Pro-Caspases monomériques et plateformes d’activation

L’organisation structurale des protéines adaptatrices requises pour l’activation des Caspases initiatrices et inflammatoires au sein des plates-formes d’activation, doit remplir trois critères. En premier lieu, la protéine doit posséder une région capable d’interagir directement ou indirectement avec les Caspases. Ces domaines sont issus de la super-famille des Death-Fold (DF) qui contient quatre membres distincts : les domaines de mort ou Death

Domain (DD) ; le domaine DED ; le domaine CARD ainsi que le Pyrin-Domain (PYD). En second

lieu, ces plates-formes doivent posséder un domaine d’oligomérisation qui facilite la formation de dimères ou d’oligomères. Enfin, la présence d’un domaine de régulation de l’activité de la plateforme est également nécessaire.

31

1.2.1. Activation des Caspases initiatrices (-2, -8, -9, -10)

Les Caspases initiatrices permettent la conversion d’un signal cellulaire de mort en une activité protéolytique puisque leur rôle est d’activer les Caspases exécutrices, en particulier les CASP-3 et -7. Bien qu’il soit clair que les zymogènes des Caspases initiatrices sont conservés sous forme de monomères inertes dans la cellule, leur mécanisme d’activation, lui, soulève encore quelques interrogations. Cependant, il existe un modèle d’activation largement admis qui est le modèle de dimérisation induite par proximité ou induced-proximity dimerization (Muzio M. et al., 1998 ; Salvesen G.S., Dixit, V.M. et al., 1999 ; Shi Y. 2004b). Ce modèle, largement testé et validé, repose sur le fait que les Caspases initiatrices nécessitent une étape de dimérisation pour être actives, et que cet évènement est une étape fondamentale du processus d’activation (Ramirez M.L.G. et al., 2018). Cette étape de dimérisation est déclenchée au niveau de plateformes multimériques spécialisées qui permettent le recrutement de nombreux zymogènes au sein d’un complexe dit d’activation.

1.2.1.1. Dimérisation induite par proximité

C’est en 1998, que fut introduit le modèle induit par proximité (Muzio M et al., 1998), pour rationaliser l’activation des Caspases initiatrices sachant qu’aucune autre protéase ne se trouvait en amont de leurs voies de signalisation pour les activer. Dans ce modèle initial, il était proposé qu’une activité résiduelle du zymogène des Caspases initiatrices était suffisante pour cliver et activer une autre pro-Caspase, à condition que les deux zymogènes soient apportées à proximité de plateformes d’activation multiprotéiques ; le PIDDosome pour CASP-2 ; le DISC - Death-Inducing Signaling Complex - pour les CASP-8 et -10 et l’Apoptosome pour la CASP-9. Il est à noter que l’on parle alors de zymogénicité pour caractériser cette activité enzymatique du zymogène qui se définit par le ratio de l’activité de l’enzyme active par rapport à l’activité du zymogène vis-à-vis d’un substrat donné.

À cette époque, il semblait donc que la protéolyse soit nécessaire à l’activation. Finalement, cette étape de clivage n’est pas essentielle à l’activation de ces Caspases initiatrices et constitue plutôt une étape de maturation qui favorise la stabilisation du dimère (Boatright K.M. et al., 2003).

Depuis quelques années, il est admis que la formation du dimère est une étape clé de l’activation des Caspases initiatrices. Ainsi, un nouveau modèle, basé sur le précédent, a été proposé à partir des travaux de Boatright K.M. et al., en 2003 et est représenté en Figure 4. Dans la cellule, les monomères existent en équilibre avec les formes dimériques, toutefois, la

32

forme monomérique majoritairement présente en condition physiologique. En effet, les constantes de dissociation, modélisées par le KD pour les CASP-8 et -9 sont de respectivement 50 et 100 µM, donc bien au-dessus des concentrations physiologiques (Renatus M. et al., 2001, Pop C et al., 2008, Mace P.D. et al., 2014). Ainsi, les zymogènes sont recrutés au niveau des plateformes d’activation, PIDDosome, DISC et Apoptosome via leurs domaines d’interactions CARD ou DED. Ensuite, la nature multimérique des plateformes permet d’augmenter considérablement la concentration locale en pro-Caspase, qui dépasse alors le KD, favorisant ainsi la formation de dimère. Autrement dit, le recrutement des pro-Caspases au niveau des complexes oligomériques force l’augmentation de la concentration locale en enzyme, convertissant ainsi une réaction de second ordre en une réaction de premier ordre qui permet de déplacer l’équilibre en faveur de la forme dimérique.

