Imagerie et caméra

Les critères précédents étant remplis, l’image des capteurs se fait par un système afocal de grandissement Gy = -1, identique au système optique du bras source, sur une caméra

CCD. Pour des raisons de symétrie, ce système va nous permettre de mesurer la réflectivité en fonction de l’angle d’incidence sur une plage de 14° centrée autour de l’angle de résonance des plasmons de surface (entre l’or et l’eau à λ = 650 nm). La courbe théorique de ce que devrait mesurer un tel système est représentée dans la Figure 69.

θ

Figure 69 : Réflectivité en fonction de l’angle d’incidence extérieur de l’interface or/eau à

λ = 650 nm pour un prisme en SF11 d’angle au sommet Ap = 32 °. La polarisation TE (TM)

est représentée en rouge (noir).L’angle θt représente l’angle de travail en cinétique. Seuls ont

été représentés les angles atteignables avec le système afocal décrit plus haut.

Le choix de la caméra CCD est important pour une quantification précise des interactions. Une caméra CCD est toujours accompagnée d’une carte d’acquisition pour exploiter l’image obtenue sur un ordinateur personnel. La caméra peut être analogique et, dans ce cas, la conversion analogique/numérique se fait au niveau de la carte d’acquisition ou numérique, ce qui veut dire que le signal sortant de la caméra est déjà numérisé. Le système (caméra + carte) va convertir le nombre de photons reçu par chaque pixel durant une exposition en niveaux de gris. Selon les caméras, la conversion se fait sur 256, 4 096 ou 65 536 niveaux, ce qui correspond, respectivement, à 8, 12 ou 16 bits. Notre choix s’est porté sur une caméra 12 bits non refroidie (Pixelfly de chez Photonlines [114]) pour plusieurs raisons. Tout d’abord, contrairement aux caméras 8 bits, dont la plupart est destinée à la visualisation d’images sur un écran, cette caméra 12 bits est avant tout destinée à une utilisation scientifique, c’est-à-dire à une quantification des images mesurées. Cela se traduit par une très bonne linéarité de la réponse en niveaux de gris en fonction de l’intensité incidente (Figure 70). De plus, 12 bits correspondent à 4096 niveaux de gris, ce qui va être beaucoup plus précis que les 256 niveaux habituels.

Figure 70 : Comparaison de la linéarité de la réponse d’une caméra 8 bits « de visualisation » et d’une caméra 12 bits « scientifique ».

Avant de justifier l’utilisation d’une caméra non refroidie, nous allons rappeler les différentes sources de bruit intervenant lors de l’utilisation d’une caméra CCD. Le bruit total sur une mesure peut être décomposé en bruit de photons (dû au signal lui-même), bruit thermique (dû à la matrice CCD) et bruit de lecture (dû à l’électronique).

2

total e r

B = P Q t⋅ ⋅ + ⋅ +D t N (II-10) avec P, le flux de photons incident sur la CCD (photons/pix/s), Q_e, le rendement quantique de

la CCD, t, le temps d’intégration (s), D, le courant d’obscurité (e-_{/pix/s) et Nr, le bruit de}

lecture.

• Bruit de photon ( P Q t⋅ ⋅ ) : bruit intrinsèque à la source observée (ne dépend pas de _e

l’instrument) égal à la racine carrée du nombre de photons reçus.

• Bruit de lecture ( N ) : bruit dû à l’efficacité du transfert de charges, qui intervient à chaque mesure, et qui est généralement compris entre 10 et 100 e-_/pixel.

