaire qui permet d’accommoder un cinquième résidu. La poche hydrophobe S5 est formée par la chaîne latérale de Pro-385 et du groupement phényle de Tyr-383. Cette composition résulte en une préférence pour un petit résidu hydrophobe en P5. Au sein de cette poche, la bonne orientation du résidu est assurée par l’établissement de deux liaisons hydrogènes établies entre les groupes amino- et carboxy- du résidu en N-ter de l’inhibiteur avec les protons de l’amide de la chaîne principale et de l’hydroxyle de Thr-343. Ces observations font de Thr-343 et Tyr-383 des acides aminés essentiels pour la reconnaissance du résidu en P5 du substrat (Schweizer A. et al., 2003).

2.2.2. Cas de l’interface de dimérisation

Une propriété unique à la CASP-2 est la présence d’un pont disulfure au niveau de l’interface de dimérisation. En tout, quatre résidus cystéine, conservés, sont alignés au travers de l’interface. La paire centrale, Cys-390 (ne suit pas la convention de numérotation de CASP-1) et Cys-390’ (« ‘ » désignant les résidus portés par le second monomère) est engagée dans un pont disulfure enfouis au cœur de l’interface, tandis que Cys-329 et Cys-329’ ne forme pas de pont avec leur voisins respectifs Cys-390 et Cys-390’ bien que la géométrie de l’interface le permette. Toutefois, ce pont disulfure ne semble pas être impliqué dans la dimérisation et la stabilisation du dimère mais pourrait constituer un pont allostérique qui permettrait de réguler l’activité CASP-2 avec des effets à distance sur le site actif (Schweizer A. et al., 2003 ; MacKenzie S.H. et al., 2012).

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2.3. Mécanisme catalytique : La Caspase-2 en action

Pour expliquer la catalyse Tang Y. et al en 2011 ont suggéré un mécanisme en trois étapes : activation de l’enzyme, liaison du substrat et formation d’un intermédiaire tétraédrique suite à l’attaque nucléophile par la cystéine catalytique.

De subtils changements de conformations sont à noter pour la préparation de la CASP-2 pour la catalyse. Ces modifications se concentrent essentiellement au niveau des quatre boucles qui forment le site actif. Dans la structure en absence d’inhibiteur ou apoenzyme les boucles L1, L2, L3 et L4 sont flexibles et non structurées et Glu-217 (ne suit pas la convention de numérotation de CASP-1) porté par la boucle L1 forme un pont salin avec l’Arg-378. En revanche dans la forme complexée de l’enzyme avec l’inhibiteur, le pont salin est rompu et permet l’orientation de l’Arg-378 dans le sous-site S1. Ces observations suggèrent donc que la rupture du pont salin et l’organisation des boucles dans une configuration active surviennent à l’arrivée d’une molécule de substrat. La fixation des molécules de substrat se fait de manière séquentielle, c’est à dire qu’une molécule de substrat se fixe à un seul site actif, bien que l’autre site non occupé soit dans une conformation active également. Cela signifie que la fixation d’une molécule de substrat au niveau du second site actif ne se fait pas de manière coopérative puisque le site se trouve déjà dans une conformation active. Lorsque les deux sites actifs sont occupés l’attaque nucléophile de la cystéine sur le carbonyle du substrat permet la formation d’un intermédiaire tétraédrique, l’hydrolyse peut donc avoir lieu.

Figure 33. Modèle suggéré pour l’initiation de la catalyse pour CASP-2.

Représentation schématique reprenant les étapes de la catalyse. Dans la forme libre, les boucles L1, L2, L3 et L4 qui forment le site actif sont flexibles et désordonnées. Au cours de l’arrivée d’une molécule de substrat est associée à la réorganisation des boucles ainsi qu’à la rupture du pont salin. Ensuite, la liaison de deux molécules de substrat se fait de façon séquentielle et non coopérative. Enfin, l’attaque nucléophile par la cystéine catalytique permet la formation d’un intermédiaire tétraédrique.

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