Le modèle d’activation induit par proximité accordait une importance majeure au clivage protéolytique dans le processus d’activation de ces Caspases. Cependant, les étapes de clivages consisteraient davantage en des étapes de maturation qui stabilisent le dimère nouvellement formé (Shiozaki E.N. et al., 2003).

Figure 4. Modèle d’activation des Caspases initiatrices -8 et -9.

Les caspases initiatrices sont synthétisées sous forme de monomère catalytiquement inactif. Dans la cellule, l’équilibre est majoritairement en faveur de la forme monomérique, avec des KD supérieurs à 50 µM, donc bien au-dessus des concentrations physiologiques, qui avoisinent environ 20 nM. Le recrutement des monomères au niveau de plates-formes oligomériques d’activation, permet d’augmenter la concentration locale en Caspases, qui devient supérieure au KD, favorisant ainsi le déplacement de l’équilibre vers la forme dimérique

(Boatright K.M. et al.,2003).

1.2.1.2. Le DISC : Plateforme d’activation de la Caspase-8

Le Death-inducing signaling complex ou DISC est une plateforme permettant l’activation des Caspases iniatrices-8 et -10. Ce processus requiert une étape de dimérisation selon le modèle de dimérisation induite par proximité ainsi que des étapes de clivage protéolytiques de maturation. Cette plateforme est un assemblage transmembranaire qui agit comme un conduit pour la transmission de signaux extracellulaires provenant de l’engagement de récepteurs de mort.

33

Fas (First apoptosis Signal) également connu sous le nom d’APO-1 (Apoptosis Antigen-1) ou CD95 pour cluster of différenciation est un membre de la grande famille des récepteurs de mort, un sous-ensemble de la famille des récepteurs au Facteur de Nécrose Tumorale ou TNF (Tumeur Necrosis Factor) (Nagata S. et al., 1995 ; Nagata S. 1997 ; Peter M.E. et al., 2003 ; Wilson N.S. et al., 2009). Il s’agit d’un récepteur transmembranaire qui possède dans sa région intracellulaire un module adaptateur, ou domaine de mort, DD - Death Domain - capable d’interactions homotypiques avec d’autres partenaires. Ainsi, sur la face extracellulaire, suite à la fixation d’un ligand FasL (Fas Ligand) hexamèrique (association de deux trimères) les récepteurs se regroupent tandis que sur la face cytosolique, le DD permet le recrutement de l’adaptateur protéique FADD - Fas-Associated protein with Death Domain- par son DD localisé en C-terminal (Holler N. et al., 2003). FADD, qui agit comme pont entre les caspases et l’extrémité C-ter du récepteur de mort, possède à son extrémité N-ter un domaine DED qui permet à son tour de recruter les CASP-8 et/ou -10 ainsi que cFLIP - cellular FLICE-like inhibitory

protein – via leurs domaines DEDs localisés sur leur pro-domaines (Figure 5A). Le complexe

ternaire formé par Fas, FADD et les caspases et/ou FLIP constitue le DISC (Figure 5B) (Fu T-M. et al., 2016).

