Avantages et inconvénients des méthodes optiques directes

Nous allons maintenant détailler les avantages et les inconvénients inhérents aux caractéristiques principales des méthodes optiques directes en général et des biocapteurs SPR en particulier par rapport aux autres méthodes.

I.3.1.1. Absence de marquage

L’absence de marquage dans les biocapteurs optiques que nous avons présenté présente plusieurs avantages. Tout d’abord, cela simplifie la procédure de préparation des échantillons et d’utilisation du biocapteur [13]. Ensuite, dans certains cas, le marquage peut influer sur la fonctionnalité d’une molécule [73] et donc fausser les résultats de la mesure. Enfin, la détection sans marqueurs permet de contrôler toutes les étapes de l’utilisation du biocapteur, de la fonctionnalisation à l’interaction biomoléculaire d’intérêt en passant par les interactions intermédiaires alors que les méthodes indirectes ne permettent que de contrôler l’étape mettant en jeu les molécules marquées [74].

Par contre, la présence d’un marqueur permet d’effectuer des mesures très sensibles qui ne dépendent pas de la taille de la molécule. En effet, la mesure ne dépend que du type de marqueur utilisé et est totalement indépendante de la molécule d’intérêt. Ensuite, puisque la détection des marqueurs se fait sur fond noir, contrairement à la SPR, le bruit de photon est beaucoup plus faible dans ce cas, ce qui autorise des seuils de détection beaucoup plus faibles.

I.3.1.2. Mesure en temps réel

Dans les tests de reconnaissance immunologiques (comme ELISA), l’équilibre de réaction peut être perturbé par l’étape de rinçage alors qu’avec les biocapteurs SPR, la formation de complexes est mesurée en présence des molécules non liées, ce qui ne perturbe pas l’interaction. Cela permet aussi de caractériser des interactions de faible affinité qui ne se verraient pas en mesure de point final [75]. Reprenons l’exemple de la Figure 23 (page 52), correspondant à l’interaction de faible affinité entre un oligosaccharide et une protéine. Alors qu’au moment où nous avons stoppé l’association, la variation de réflectivité vaut ∆Rass≈ 3,2 %, la variation de réflectivité après rinçage vaut au plus ∆Rtotal≈ 0,4 % (la

dissociation n’est pas tout à fait finie sur le graphe). Cela correspond, dans ce cas très précis, à un gain de quasiment un ordre de grandeur en résolution entre la mesure en temps direct et la mesure en point final.

De plus, la mesure en temps réel permet d’obtenir plus d’informations sur la formation de complexes sonde/cible, en particulier sur le comportement dynamique de ces complexes formés lors de l’interaction. La constante d’affinité, caractérisant une interaction, est une grandeur statique déterminée par le quotient entre la constante d’association et la constante de

dissociation, deux grandeurs dynamiques [76]. Pour un complexe d’une affinité donnée, celle- ci peut être le résultat d’une forte association et d’une forte dissociation (complexes « rapides ») ou le résultat d’une association plus faible avec une dissociation quasiment nulle (complexes « collants ») par exemple [77]. Ce type d’informations ne peut être obtenu par des mesures en point final.

I.3.1.3. Détection en parallèle

Comme son nom l’indique, la détection en parallèle permet de suivre simultanément l’interaction de cibles avec plusieurs sondes, fixées en différents endroits de la surface fonctionnalisée du biocapteur. Cette possibilité entraîne un gain de temps et une réduction de la consommation de produits biologiques en évitant de refaire n fois l’expérience pour n sondes différentes. De plus, les différentes interactions suivies en parallèle étant réalisées en même temps et dans les mêmes conditions sur le même biocapteur, la comparaison des résultats en fonction de la sonde est beaucoup plus aisée grâce à de plus faibles variations intra-analyses [28].

En contrepartie, la préparation du biocapteur est plus longue et plus compliquée. La mise en parallèle des interactions nécessite une fonctionnalisation en plots submillimétriques (entre quelques dizaines de microns et 800 µm) spécifiques au lieu d’une chimie de fixation uniforme sur toute la surface du biocapteur (ce point capital sera développé dans la partie II.1).

I.3.1.4. Sensibilité

La SPR détecte des changements d’indice au niveau de l’interface métal/diélectrique et, par conséquent, des variations de masse au niveau de cette interface. Ce système aura donc une résolution bien meilleure dans le cas de l’étude de grosses molécules telles des anticorps. Dans le domaine de la protéomique ou étude de la fonctionnalité des protéines, la sensibilité de la SPR est tout à fait suffisante. Par contre, pour l’étude de petites molécules telles des oligonucléotides courts, la résolution de la SPR est beaucoup plus faible que celle de la fluorescence (voir I.3.2). Mais, même dans ce cas, les avantages décrits précédemment (mesure en temps réel, absence de marquage, détection en parallèle) donnent une utilité aux études en SPR. Tout cela, sans compter sur la possibilité d’amplifier la réponse SPR.

Revenons sur ces différentes méthodes d’amélioration de la sensibilité présentées ci- dessus. L’utilisation de la méthode sandwich est très intéressante dans les cas où seule la réponse finale importe (la cinétique est perdue) car très simple à réaliser et relativement bon marché. Malheureusement, il n’est pas toujours possible de réaliser une interaction secondaire car il faut trouver une molécule interagissant de manière spécifique avec un site encore libre de la cible, cela dépend de l’interaction étudiée. L’utilisation de la spectrométrie de masse permet d’identifier, dans le cas de milieux complexes, les molécules ayant réagi. Cette approche est plutôt complémentaire de la SPR mais, dans le cas de réponses SPR très faibles, voire non détectables, le biocapteur ne sert plus qu’en temps que filtre sélectionnant les molécules à analyser par spectrométrie de masse, ce qui limite cette complémentarité. Enfin, la méthode de suivi de la phase peut, sous condition d’un contrôle très strict des conditions opératoires (température, …), améliorer la sensibilité pour la détection de petites molécules. Par contre, elle ne permet un gain notable en sensibilité que sur une très faible dynamique, c’est-à-dire que dans le cas de grosses molécules comme des anticorps (M ≈ 150 kDa), le gain apporté par cette méthode n’est pas évident.