Fonctionnalisation du capteur

Pour analyser des interactions biomoléculaires à l’aide d’un biocapteur, un des réactifs impliqués dans l’interaction doit être fixé au transducteur. Il existe de nombreux moyens pour fixer cette espèce, que nous avons appelé sonde, à la surface métallique allant de la simple adsorption passive [37,85], à l’élaboration d’une structure chimique de liaison (comme les matrices d’hydrogel [86], les films électropolymérisés [87], les couches auto-assemblées [88],

etc…). Cette chimie va permettre une fixation stable des sondes sur la surface tout en limitant l’influence de cette surface en augmentant la distance entre celle-ci et les molécules biologiques (via un « bras espaceur »).

Une fois la sonde fixée par l’une de ces méthodes, la surface ainsi fonctionnalisée doit réagir spécifiquement avec la cible avec efficacité, ce qui implique une limitation des interactions non-spécifique et, si possible, la surface doit être réutilisable, c’est-à-dire que la surface doit résister aux conditions de régénération. Il faut donc que l’impact de l’environnement immédiat de la sonde (y compris la chimie de fixation) sur ses propriétés soit maîtrisé afin d’adapter la méthode de réalisation du biocapteur pour chaque type d’interaction étudiée, voire pour chaque application : la densité des sondes doit être judicieusement choisie pour limiter l’encombrement stérique et favoriser l’accessibilité des sites de réaction sur chaque molécule, les propriétés chimiques de la couche intermédiaire entre la surface métallique et les sondes ne doit pas adsorber non-spécifiquement les cibles, la localisation du greffage sur la sonde et longueur du bras espaceur ne doivent pas perturber la fonctionnalité de la sonde, etc…

Dans cette partie, nous allons décrire les différentes méthodes utilisées au sein de notre équipe pour fonctionnaliser les surfaces d’or : l’auto-assemblage moléculaire et l’électrocopolymérisation. Ces deux méthodes constituent l’étape finale et surtout l’étape cruciale du développement d’un biocapteur.

II.1.2.1. Auto-assemblage moléculaire

Ce type de fonctionnalisation de surface va être ici développé très succinctement car il a fait l’objet d’une partie importante du travail et du manuscrit de thèse de Nathalie Bassil [89], autre doctorante de l’équipe de recherche MOIC [90], dirigée par Yves Lévy, ayant effectué sa thèse parallèlement à la mienne. De plus, cet auto-assemblage moléculaire a été développé en collaboration avec l’équipe de recherche « assemblages macromoléculaires » [91] dirigée par Marie-Claude Millot du Laboratoire de Recherche sur les Polymères (LRP, CNRS UMR C7581, Thiais (94), France).

Comme de très nombreux procédés de fonctionnalisation de surface [92,93], celui-ci consiste à tapisser la surface d’avidine (ou streptavidine ou extravidine, molécules très voisines) afin de pouvoir fixer des sondes biotinylées à certains endroits de la surface. Ce type

de fonctionnalisation profite de la relative facilité de greffage de la biotine à de nombreuses molécules biologiques ainsi que de la très forte affinité entre l’avidine et la biotine (KA = 1015 M-1) [94]. La plupart des molécules biologiques (un brin d’ADN par exemple)

peuvent même être commandées directement avec une biotine à une de leurs extrémités pour un prix très voisin d’une molécule non greffée. Les molécules d’avidine, chargées négativement, sont liées à la surface par un assemblage électrostatique de couches chargées positivement puis négativement de façon alternative. La première couche, chargée positivement dans notre cas, est fixée sur l’or via une fonction thiol (–SH), connue pour interagir fortement sur l’or [95,96].

En résumé, nous fixons sur une lame d’or propre, selon un protocole approprié pour respecter les charges électriques de chaque réactif [89], une couche d’Acide 11- MercaptoUndécanoïque (MUA, pKa = 6,5) comprenant un groupe thiol à une extrémité et chargé négativement à l’autre, puis une couche de PolyEthylènImine (PEI) chargée positivement grâce à ses fonctions NH3+ et, pour finir, les molécules d’extravidine (pI = 6,5),

chargées négativement.

Une fois la lame uniformément recouverte d’extravidine, elle est insérée dans un appareil commercial de « microarraying » (QArray [97] de Genetix), c’est-à-dire un appareil capable, grâce à un système de micropositionnement, de déposer des volumes très faibles (quelques dizaines de nanolitres) de liquide à un endroit prédéfini. Ce type d’appareil, mis à notre disposition par Michel Goossens du Laboratoire de Génétique Moléculaire et Physiopathologie (INSERM U 468, Hôpital Henri Mondor, Créteil (94), France) dans le cadre d’une collaboration sur l’étude de séquences ADN impliquées dans la mucoviscidose, est donc utilisé pour déposer différentes séquences d’ADN biotinylées sous forme de microgouttes à des endroits spécifiques de la surface. Après l’étape de fonctionnalisation uniforme de la lame, ceci constitue l’étape de structuration 2D de cette lame. Ces deux étapes sont résumées dans la figure suivante :

Figure 45 : Description de la fonctionnalisation de surface par auto-assemblage moléculaire. Cet assemblage utilise les interactions or/thiol, électrostatiques puis avidine/biotine. La structuration en plots des interactions avidine/biotine permet, par exemple, d’obtenir une

lame fonctionnalisée en matrice de 10x10 plots de diamètre 250 µm telle l’image sur la droite.

Ce type de fonctionnalisation MUA/PEI/Avidine a ensuite été testé lors d’applications liées à la mucoviscidose et a fait l’objet d’une publication dans Sensors and Actuators B : chemical [98].

II.1.2.2. Pyrrole

La fonctionnalisation de surface par des polymères conducteurs (polypyrroles) a été développée au sein du groupe CREAB (Chimie de la Reconnaissance et Etude des Assemblages Biologiques) faisant partie du CEA/DSM/DRFMC/SI3M [99] (Commissariat à l’Energie Atomique / Direction des Sciences de la Matière / Département de Recherche

Fondamentale sur la Matière Condensée / Service des Interfaces et des Matériaux Moléculaires et Macromoléculaires) situé à Grenoble. Durant ma thèse, la plupart des applications que j’ai étudiées ont utilisé cette fonctionnalisation, ce qui a contribué à la caractérisation et à l’optimisation de cette technique que nous allons maintenant décrire.