Les CASP-8, -10 et cFLIP possèdent deux domaines DEDs (Figures 3A ; 5A). Les modèles actuels suggèrent qu’un seul DED, DED2, serait responsable du recrutement des zymogènes au niveau du DISC. Cependant, ces modèles n’expliquent pas la présence d’un second domaine et ne justifient pas le fait que les deux DEDs semblent être indispensables pour le recrutement au niveau du DISC. Aussi, les données structurales du DISC obtenues par Laura S. Dickens et al., en 2012 ont permis de lever le voile sur ces interrogations puisque selon ces travaux un DED serait impliqué dans le recrutement des zymogènes au niveau du DISC, tandis que l’autre permettrait le recrutement d’un nouveau zymogène. Ce recrutement se ferait par la formation d’une chaîne, ou filaments, de DEDs via des interactions avec un motif Phenylalanine/Leucine (FL) (Figure 5C) (Siegel R.M. et al., 1998). Cette théorie est validée par le fait que les DEDs des pc-8, -10 et cFLIP peuvent s’associer entre eux mais aussi l’association peut aussi se faire entre deux partenaires protéiques différents. Enfin, leurs données montrent qu’il y a neuf fois plus de CASP-8 que de FADD dans leur DISC, étayant donc leur théorie.

Dickens L.S. et al., proposent donc un modèle alternatif pour l’assemblage et la structure du DISC par lequel FADD serait en proportion inférieure et que le recrutement de la pc-8

34

s’effectuerait selon deux modes. D’une part, le zymogène est recruté par DED1 au DISC par l’adaptateur FADD. D’autre part, les molécules de pc-8 pourraient s’associer séquentiellement

via leur domaine DED2 libre pour former une chaîne d’activation. L’assemblage de cette

chaîne de domaines DEDs pourrait également expliquer qu’une faible proportion de DISC soit suffisante pour l’activation d’un grand nombre de CASP-8.

Au sein de ce complexe, CASP-8 et CASP-10 sont activées par homodimérisation et vont ensuite subir différentes étapes de clivages pour former des dimères matures capables de transmettre le signal de mort. Cependant, ce processus ne couvre qu’une partie du mécanisme d’activation de ces Caspases puisque d’autres protéines son également présentes au sein du DISC. Notamment cFLIP, l’homologue de CASP-8, qui possède deux domaines DEDs et qui peut également être recruté au niveau du DISC via FADD. Pour cFLIP, l’épissage alternatif de l’ARNm conduit à la synthèse d’un variant court (cFLIPS) qui ne possède pas de domaine catalytique Caspase-like et qui entre en compétition avec CASP-8 pour le recrutement au niveau du DISC. Un deuxième variant issu de l’épissage, est long (cFLIPL) mais son domaine catalytique Caspase-like est caractérisé par l’absence de résidus essentiels à la catalyse et à la fixation du substrat, résultant en une protéine catalytiquement inactive. L’hétérodimérisation avec cFLIPL active CASP-8 et CASP-10 puisqu’il possède les mêmes domaines catalytiques permettant une complémentarité des monomères à l’interface de dimérisation (Boatright K.M. et al., 2004 ; Yu J. W. et al., 2009). De plus la formation d’hétérodimère est favorisée face à la formation d’homodimères puisque la barrière d’activation pour l’hétérodimérisation est plus faible que pour l’homodimérisation. Compte tenu du fait que cFLIPL et pcases-8/-10 sont recrutés de manière équivalente, la formation d’hétérodimères sera privilégiée, bien que ces derniers ne puissent cliver que des substrats à proximité du DISC (Pop C. et al., 2011 ; Ashkenazi A. et al., 2014). Par conséquent une forte expression de cFLIPL inhibe plutôt qu’active la voie extrinsèque en perturbant la maturation de CASP-8. Toutefois, parce que l’expression du gène codant cFLIPL, CFLAR,est régulée par NFkB - Nuclear Factor-kappa B - sa concentration est variable dans la cellule et que l’épissage alternatif mène à des proportions variables des deux isoformes, l’implication de cFLIPL dans le processus d’activation s’en retrouve impactée (Ramirez M.L.G. et al., 2018 ; Galluzzi L. et al., 2018). Pour la CASP-8, les travaux de Oberst et al., en 2010, ont démontré que la dimérisation ainsi que le clivage inter-domaines est nécessaire à son activation. En effet, le clivage en absence de dimérisation ne produit pas une enzyme active et n’entraîne pas non plus la

35

propagation du signal de mort, bien qu’in vitro, la dimérisation seule conduise à une enzyme significativement moins active mais dont l’activité résiduelle permet la propagation du signal de mort. Finalement, le processus de clivage est nécessaire pour une activation efficace de l’enzyme.

