Quantification des prises

Afin de pouvoir quantifier une interaction biomoléculaire, il est important de pouvoir passer de la grandeur optique mesurée à une grandeur biologique caractéristique de cette interaction. Cela constitue l’opération inverse de la transduction effectuée par le biocapteur SPR qui avait transformé la grandeur d’intérêt (biologique) en grandeur mesurable (optique). Les variations de réflectivité mesurée étant liées aux variations d’indice de réfraction et donc, de manière indirecte, aux changements de concentrations au voisinage de l’interface, nous allons tout naturellement convertir ces variations en quantité de matière déposée par unité de surface sur le transducteur, grandeur appelée Γ, le taux de recouvrement surfacique.

II.3.2.1. Conversion de ∆R en taux de recouvrement surfacique Γ

La conversion des variations de réflectivité en taux de recouvrement peut s’exprimer sous une forme assez complexe si nous appliquons rigoureusement les équations de Maxwell mais, Stenberg et al. [117] ont montré, par des simulations sans approximations basées sur ces équations de Maxwell que la réponse SPR varie de manière quasi-linéaire avec la concentration surfacique de protéines adsorbées et l’ont confirmé par des expériences avec des marqueurs radioactifs. Nous allons donc nous placer dans le régime où la réponse du capteur varie linéairement avec Γ. Cette approximation n’est valable que dans le cas où l’épaisseur de la couche formée est très petite devant la longueur de pénétration de l’onde évanescente dans le milieu couvrant (eb << Lzc≈ 100 nm) soit pour des épaisseurs de l’ordre

de quelques nanomètres. Cela se traduit par la relation suivante [78] :

c b b n n e n C − ⋅ Γ = ∂ ∂ (II-15)

avec nc, l’indice de réfraction du milieu couvrant, nb et eb, l’indice de réfraction et l’épaisseur

du milieu biologique et ∂n/∂C, l’incrément d’indice de la molécule étudiée en cm3⋅g-1 (voir Annexe 4).

L’indice du milieu couvrant étant connu, l’indice et l’incrément d’indice de la molécule biologique étant des propriétés intrinsèques de cette molécule pouvant aussi être connues (soit par des mesures avec un réflectomètre d’Abbe par exemple ou dans des ouvrages de référence [69]), l’équation (II-15) lie le taux de recouvrement surfacique avec l’augmentation de l’épaisseur d’une couche biologique en formation. Dans le cas où les

propriétés optiques de la molécule biologique ne sont pas connues, une première approximation, avec nb = 1,41 et ∂n/∂C = 0,19 cm3/g dans le cas d’oligonucléotides ou de

protéines, donne un bon ordre de grandeur de Γ car l’incrément d’indice ne varie que très peu en fonction des protéines [118, 119].

Il ne nous reste maintenant plus qu’à trouver une relation, linéaire elle aussi pour de faibles épaisseurs, liant les variations de réflectivité à l’augmentation de l’épaisseur eb du

milieu biologique. Cette relation est obtenue par calibration du système de mesure. Cette calibration peut se faire, entre autres, par mesure de la réponse SPR en fonction du changement d’indice de réfraction global du milieu couvrant [48] ou par des simulations basées sur les courbes ajustées décrites dans la partie précédente.

• Changement d’indice de réfraction du milieu couvrant

Cette méthode consiste à injecter successivement dans la cellule d’interactions le tampon d’interaction puis un milieu liquide d’indice voisin (∆nc≈ 10-3) tel que le même

tampon avec une dilution légèrement différente pour mesurer la réponse SPR induite par ce changement sur chaque plot. Ces deux solutions doivent être caractérisées précisément afin de connaître leur indice de réfraction à la longueur d’onde de travail. Pour une telle variation d’indice, la réponse (variation de réflectivité dans notre cas) est linéaire, ce qui nous permet de déduire la sensibilité SPR en fonction de l’indice du milieu couvrant que nous avions appelée SP,R dans le 1er chapitre.

, , Cal P R c Cal c R S n n ∆ = − (II-16)

avec ∆RCal la variation de réflectivité mesurée suite à l’injection du liquide de calibration

d’indice de réfraction nc,Cal en remplacement du milieu couvrant d’indice nc.

Cette grandeur SP,R, mesurée sur chaque plot, va nous permettre de quantifier tout

changement d’indice du milieu couvrant.

(

)

,

P R c

R S n n

∆ = ⋅ − (II-17)

Nous devons maintenant convertir l’apparition, au cours de l’expérience, d’une couche biologique d’indice de réfraction nb et d’épaisseur eb en variation d’indice du milieu couvrant

pour utiliser cette calibration. Nous allons donc définir un indice effectif neff prenant en

compte cette couche biologique ainsi que le milieu couvrant. Cet indice effectif va être calculé à partir d’une moyenne pondérée entre nb et nc. Logiquement, le poids de chaque

indice va correspondre à l’intensité de l’onde évanescente à la distance donnée [48].

