Architecture du site actif

2.2.1. Généralités

Le site actif des enzymes est classiquement localisé sur une zone dite de « switch

point » proche de l’extrémité C-terminale d’un feuillet b central, dans lequel les boucles issues

de deux brins b adjacents lient respectivement, l’un à une hélice a localisée au-dessus du plan du feuillet et l’autre à une hélicea en-dessous du plan. Le site catalytique des Caspases suit cette topologie, avec l’His-237 localisée sur la boucle b3-a3, qui lie le brin b3 à l’hélice a3 du dessus du plan, tandis que le brin b1 adjacent est suivi de l’hélice a1, localisée en-dessous du feuillet. La boucle b1-a1 abrite l’un des résidus impliqués dans la reconnaissance du résidu en

B A

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P1 du substrat, l’Arginine-179 (Arg-179). Bien que moins évidente, la localisation de la Cys-285 respecte également cette position « switch point », puisqu’elle est localisée sur la boucle très variable, ou linker, qui lie la grande et la petite sous-unité, au niveau des brins b4-b5 (Figures 11B, C). Cette boucle issue du brin b4, qui se termine par la Glutamine-283 (Gln-283) très conservée, impliquée dans la liaison du substrat en P1, pointe vers la couche d’hélices a supérieure, tandis que la boucle provenant du brin b5 mène à l’hélice a4 localisée en dessous du feuillet. Enfin, la boucle b5-a4 contient également la seconde Arginine, Arg-341, impliquée dans la liaison du substrat en P1 (Walker N.P. et al., ; Wilson K.P. et al., 1994).

2.2.2. Sous-sites de reconnaissance

Chez les Caspases, la catalyse est gouvernée par la Cys-285 mais aussi par une spécificité stricte de clivage en C-terminal d’un résidu Aspartate. Cette spécificité rare parmi les protéases n’est partagée qu’avec la protéase à Sérine, Granzyme B. Le site actif des Caspases consiste en des sous-sites, ou poches, S5-S4-S3-S2-S1-S1’ qui lient respectivement les résidus P5-P4-P3-P2-P1-P1’ du substrat. La spécificité de reconnaissance est majoritairement conférée par les quatre acides aminés en N-terminal de la liaison scissile (P4-P3-P2-P1) (Figure 12) (Nicholson D.W. et al., 1999 ; Stennicke H.R. et al., 2000 ; Degterev A. et

al., 2003 ; Fuentes Prior P. et al., 2004 ; Poręba M. et al., 2013).

2.2.2.1. Sous-site S1

Le sous-site S1, étroit et profond qui accommode le résidu en P1 est formé par les boucles L1, L2 et L3. Ce sous site S1, quasiment identique entre Caspases est formé par les chaînes latérales des résidus très conservés : Arg-179, Arg-341 et Gln-283. La géométrie très restrictive de cette poche profonde, étroite et basique est parfaitement adaptée à la fixation d’un Aspartate, expliquant cette spécificité très singulière des Caspases (Stennicke H.R. et al., 2000). La constante kcat/KM permet à la fois d’apprécier à la fois la spécificité de reconnaissance et l’efficacité catalytique, aussi, plus la valeur de ce rapport est élevée plus la catalyse est efficace. Par ailleurs, pour les Caspases, la comparaison de ce ratio pour un substrat avec un Aspartate/Glutamate en P1 est d’environ 20.000, ce qui signifie que la présence d’un Glutamate dans ce sous-site est défavorable aussi bien pour la fixation à l’enzyme que pour la catalyse. L’exception est faite chez l’homologue Dronc, chez Drosophilia

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2.2.2.2. Sous-site S2

Puisque la chaîne latérale du résidu accommodé en P2 pointe vers l’extérieur du site actif, et se retrouve exposée au solvant, de nombreux résidus peuvent être accueillis au niveau de ce sous-site S2, bien que celui-ci soit aussi impliqué dans la spécificité de liaison. Notamment, le sous-sites S2 des CASP-3 et -7 est formé par les résidus Tyr-338, Trp-340 et Phe-381 et accommode préférentiellement de petits résidus aliphatiques en P2, tels que : Alanine ou Valine. En revanche, pour les Caspases inflammatoires et initiatrices, le sous-site S2 est plus large avec une substitution de la Tyr-338 par une Valine, ou Alanine pour la CASP-2. En conséquence, elles vont pouvoir tolérer des résidus plus encombrant en P2 (Degterev A.

et al., 2003 ; Thorberry N.A. et al., 1997).