Figure 5. Assemblage du DISC, plateforme d’activation des Caspases-8 et -10.

(A) Organisations en domaines des différents partenaires protéiques et hiérarchie de l’interaction au sein

du DISC. (B) La fixation en extracellulaire, d’un ligand hexamèrique (association de deux trimères) entraîne le regroupement de récepteurs de morts. D’après Fu T-M. et al., 2016 (C) Détail sur les deux modes de recrutement de la CASP-8 au sein du DISC. D’après Dickens L.S. et al., 2012.

1.2.1.3. Apoptosome et Activation de la Caspase-9

L’activation de la CASP-9 requiert le co-facteur Apaf-1 - Apoptotic Protease Activating

factor-1. En effet, en présence de cytochrome c et de dATP, Apaf-1 s’oligomérise pour former

l’Apoptosome. Ce processus est l’évènement clé de l’activation de la CASP-9.

Apaf-1 est une protéine multi-domaines, divisée en trois unités fonctionnelles : un domaine CARD en N-terminal, impliqué dans le recrutement de la pc-9 ; un domaine d’oligomérisation et de liaison au nucléotide NOD, pour Nucleotide-binding Oligomerization également nommée région NB-ARC (Nucleotide Binding-ARC), suivi de deux domaines de régulation WD40 permettent la fixation du cytochrome c en C-terminal. Le domaine NB-ARC est le centre de l’oligomérisation et est par conséquent au cœur de la formation de l’Apoptosome. Sa structure consiste en un domaine ATPase suivi d’un domaine WDH pour Winged Helix Domain, ainsi que d’un large domaine de liaison hélicoïdal, qui permet de relier les domaines WD40

A B

36

(Figure 6A) (Rield S.J. et al., 2005). Plus précisément, le domaine ATPasique de NB-ARC, s’organise en domaine a/b et en un petit domaine hélicoïdal et appartient à la famille AAA+ dont la caractéristique est la capacité à former des oligomères (hexa- et heptamères) (Rield S.J. et al., 2007).

En l’absence de signal de mort, Apaf-1 existe sous forme monomérique où les domaines WD40 maintiennent la structure dans un état inactif en venant se replier sur le reste de la protéine (Figure 6B – « locked form »). Suite à un signal apoptotique, la fixation du cytochrome c aux domaines WD40 induit le semi dépliement d’Apaf-1 et constitue la première étape de formation de l’Apoptosome. Cette étape est associée à l’hydrolyse du dATP en ADP.

Apaf-1 se retrouve alors dans une conformation semi-ouverte où les domaines CARD et NB-ARC sont dans une conformation inactive, car le domaine CARD reste inaccessible et ne peut pas permettre le recrutement de la CASP-9 ; l’oligomérisation ne peut pas avoir lieu car le domaine ATPase est lié à l’ADP. En effet, avant que le cytochrome c ne vienne se fixer, le dATP est lié à Apaf-1, ensuite l’hydrolyse du dATP en parallèle de la fixation du cytochrome c maintient Apaf-1 inhibée. Cette étape pourrait constituer un point de contrôle dans la formation de l’Apoptosome (Figure 6B – « autoinhibited form »).

Enfin, par des changements conformationnels, la poche de liaison à l’ADP se retrouve exposée et permet l’échange et la fixation d’ATP ou dATP – in vivo l’activation de l’Apoptosome favorise la fixation d’un dATP plutôt que de l’ATP bien que sa concentration soit nettement inférieure (10 µM) à ce dernier (2 mM). Cette dernière étape stabilise le monomère Apaf-1 dans une conformation étendue capable de s’oligomériser (Figure 6B – Apoptosome).

