Source de lumière

Une source de lumière est caractérisée par plusieurs paramètres : son spectre d’émission, sa divergence, sa cohérence (spatiale et temporelle) et l’intensité de son émission. Nous allons maintenant expliquer comment ces différents paramètres influent sur les performances du biocapteur SPR.

II.2.1.1. Longueur d’onde

Pour une source de lumière, le premier paramètre à choisir est la longueur d’onde. Pour l’imagerie SPR, ce choix résulte d’un compromis entre la sensibilité requise par le type d’interactions qui vont être mesurées, et la résolution latérale, liée à la longueur de propagation du plasmon (définie par l’équation (I-13)), requise pour imager les plots fonctionnalisés d’une taille donnée [110]. Une bonne sensibilité permet le suivi de petites molécules et de faibles concentrations tandis qu’une bonne résolution permet une plus grande densité d’informations (plots plus petits). Un exemple est donné dans la Figure 53 dans le cas de la fixation d’oligonucléotides de 20 bases (M = 6 kDa). Le taux de recouvrement (en fmol/mm2) représenté sur cette figure correspond à la densité de matière nécessaire pour provoquer une variation de réflectivité ∆R = 1 %, ce qui est suffisamment confortable pour une mesure. Dans le cas où une détection de 20 fmol/mm2 de ces brins d’ADN est requise, une longueur d’onde minimale λ = 665 nm sera nécessaire et va conduire à une résolution latérale, au mieux, de δx = 6,8 µm.

Figure 53 : Critères de choix de la longueur d’onde. La courbe rouge représente la valeur théorique de la longueur de propagation du plasmon de surface calculée d’après l’équation (I-13) dans le cas d’une interface entre un milieu métallique (nor = 0,13 + i⋅3,69) et un milieu

d’indice n = 1,333. La courbe noire est le taux de recouvrement correspondant à une variation de réflectivité de 1 % créée par une molécule de masse molaire M = 6 kDa, d’indice

de réfraction n = 1,41 et d’incrément d’indice ∂n/∂C = 0,188 mL/g (typiquement un oligonucléotide de 20 bases).

Sur notre montage, nous avons choisi une longueur d’onde autour de λ = 650 nm qui limite la résolution latérale à environ 5 µm et permet une mesure confortable d’environ 20 fmol/mm2 d’oligonucléotides de 20 bases, ce qui semble un bon compromis en vue des applications envisagées.

II.2.1.2. Largeur spectrale, cohérence temporelle et divergence

Une source n’est pas simplement caractérisée par sa longueur d’onde. Une source réelle est aussi caractérisée, en dehors des considérations d’intensité, par sa largeur spectrale définissant sa cohérence temporelle, ainsi que sa divergence. La largeur spectrale vient du fait qu’une source n’émet pas une longueur d’onde mais un intervalle de longueurs d’ondes ∆λ

autour d’une longueur d’onde centrale λ0. La cohérence temporelle sert à définir l’existence

ou non d’une relation de phase entre les photons et donc d’interférences, et est caractérisée par la longueur de cohérence de la source L. Enfin la divergence, qui est plutôt une caractéristique du système comprenant la source et le système optique d’illumination, traduit le fait que la source n’émette pas un faisceau parfaitement parallèle mais un intervalle d’angles de largeur 2⋅∆α.

La résonance des plasmons de surface étant définie pour un angle donné et une longueur d’onde donnée, le fait d’avoir plusieurs longueurs d’ondes et plusieurs angles d’incidence simultanément va influer sur la sensibilité du biocapteur. Pour finir, la troisième caractéristique, à savoir la cohérence temporelle, va, quant à elle, intervenir dans l’imagerie. La longueur de cohérence L est liée à la largeur spectrale par la relation suivante [15] :

2 0 c L λ ν λ = = ∆ ∆ (II-4)

Plus la source va être monochromatique (largeur spectrale faible), plus la longueur de cohérence va être élevée, ce qui va faciliter l’apparition d’interférences, phénomène non désiré lors de l’imagerie des biocapteurs. La grande longueur de cohérence des lasers (L > quelques mètres) est à l’origine du fourmillement lumineux observé dans les figures obtenues («speckle»); ce phénomène est provoqué par des interférences aléatoires, les différences de marche provenant de la diffusion de la lumière par les impuretés du milieu (poussières de l’air) ou des différences d’indice de réfraction des milieux traversés. Ce phénomène peut toutefois être limité par l’utilisation d’un verre dépoli tournant, juste après la source, qui va fortement diminuer la cohérence spatiale du faisceau.

