Imagerie et multicapteurs

Les multicapteurs SPR forment le prolongement des monocapteurs SPR, c’est-à-dire qu’ils mettent en œuvre en chaque point de la surface fonctionnalisée des techniques utilisées précédemment pour une mesure moyennée sur cette même surface. Les premiers articles mentionnant l’imagerie SPR datent de 1988 [52] et le nombre de publications utilisant ce dispositif dans une grande variété d’applications n’a cessé d’augmenter depuis [53,54–59].

Comme expliqué dans le cadre des monocapteurs SPR, la condition de résonance des plasmons de surface donne une relation entre l’angle d’incidence et la longueur d’onde.

Lorsqu’une interaction biomoléculaire se produit, elle provoque une perturbation locale de l’indice du milieu diélectrique et va donc changer les conditions de la résonance. La méthode de mesure la plus répandue en imagerie SPR consiste à suivre, pour un angle d’incidence et une longueur d’onde fixés, les variations de la réflectivité dues au déplacement du pic d’absorption de la SPR, méthode que nous appellerons interrogation en réflectivité. En effet, l’imagerie en configuration d’interrogation angulaire, nécessiterait un balayage au rythme de la vitesse d’acquisition de la caméra, ce qui rendrait incompatible la précision voulue avec la durée des interactions mesurées. Une autre possibilité consiste à envoyer toutes les incidences simultanément. Une direction de la caméra correspond alors aux différents angles d’incidence, ce qui laisse l’autre direction libre pour suivre différentes sondes [55,56]. Nous parlons alors de multicapteurs 1D par opposition à l’interrogation en réflectivité permettant le suivi de multicapteurs 2D. Dans cette partie, nous allons nous concentrer sur les multicapteurs 2D.

Figure 21 : Biocapteur basé sur l’imagerie SPR, couplé par prisme et à interrogation en réflectivité. C : cuve, L1, L2: lentilles, P : prisme dont l’une des faces est recouverte d’or,

Pol : polariseur, S : source de lumière monochromatique, T : trou source. Le trait en pointillé indique que la lentille L2 conjugue l’interface métallique avec la caméra CCD.

Dans la Figure 21, un système optique, symbolisé par la lentille L2, permet d’imager la

la caméra est alors proportionnelle à l’intensité du faisceau réfléchi issu d’une zone particulière de la surface.

I.2.4.1. Protocole expérimental type

Pour qu’un système basé sur les variations de réflectivité soit optimal, il faut le placer dans des conditions où une perturbation donnée provoquera une variation maximale. Cette variation est maximale au point où la pente de la courbe de réflectivité (en fonction de l’angle d’incidence ou de la longueur d’onde) est maximale, comme illustré par la relation entre la Figure 15 et la Figure 16. Deux possibilités se présentent donc pour maximiser les variations de réflectivité mesurées : à longueur d’onde fixée, la mesure se fait à l’angle d’incidence de

travail θt vérifiant

( )

dR dR

dθ θ = dθ ou, à angle fixé, la mesure se fait à la longueur d’onde

de travail λt vérifiant

( )

dR dR

dλ λ = dλ . Ces deux possibilités aboutissent à la même

configuration où l’angle d’incidence et la longueur d’onde sont fixés.

• Détermination de l’angle de travail en cinétique θcin

La première opération du protocole expérimental consiste à se placer au bon endroit pour effectuer les mesures d’intérêt. Il faut donc mesurer, à longueur d’onde fixée, la réflectivité en fonction de l’angle d’incidence [57], ou, à angle fixé, la réflectivité en fonction de la longueur d’onde, sur une plage suffisamment importante afin d’englober la totalité du pic d’absorption dû à la SPR (Figure 15 et Figure 19).

Il suffit alors de se positionner à l’angle d’incidence de travail (resp. la longueur d’onde de travail) maximisant la pente de la courbe de réflectivité.

∆θ

∆R

Figure 22 : Réflectivité, en polarisation TM et pour une longueur d’onde λ = 660 nm, entre un prisme en BK7 (n = 1,514) et une couche d’or de 48 nm en contact avec un milieu liquide

(nc = 1,333). L’ajout d’une couche biologique fait passer de la courbe noire à la courbe

rouge.

• Mesure cinétique

L’étape suivante consiste alors à suivre les variations de réflectivité, à la position de travail calculée, en fonction du temps. Une cinétique d’interaction se divise en trois parties (voir Figure 23). Tout d’abord, la lame est mise en contact avec la solution tampon sans les cibles afin de mesurer la réflectivité initiale qui va servir de référence. Ensuite, les molécules cibles, diluées dans la même solution tampon, sont injectées et vont interagir avec les sondes, c’est l’association. Enfin, le tampon seul est de nouveau injecté, c’est la phase de rinçage ou dissociation. Cette dernière phase nous permet de mesurer la réflectivité finale dans les mêmes conditions que la réflectivité initiale. La différence de réflectivité correspond alors au changement d’indice provoqué par la fixation stable de la cible sur les sondes.

3

1 2

Figure 23 : Exemple de cinétique d’interaction. 1, injection du tampon (référence). 2, injection des cibles diluées en tampon (association). 3, rinçage en tampon (dissociation).

La sensibilité de ce type de biocapteurs basé sur l’imagerie SPR est du même ordre de grandeur que celle de la majorité des autres biocapteurs SPR, c’est-à-dire de l’ordre de Γ = 10 pg/mm2

[56]. Cette sensibilité peut aussi s’exprimer sous forme, pour un réactif donné, de la concentration minimale détectable. Cette sensibilité a été reportée, dans le cas de l’hybridation d’oligonucléotides, à Cmin = 10 nM pour des brins d’ADN de 18 bases [58] ou

de 15 bases [59].

La présence habituelle dans les laboratoires de nombreux biocapteurs basé sur la fluorescence analysant simultanément de nombreuses interactions ainsi que la percée de Biacore au cours de cette dernière décennie, permettant d’obtenir de nombreux paramètres sur une seule interaction ont fait grandir l’intérêt pour l’imagerie SPR. En effet, cette technique permet d’analyser finement de nombreuses interactions. Cela s’est traduit, depuis fin 2001, par la création d’entreprises ayant pour but de commercialiser ce type d’appareils tel Windsor Scientific [ 60 ], GWC [ 61 ] (issue des travaux de R.M. Corn et al. [53,58]), HTS Biosystems [62] (seule compagnie travaillant sur un système d’imagerie SPR couplé par réseau) ou encore Genoptics [63] (issue des travaux de P. Guédon et al. dans notre équipe [64]). Pour l’instant, à notre connaissance, seul Windsor Scientific a annoncé le lancement de son dispositif d’imagerie SPR sous le nom d’IBIS iSPR en mars 2003. Cette concurrence, tant

au niveau académique qu’industriel est un très bon indicateur de la potentialité d’un biocapteur basé sur l’imagerie SPR.