L’Apoptosome est composé de sept molécules d’Apaf-1 arrangées de manière symétrique en une structure en forme de roue, où le cœur central est formé par le domaine NB-ARC avec les deux domaines WD40 projetés vers l’extérieur (Li Y. et al., 2017). Dans la région ATPase le repliement a/b du petit domaine hélicoïdal lie les nucléotides ADP/dATP. Au centre de la structure les domaines CARD de Apaf-1 (ApCARD) s’organisent de manière désordonnée et s’organise que lors du recrutement de la pc-9. Aussi, suite à la formation de l’Apoptosome, le domaine CARD en N-terminal de la pc-9 (pc-9 CARD) interagit avec ApCARD permettant ainsi le recrutement de l’enzyme au niveau de la plateforme. La pc-9 se lie avec une stœchiométrie d’environ 4 : 7, car seulement 4 des 7 molécules d’Apaf-1 peuvent interagir avec pc-9 CARD du fait que le linker trop court entre ApCARD et le domaine ATPase empêche le positionnement d’autre zymogène au sein de la structure. ApCARD et pc-9 CARD forment alors

37

un disque au centre de l’Apoptosome qui peut être décrit comme une spirale des domaines CARDs, avec 4 domaines ApCARD qui forment une couche sur laquelle reposent 3 ou 4 pc-9 CARD. L’ensemble est stabilisé par des interactions avec des hélices a ainsi que par l’établissement de réseaux de liaisons hydrogènes et de ponts salins avec la région ATPase (Figure 8C).

Deux hypothèses sont avancées pour l’activation de la CASP-9 au sein de cette plateforme. Une première repose sur le modèle de dimérisation induite par proximité détaillé en page 32 (Renatus M. et al., 2001 ; Rield S.J. et al., 2007 ; Dorstyn L. et al., 2018). Une deuxième hypothèse tient compte d’un autre modèle dit de conformation induite, où la fonction d’Apaf-1 est d’aider la CASP-9 à adopter une conformation active grâce à sa liaison à l’Apoptosome (Hu Q. et al .2014 ; Li Y et al., 2017). Cette activation se ferait en deux étapes, l’activation allostérique par Apaf-1 succéderait à une étape de clivage du zymogène. Dans tous les cas, la fonction principale de l’Apoptosome est de permettre l’assemblage d’un complexe multimérique entre Apaf-1 et pc-9CARD pour faciliter l’activation de la CASP-9 en augmentant la concentration locale en zymogène.

Bien que le clivage de la CASP-9 ne soit pas nécessaire à son activation, il constitue une étape de maturation importante avec notamment des conséquences au niveau de la régulation de son activité, puisque cette étape permettrait de démasquer des sites nécessaires à la régulation de l’activité par les XIAPs (Twiddy D. et al., 2007). Il semblerait également que le clivage de CASP-9 contribue à la diminution de l’affinité de l’enzyme active pour l’Apoptosome en faveur de la fixation d’une nouvelle pc-9 au niveau de l’Apoptosome (Dorstyn L. et al., 2018). La CASP-9 active forme un homodimère où seulement l’un des deux sites actifs est fonctionnel. En effet, une gêne stérique liée à la présence d’un résidu aromatique encombrant sur le brin b6 au niveau de l’interface de dimérisation, prévient l’insertion de la boucle L3 et par conséquent empêche la formation d’un site actif intègre.

38

Figure 6. Formation de l’Apoptosome.

(A) Organisation en domaine d’Apaf-1. (B) Schéma représentatif de l’activation de l’Apoptosome (Rield S.J.

et al., 2007). (C) Vue de dessus et de côté de l’Apoptosome actif. La plateforme est composée de 7

molécules d’Apaf-1 arrangées de manière symétrique en une structure en forme de roue, où le cœur central (central hub) est formé par le domaine NB-ARC avec les deux domaines WD40 (jaune et bleu) projetés vers l’extérieur qui sont liés au cytochrome c (rouge). Au centre de l’Apoptosome, les 4 domaines ApCARD (vert) sur lesquels reposent 4 domaines pc-9 CARD (violet) forment le disk (Dorstyn L. et al., 2018).