L’influence de la largeur spectrale et de la divergence du faisceau sur la sensibilité de la SPR a été étudiée dans le cas d’une source de longueur d'onde λ = 650 nm, incidente sur un prisme en SF11, d’angle au sommet Ap = 32 °, recouvert d’une couche d’1 nm de chrome et

d’une couche de 48 nm d’or. La résonance des plasmons de surface se produit entre l’or et un milieu diélectrique d’indice de réfraction nc = 1,333 et est détectée par interrogation en

réflectivité (voir le paragraphe I.2.4). Dans les simulations qui suivent, la largeur spectrale et la divergence ont été matérialisées par une distribution uniforme des longueurs d’onde et des angles autour de leur valeur moyenne (une étude, non détaillée ici, considérant distribution gaussienne des longueurs d’onde donne des résultats quasiment identiques). La figure ci-

dessous illustre l’influence de la largeur spectrale : moins le faisceau sera monochromatique, plus le minimum de réflectivité à la résonance va être élevé (Figure 54A) et moins le biocapteur sera sensible aux interactions biologiques (Figure 54B).

Figure 54 : Influence de la largeur spectrale de la source sur la résonance des plasmons de surface illustré dans le cas de 3 largeurs spectrales (∆λ = 0 nm –> Noir, ∆λ = 20 nm –>

Rouge, ∆λ = 50 nm –> Bleu). (A) Réflectivité, en polarisation TM et pour une longueur d’onde λ = 650 nm, entre un prisme en SF11 recouvert de 1 nm de chrome et de 48 nm d’or en contact avec un milieu liquide (nd = 1,333) et (B) variations de réflectivité provoquée par

la fixation sur l’or d’une couche biologique d’indice n = 1,41 et d’épaisseur 1 nm.

L’influence de la divergence du faisceau est globalement similaire, son augmentation provoquant une diminution de la sensibilité. Afin d’évaluer de manière plus quantitative l’effet de ces deux paramètres, la réponse du biocapteur dans le cas d’un faisceau idéal (monochromatique et parallèle) a été normalisée à 1, ce qui fait que nous allons pouvoir définir les réponses SPR dans les autres configurations relativement à cette réponse idéale. Dans le cas d’une largeur spectrale inférieure à ∆λ = 30 nm et d’une demi-divergence inférieure à ∆α = 12 mrad ou 41 ’ d’arc (1 ° = 60 ’), la réponse relative du biocapteur est représentée dans la figure suivante.

Source actuelle

Figure 55 : Sensibilité théorique de la SPR en fonction de la largeur spectrale et de la divergence de la source. Ces valeurs ont été calculées à λ = 650 nm et normalisées à 1 pour

une source monochromatique et parfaitement collimatée.

Comme indiqué sur la Figure 55, une source de largeur spectrale ∆λ = 18 nm et de divergence 2⋅∆α = 4 mrad (soit 14 ’) permet d’obtenir une réponse à 95 % de la réponse théorique. Cette source correspond à une diode LED à λ = 650 nm (dont nous avons mesuré le spectre, représenté dans la Figure 56) collimatée par deux objectifs de microscope. Cette source va donc permettre d’obtenir un biocapteur quasiment aussi sensible qu’un laser (5 % de perte en sensibilité) tout en ayant une longueur de cohérence L = 24 µm (d’après l’équation (II-4)), ce qui évite tout phénomène d’interférences parasites nuisibles pour l’imagerie.

Une autre solution possible pour le choix de la source est un laser He-Ne, émettant à λ = 632,8 nm. A cela, il faut ajouter un verre dépoli tournant pour éviter les interférences parasites et un système optique d’élargissement du faisceau pour éclairer simultanément tout le biocapteur. La solution basée sur une diode LED collimatée, moins compliquée à mettre en place et moins onéreuse tout en ne dégradant quasiment pas la sensibilité du biocapteur, a donc été retenue.