• Bruit thermique ( D t⋅ ) ou Courant d’obscurité [115] : Bruit dû au nombre d’électrons générés spontanément durant la pose et la lecture, proportionnel au temps de pose, généralement compris entre 1 et 100 e-_{/s à 20°C. Ce courant d’obscurité est le résultat}

d’imperfections ou d’impuretés dans le silicium. Ces sites induisent des états électroniques dans la bande interdite qui vont agir comme des marches entre la bande de valence et la bande de conduction du semi-conducteur, fournissant un chemin aux électrons de valence pour s’échapper dans la bande de conduction. Cette fuite va alors s’ajouter au signal mesuré sur le pixel. La génération du courant d’obscurité est un processus thermique (d’où l’appellation bruit thermique) où les électrons utilisent l’énergie thermique pour accéder à un état intermédiaire d’où ils vont être émis dans la bande de conduction. Pour cette raison, la manière la plus efficace de réduire le courant d’obscurité est de refroidir la CCD, ce qui va empêcher les électrons d’atteindre cet état intermédiaire. Ce bruit est divisé par 2 chaque fois que la caméra est refroidie de 6°.

D’autres sources possibles de bruit comme les fluctuations d’intensité de la source (limitées par une alimentation stabilisée) ou les fluctuations de la température ambiante influent aussi sur le signal mesuré.

La mesure des variations de réflectivité durant les interactions nécessite la mesure d’une grandeur de référence (voir la partie II.3.1). La grandeur choisie dans notre cas est la réflectivité en polarisation TE de la couche d’or. Le plasmon de surface n’étant excité qu’en mode TM, la réflectivité TE ne dépend pas des espèces déposées sur la lame d’or et constitue donc une bonne référence. Sachant que RTE≈ 90 % et que, dans les conditions habituelles,

nous mesurons des variations de réflectivité autour de 25 % (voir Figure 69), si nous voulons utiliser toute la dynamique de la caméra, il faut que les 90 % de réflectivité créent un signal d’environ 4 000 niveaux de gris. Ce réglage s’effectue en choisissant judicieusement le temps d’intégration d’une image et en contrôlant sur l’histogramme des images acquises que nous sommes proches de la saturation sans l’atteindre. La caméra choisie permet une lecture des pixels par quatre en mode binning 2x2, chaque groupe mesurant 13,4x13,4 µm et ayant une capacité de 60 000 électrons. Un temps d’acquisition d’environ 5 ms va générer ces 60 000 électrons par pixel dans le cadre de la mesure de la réflectivité TE. Nous allons pouvoir déduire de ces informations les différentes composantes du bruit total sur chaque pixel lors de la mesure des cinétiques d’interaction (RTM≈ 25 %) :

3 25 60000 130 90 3 5.10 0,1 10 17 photon thermique lecture B e B D t e e B e − − − − − = ⋅ ≈ = ⋅ = ⋅ ≈ < < (II-11)

L’équation (II-11) nous montre clairement que le bruit thermique est négligeable devant le bruit de photon. Dans un tel système où le flux incident est suffisamment élevé pour utiliser des temps d’acquisition très court, le bruit est essentiellement déterminé par le bruit de photon et le fait de refroidir la caméra n’apporte alors aucun gain en sensibilité.

Sachant que 60 000 e- représentent 4096 niveaux, le bruit moyen de la caméra, dans les conditions d’utilisation en cinétique, vaut 9 niveaux de gris par pixel. Sur chaque plot fonctionnalisé, le bruit va varier selon la racine carrée du nombre de pixels et du nombre d’images moyennées pour faire un calcul de réflectivité. Une mesure expérimentale du bruit de la caméra seule nous montre que le bruit par plot suit bien cette loi mais jusqu’à une certaine valeur seulement (voir Annexe 5). Pour un plot imagé sur 25 pixels (≈ 80 µm de diamètre) et dont chaque valeur de réflectivité est calculée à partir de 25 images acquises à la suite, le bruit moyen vaut 0,9 niveaux de gris. Si nous augmentons le nombre d’acquisitions ou la taille des plots, le bruit ne diminue plus. Dans les conditions habituelles d’utilisation, cela correspond à un bruit dû au système de détection de ± 0,02 % de variation de réflectivité sur chaque plot. Cette valeur correspond à la sensibilité maximale du système, c’est-à-dire à un seuil de détection de 4 pg/mm2 (0,9 fmol/mm2 pour un brin d’ADN de 15 bases ou un changement d’indice de la solution couvrante de ∆n = 8.10-6).