Nous allons tout d’abord commencer par valider les deux modèles simples décrits dans la Figure 98 et la Figure 99, ce qui devrait illustrer la spécificité des interactions anticorps/antigène. Le résultat de l’électrocopolymérisation des trois plots correspondant à l’IgG polyclonale de lapin, à l’IgG polyclonale d’humain, à l’IgG anti-hCG monoclonale HT13 issue de la souris ainsi que d’un plot composé uniquement de pyrrole est représenté sur la Figure 101. Cette image a été acquise sur notre banc SPR en polarisation TM lorsque la cuve en téflon est remplie d’eau et pour une incidence voisine de l’angle de travail en cinétique.
IgG humain ppy
IgG lapin IgG anti-hCG
Figure 101 : Image SPR en eau des plots d’immunoglobulines pyrrolées et du plot de polypyrrole (ppy).
Sur le bord droit de chaque plot déposé sur cette lame, nous apercevons une portion d’anneau de contraste différent du reste du plot. Cet anneau est très sûrement dû à l’extrémité du cône de la micropipette utilisée pour l’électrocopolymérisation (sous-partie II.1.2.2.3). La marque sur les plots indique que cette extrémité était irrégulière et qu’une partie de l’extrémité de l’embout était en contact avec la lame. Ceci ne gêne en rien les mesures puisque les bords des plots ne sont pas pris en compte pour les mesures. Ci-dessous est représentée la même lame où seules les zones utilisées par le programme pour l’analyse sont visibles.
IgG humain ppy
IgG lapin IgG anti-hCG
Figure 102 : Masque de calcul utilisé sur les images SPR des plots de la Figure 101.
Sur la Figure 102, nous voyons que les effets de bord ont disparu et que la zone d’intégration de chaque plot utilisée par le programme est assez homogène. Sur ces images, nous voyons aussi que les plots d’IgG polyclonaux (lapin et humain) sont plus contrastés, indiquant une plus grande épaisseur de ces plots et donc, a priori, une plus grande densité d’IgG déposée.
La première étape de notre expérience consistait donc à injecter les anticorps polyclonaux issus de la chèvre et dirigés contre les antigènes de lapin. Pour cette première étape, nous avions choisi une concentration d’injection de 2,2 nM. Les résultats de cette injection sont résumés dans la figure suivante.
IgG humain ppy
IgG lapin IgG anti-hCG
lapin
ppy
anti-hCG humain
Figure 103 : Image de la différence de réflectivité due au passage de l’IgG anti-lapin polyclonale issue de la chèvre (2,2 nM) et courbes de variation de réflectivité en fonction du temps correspondantes. Les deux barres verticales rouges matérialisent les transitions entre l’injection du tampon, de l’IgG (durant 2 heures) et du tampon ainsi que les images utilisées
pour la différence.
Le modèle IgG de lapin (Figure 99) a été testé pendant cette cinétique. Les résultats montrent que l’anticorps anti-lapin reconnaît bien l’IgG de lapin et qu’il ne reconnaît ni l’IgG anti-hCG FBT10 provenant de la souris ni l’IgG d’humain. Par contre, une légère fixation de cet anticorps s’est produite sur le polypyrrole non greffé, cette fixation est probablement due à une contamination du plot par de l’IgG de lapin lors du dépôt (mauvais rinçage du cône de pipette avant l’électrodéposition). Ces résultats, bien que laissant un doute sur le polypyrrole (qui a par la suite été levé lors d’expériences non présentées dans ce manuscrit), confirment la spécificité de l’interaction mais, le défaut de calibration du banc de mesure ne nous permettant pas de mesurer la réflectivité en pourcents, nous devons nous contenter pour l’instant de ces interprétations semi-quantitatives.
Bien que la concentration d’injection des anticorps (2,2 nM) soit inférieure à la concentration minimale détectable définie à la fin du premier chapitre (I.3.2), la détection de
l’interaction s’est faite sans aucune difficulté car cette concentration minimale détectable avait alors été définie pour un oligonucléotide de masse molaire MODN = 4,5 kDa alors que la masse
molaire d’une immunoglobuline vaut MIgG = 150 kDa. Malgré cela, l’utilisation d’une telle
concentration d’injection nous place dans de mauvaises conditions pour un calcul d’affinité fondé sur l’ajustement des cinétiques : toutes les cibles en solutions passant à proximité des plots se fixent sur la sonde, nous sommes limités par le phénomène de transport de masse (décrit précédemment dans la sous-partie II.3.3.4, page 147), ce qui implique que l’hypothèse d’une concentration constante en analyte utilisée dans le modèle monovalent (voir II.3.3.1) n’est plus valable. Nous avons injecté l’anticorps pendant deux heures et, bien que la quantité totale injectée soit largement suffisante pour saturer le plot, l’équilibre n’était toujours pas atteint lorsque nous avons commencé le rinçage. Cette hypothèse de limitation par transport de masse est validée par l’injection d’une concentration plus importante d’IgG anti-lapin dans la sous-partie suivante résultant en une cinétique d’interaction totalement différente.
La seconde étape de notre expérience consistait ensuite à injecter les anticorps polyclonaux issus de la souris et dirigés contre les antigènes humains. Pour cette seconde étape, nous avions choisi une concentration d’injection de 400 pM. Les résultats de cette injection sont résumés dans la figure suivante.
IgG humain ppy
IgG lapin IgG anti-hCG
lapin ppy anti-hCG humain
Figure 104 : Image de la différence de réflectivité due au passage de l’IgG anti-humain polyclonale issue de la souris (400 pM) et courbes de variation de réflectivité en fonction du
temps correspondantes. Les deux barres verticales rouges matérialisent les transitions entre l’injection du tampon, de l’IgG (durant 1 heure) et du tampon. Les images utilisées pour la
Le modèle IgG d’humain (Figure 98) a été testé pendant la cinétique de la Figure 104. Le brusque saut de réflectivité à l’injection des cibles diluées dans le milieu d’interaction est dû à un changement d’indice du milieu couvrant et est compensé lors du retour en tampon pour le rinçage. Cette cinétique a été faite directement après la cinétique de la Figure 103, sans régénération puisque seul le plot contenant l’IgG de lapin avait réagi. Les résultats montrent que l’IgG anti-humain provenant de la souris a reconnu les immunoglobulines polyclonales d’humain mais s’est aussi fixée sur le plot IgG de lapin. Nous pouvons interpréter cela de deux façons : soit l’IgG de souris reconnaît l’IgG de lapin, soit cet anticorps reconnaît l’IgG anti-lapin provenant de la chèvre qui s’était fixé durant l’étape précédente sur ce plot. C’est ce qui est appelé réaction croisée en immunologie, c’est-à-dire que c’est la réaction d'un anticorps avec un antigène différent de celui qui en a induit la formation, due à des parentés antigéniques entre ces antigènes. Dans notre cas, les deux antigènes cibles de l’anticorps sont des immunoglobulines de type G qui, bien que provenant d’espèces différentes, sont en grande partie homologues [151]. D’autres expériences, dont les résultats ne sont pas exposés ici, ont été réalisées en microscopie de fluorescence au CEA de Grenoble et ont confirmé, dans la même configuration, la réaction croisée de l’anticorps anti- humain avec l’anticorps de lapin.