2.2.2.3. Sous-site S3

Dans ce sous-site, il y a fixation préférentielle d’un Glutamate chez toutes les Caspases. Ce dernier interagit avec les chaînes latérales des résidus Arg-341 et Arg-177 en plus chez la CASP-8. Ainsi, l’Arg-341 joue un double rôle dans l’ancrage du substrat au niveau du site actif puisqu’en plus de son rôle dans le sous-site S1, elle est aussi engagée dans la fixation du résidu en P3, via l’interaction de son guanidium avec le carboxylate du Glutamate. Ceci explique la préférence pour ce résidu au niveau de cette poche. Cette interaction au niveau du sous-site S2 contribue au bon positionnement du substrat. De plus, la Ser-239, conservée dans la majorité des caspases (Figure 11C), et Arg-341 coordonnent les groupements amino- et carboxy- des liaisons formées au niveau de P1 et P3.

2.2.2.4. Sous-site S4

Alors que le sous-site S1 distingue les Caspases des autres protéases, le sous-site S4, formé par la boucle L4 de la petite sous-unité p10, est déterminant dans la spécificité de reconnaissance des substrats entre les Caspases. En effet, la CASP-1 inflammatoire, possède un sous-site S4 étendu, hydrophobe et peu profond, qui accommode des résidus encombrants hydrophobes tels que Trp ou Tyr. Ces informations sont également applicables aux CASP-4 et -5.

Les Caspases apoptotiques possèdent un Tryptophane (Trp-348) relativement conservé (Figure 12C) contrairement au résidu Ile/Val présents chez les CASP-1, -4 et -5, réduisant ainsi considérablement la taille de la poche S4. Pour les CASP-6, -8, -9 et -10, le noyau indole de ce résidu contribue à la reconnaissance de petits résidus aliphatiques en P4, par contacts de Van

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der Waals ainsi que par établissement de liaisons hydrogènes avec le carboxylate du résidu en P4. Pour les CASP-2, -3 et -8, un résidu Aspartate peut également occuper cette poche par des interactions avec les carboxamides de l’Asparagine-342 ou par interaction avec la Glutamine-381 pour la CASP-7. D’ailleurs, les CASP-3 et -7 présentent un sous-site étroit et bien défini qui enveloppe préférentiellement un Aspartate. La structure de leurs poches est conférée par un Trp-348 ainsi que par la structure de la boucle L4 qui fait un coude inversé irrégulier au-dessus du site actif. Les CASP-8 et -9 qui possèdent un sous-site de taille intermédiaire, montrent une préférence pour de petits résidus hydrophobes (Val, Leu) stabilisés par des contacts hydrophobes avec la chaîne aromatique de Tyr-340.

2.2.2.5. Sous-site S5

Parmi les Caspases, la CASP-2 est la seule qui requiert la reconnaissance d’un résidu en P5 pour une catalyse efficace. En effet, la présence d’un résidu dans cette poche S5 augmente de 35 fois l’activité catalytique. Cette particularité de la CASP-2 serait liée à l’agencement des résidus au niveau du sillon du site actif ainsi que la structure des boucles autour du site catalytique. Cette spécificité s’explique par la conformation fermée du sous-site S5 tandis que la région correspondante chez les autre Caspases présente une forme ouverte et davantage accessible au solvant (Schweizer A. et al., 2003).

2.2.2.6. Sous-site P1’

Ce site bien que moins restrictif que les sous-sites S1-S4, tolère les petits résidus tels que : Gly, Ala et Ser, ainsi que des chaînes aromatiques encombrantes (Phe/Tyr). En revanche, il exclut les résidus polaires ainsi que la Proline.

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Figure 12. Topologies du site actif des caspases humaines.

(A) Par convention, les résidus du substrat dans le site actif sont nommés à partir du résidu N-terminal de

la liaison scissile (flèche jaune) P1 et celui du côté C-terminal, P1’. Les autres résidus (représentés en vert) sont nommés consécutivement à partir de ces résidus. Chaque résidu du substrat occupe une poche spécifique au niveau de l’enzymes, noté S (représenté en bleu). Chaque sous-site est composé de chaînes latérales d’acides aminé de l’enzyme ainsi chaque sous-sites de l’enzyme (S5-S1’) reconnait un résidu (P5-P1’) (Poręba M. et al., 2013). (B) Représentation des liaisons hydrogènes et interactions de Van der Waals de l’inhibiteur Ac-DEVD-CHO lié aux sous-sites du site actif de la CASP-1. (Wei Y. et al., 2000) (C) et (D) Comparaison des sites actifs des Caspases-2 et -3 liées respectivement aux peptides aldéhydes Ac-LDESD-CHO et Ac-DEVD-Ac-LDESD-CHO. Les liaisons hydrogènes sont représentées en pointillés.