1.2.2. Mécanisme d’activation des Caspases inflammatoires

Tout comme les caspases initiatrices, les caspases inflammatoires (-1, -4, -5, -12) sont synthétisées comme monomères inactifs. D’un point de vue structural, elles possèdent un long pro-domaine N-terminal avec un domaine CARD suivi du domaine catalytique avec une architecture proche de celle de la CASP-9. Dans les cellules de l’immunité innée, elles sont maintenues sous forme latente en attendant d’être recrutées au sein de plates-formes d’activation portant le nom d’inflammasomes. Au sein de ces complexes, elles sont activées par dimérisation et clivage (Martinon F. et al., 2002, 2004, 2007).

De manière étonnante, le mécanisme d’action de la première Caspase identifiée et cristallisée a été le moins étudié (Fuentes-Prior P. et al., 2004). La CASP-1 a été découverte en 1992 pour sa capacité à cliver et à activer la pro-interleukine- 1b (IL-1b) en IL-1b. Elle est ensuite rapidement considérée comme la principale protéase qui clive et active les deux cytokines inflammatoires proIL-1b et proIL-18 dans la plupart des conditions pathologiques. L’activation de la CASP-1 se fait par dimérisation et clivage de maturation consécutif à son recrutement au niveau de l’inflammasome. (Fernández D.J. et al., 2015).

A B

39

1.2.2.1. Organisation structurale et fonctionnelle de l’inflammasome

L’inflammasome est un complexe multiprotéiques servant à défendre la cellule contre l’attaque d’agents infectieux. Cette plateforme est formée par l’assemblage de trois classes de molécules : un récepteur ou senseur appartenant à la famille des récepteurs NLRs (Nucleotide-binding domain and Leucine-Rich repeat Receptors) ou ALRs (Absent in melanoma

2 (AIM2)-Like Receptors) (Rathinam V.A. et al., 2012), un adaptateur protéique ASC ou PyCARD

(Apoptosis-associated speck like protein containing a caspase recruitment domain) (Ippagunta S.K. et al., 2011) et la CASP-1 (Lu A. et al., 2015). La structure des différentes partenaires de cette plateforme sont présentées en Figure 7A. L’activation de l’inflammasome mène dans tous les cas à l’activation de la CASP-1 qui peut alors cliver les proIL-18 et 1b, qui sont ensuite sécrétées pour participer à la mort inflammatoire ou pyroptose.

• AIM2 (Absent In Melanoma 2) qui fait partie des ALRs est composée d’un domaine PYD en N-terminal et d’un domaine HIN pour Hematopoietic, interferon-inducible, nuclear

localization de 200 acides aminés en C-terminal (Hornung V. et al., 2009).

• Les NLRs ont une organisation plus complexe que les ALRs avec des domaines variables en N-terminal, suivi d’un domaine d’oligomérisation capable de fixer des nucléotides, NACHT. Ce domaine partage des similitudes avec la super famille AAA+ des ATPase, que l’on retrouve chez la protéine adaptatrice responsable de la formation de l’Apoptosome, Apaf-1. En C-terminal, les NLRs présentent un domaine de répétition riche en leucine ou LRR (Leucin-Rich Repeats).

La plus grande sous-famille de NLRs est la famille NLRP, où le « P » indique la présence d’un domaine PYD en N-terminal. Cette famille de récepteurs requiert la présence de la protéine ASC pour le recrutement et l’activation de la CASP-1, parmi ces récepteurs NLRP1 et NLRP3 ont été les premiers caractérisés. Les NAIPs (Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein) possèdent un domaine BIR (Baculovirus Inhibitior of apoptosis protein Repeat) en N-terminal. Les NAIPs répondent à différents facteurs de virulence, notamment la flagelline, qui est une protéine de structure majoritaire du flagelle bactérien. NLRC4 (CARD-containing NLR-4), initialement nommée IPAF pour ICE-protease-activating factor fait également parti des NLRs, et possède