Activation des Caspases exécutrices

Les Caspases exécutrices (CASP-3, -6 et -7) partagent la même unité structurale du zymogène, en trois parties avec un pro-domaine N-terminal de petite taille (Figure 5A). Elles sont synthétisées dans la cellule sous forme de dimères stables. Maintenues inactives par un désordre structural au niveau du site actif, elles sont activées par clivage protéolytique entre les grandes et les petites sous-unités par les Caspases initiatrices, on parle alors de transactivation. Ces clivages induisent des réarrangements intramoléculaires qui vont stabiliser le dimère et donner lieu à une enzyme active capable de cliver des substrats cibles (Oberst A. et al., 2010). Le site actif des Caspases est localisé en surface et est formé par 4 boucles cruciales : L2, L3, L4 et L2’. L2-L4 étant la contribution du premier monomère et L2’-L4’ apportées par le second monomère (MacHenzie S.H. et al., 2012). Les boucles L2 et L2’, portées par chaque monomère, forment la région linker qui lient la grande et la petite sous-unités (Figure 9A).

Le mécanisme d’activation proposé pour les Caspases exécutrices s’est basé en premier lieu sur les études cristallographiques menées sur la CASP-7 (Chai J. et al., 2001). Aussi, les cristaux

Active Caspase-1

AIM2

NLRP3 A

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ne révèlent pas de différences notables entre les structures des CASP-7 (forme active) et pc-7 (forme inactive). En effet, au niveau de la dyade catalytique, la Cystéine 285 (Cys-285) n’est déplacée que de 2,5 Å tandis que le résidu Histidine 237 (His-237) conserve la même position (Fuentes Prior P. et al., 2004). Les différences majeures se concentrent au niveau des sous-sites de reconnaissance du substrat, au niveau des boucles L2, L3 et L4 (Figure 9A). En effet, dans la pc-7, trois (L2, L3 et L4) des 4 boucles formant le site actif (L2, L2’, L3 et L4) sont éloignées les unes des autres, dans une conformation inadaptée à la fixation du substrat. De plus, contrairement à la forme active, les boucles L3 et L4 sont désordonnées dans le zymogène. Ce désordre affecte d’une part l’Arginine 341 (Arg-341) qui joue un rôle crucial dans la reconnaissance du substrat puisqu’elle établit des contacts avec les résidus P1 et P3 du substrat et d’autre part, les résidus environnant le Tryptophane 340 (Trp-340) qui forment le sous-site de reconnaissance S2 dans la forme active de l’enzyme. Ces éléments attestent donc de la mauvaise conformation des sites de liaisons au substrat.

Le clivage du linker à lieu au niveau des boucles L2 et L2’ qui lie la grande et la petite sous-unité, après l’Aspartate 198 (Figure 3A). Cette étape est la première de l’activation des Caspases exécutrices. Ce clivage déclenche deux événements structuraux notables :

• D’une part, le clivage du linker (L2’ et L2, portées par chaque monomère) génère une nouvelle extrémité N-terminale de la petite sous-unité et C-terminale de la grande sous-unité, induisant la libération de la boucle L2’ qui va alors permettre la formation du faisceau de boucle en forme partiellement active avec L2 et L4, entraînant ensuite la rotation de 90° de la boucle L2. Ce mouvement de L2, permet un déplacement de la Cystéine catalytique au niveau du sous-site S1, la rendant alors accessible au solvant afin de préparer l’attaque nucléophile du substrat en P1.

• D’autre part, la boucle L3 est projetée vers la cavité centrale - espace qui sépare les deux monomères au niveau des brins b6 et b6’- à l’interface de dimérisation, résultant en la formation du site actif. Dans le zymogène, l’insertion de la boucle L3 est bloquée par le linker. Ensuite, une portion de la boucle L3 (bV-bIV), appelée elbow loop (boucle coude), vient former un réseau de liaisons hydrogènes avec la boucle L2 et d’autres chaînes latérales permettant alors de stabiliser le site actif.

La structure de la CASP-7, libre, en absence d’inhibiteur révèle une forme intermédiaire dans laquelle le site actif n’est ni dans une conformation pleinement active ni désordonné (Figure 9B). Dans ce cas, la boucle L2’ demeure au niveau de la cavité centrale et maintient une

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conformation désordonnée semblable à la structure du zymogène. En conséquence, le faisceau de boucles composé de L2, L2’, L3 et L4 n’est pas assemblé, bien que L3 et L4 soient dans une conformation active mais pas totalement stabilisées par les interactions avec L2’. Ce n’est que la liaison d’un substrat ou d’un inhibiteur qui entraîne une rotation de 180° de la boucle L2’ lui permettant de faire un mouvement vers le haut au niveau des boucles L1 – L4 pour former alors une structure active (Riedl S.J. et al., 2001).

Ces observations suggèrent que le clivage du linker seul ne soit pas suffisant pour activer totalement l’enzyme. La caspase active est donc une structure dynamique qui oscille entre deux états, avec une conformation désordonnée où la boucle L2’ occupe la cavité centrale et où le site actif n’est pas formé et d’autre part, la conformation active où la formation du faisceau de boucles permet un parfait alignement du site actif. C’est donc la liaison du substrat qui permet de bloquer l’enzyme dans un état actif (Degretev A. et al., 2003). La forte identité de séquences entre les domaines catalytiques des CASP-3, -6 et -7 (Figure 11C) suggèrent que les caractéristiques du zymogène ainsi que le mécanisme d’activation décrit ci-dessus pour la CASP-7 soit également applicable pour les CASP-3 et -6. Ainsi le clivage entre les grandes et petites sous-unités du domaine catalytique est un élément clé de l’activation des Caspases exécutrices. De plus, la libération du pro-domaine N-terminal peut succéder à l’activation mais ne semble pas indispensable à ce processus pour ces Caspases (Pop C. et al., 2009).

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Figure 9. Mécanisme d’activation de la pro-Caspase-7 humaine.

(A) La représentation en ruban montre la structure de la pc-7 (code PDB : 1GQF) ainsi que de l’enzyme libre

(code PDB : 1K86) et liée à un inhibiteur (code PBD : 1F1J). Les changements structuraux dans l’activation de cette enzyme sont minimes exceptés pour les boucles formant le site actif : L2, L2’, L3 et L4 respectivement colorées en vert, rouge et bleu. Les boucles L2 et L2’ portées par l’un et l’autre des monomères permettent de lier la grande et la petite sous-unité des domaines catalytiques, comme schématisé sur la structure du zymognène, où la partie verte modélise le pro-domaine N-terminal et les parties violettes représentent les boucles D’après Fuentes-Prior P et al., 2004 (B) Détail sur les mouvements des boucles au court de l’activation de la CASP-7. En bleu : pro-forme, en vert : forme libre et en rose : forme active. D’après Degterev A. et al., 2003.