0 1 ( ) exp c c eff Z Z z n n z L L ∞   = ⋅∫ ⋅ _− _⋅   dz (II-18) Sachant que n(0<z<eb) = nb et n(eb<z) = nc, nous obtenons :

(

)

(

)

c

eff c b c b Z

n = +n n −n ⋅ −_ −e L _ (II-19) L’hypothèse initiale de l’approximation linéaire étant que eb << Lzc, nous pouvons

simplifier l’équation (II-19).

( ) c b c eff c Z n n e n n L b − ⋅ = + (II-20)

La relation que nous cherchons à établir se déduit alors en combinant les équations (II-15), (II-17) et (II-20).

, c Z P R R L S n C ∆ ⋅ Γ = ⋅∂ ∂ (II-21)

Cette relation, très simple, va nous permettre de déduire le taux de recouvrement à partir des variations de réflectivité via trois paramètres. Le paramètre SP,R est obtenu par une

mesure de calibration réalisable facilement ; le paramètre Lzc s’obtient grâce à la formule

(I-12) et ne nécessite pas d’ajustement des courbes de réflectivité en fonction de l’angle d’incidence pour connaître l’indice de l’or car une précision de ± 10-2 sur cet indice ne change pas Lzd de plus de 1% ; enfin, le paramètre ∂n/∂C vaut 0,19 cm3/g pour toutes les protéines et

les oligonucléotides comme indiqué précédemment.

Une seconde méthode, qui peut être complémentaire à la précédente, pour déduire la valeur du taux de recouvrement surfacique Γ des mesures de variation de réflectivité consiste à ajuster les courbes de réflectivité en fonction de l’angle d’incidence obtenues sur chaque plot du biocapteur SPR en début d’expérience. Cet ajustement, décrit dans la partie II.3.1.2, détermine les indices et épaisseurs des différentes couches du capteur qui vont nous permettre de simuler numériquement un capteur SPR équivalent. Il suffit alors d’ajouter une couche de 1 nm d’épaisseur et de même indice nb que la molécule biologique d’intérêt à ce capteur

théorique et de calculer la nouvelle courbe de réflectivité. La différence de réflectivité ∆R(1 nm) entre les deux courbes à l’angle de travail en cinétique nous donne alors la sensibilité du biocapteur par nanomètre de couche biologique déposée.

Nous pouvons alors déduire directement la relation recherchée de l’équation (II-15).

(1 ) c b n n R n C R nm − ⋅∆ Γ = ∂ ∂ ⋅∆ (II-22)

Cette relation, contrairement à l’équation (II-21), dépend de l’indice nb du milieu

biologique mais, cette dépendance reste assez faible car une surestimation de nb va conduire

dans la simulation à une surestimation de ∆R(1nm) et, par voie de conséquence, à une sous- estimation de eb (et vice-versa), ce qui globalement va compenser l’erreur introduite. Il reste

que, pour pouvoir se servir de cette relation, les courbes de réflectivité en fonction de l’angle d’incidence au niveau de chaque plot doivent être ajustées, ce qui peut vite devenir laborieux.

Grâce à ces deux méthodes, utilisées indépendamment ou conjointement, nous pouvons maintenant convertir le signal mesuré en taux de recouvrement surfacique, c’est-à- dire que l’imagerie SPR permet de mesurer en temps réel la quantité de matière par unité de surface qui va se déposer sur chaque plot au cours de l’expérience.

Lorsqu’une expérience nécessite plusieurs étapes et que chaque étape est contrôlée par imagerie SPR, nous pouvons alors mesurer le taux de recouvrement pour chaque étape. Connaissant la masse molaire de chaque molécule injectée, nous pouvons en déduire le nombre de moles fixées par unité de surface à chaque étape, ce qui permet de calculer, par un simple rapport entre ces grandeurs, les rendements des interactions.

Par exemple, si le capteur est fonctionnalisé avec une espèce A, l’envoi d’une espèce B, connue pour interagir avec A, va se traduire par une certaine variation de réflectivité correspondant à un taux de recouvrement Γ1. Maintenant, si nous injectons l’espèce C, connue

pour interagir avec B (mais sur un autre site de fixation que celui de l’interaction avec A), nous pouvons aussi en déduire le taux de recouvrement Γ2 mais, de plus, nous pouvons alors

aussi connaître le rendement ρ2 de cette seconde interaction comme nous l’illustrerons dans le

chapitre suivant. 2 B 2 1 C M M ρ = Γ ⋅ Γ ⋅ (II-23)

avec MB et MC les masses molaires des espèces B et C respectivement.

Nous venons de voir différentes possibilités pour interpréter les réponses obtenues par notre banc d’imagerie SPR durant une expérience. Ces résultats peuvent être quantifiés et nous permettent d’obtenir le taux de recouvrement surfacique et le rendement de l’interaction, caractéristiques du résultat de l’interaction étudiée.