Problématique et objectifs

Les fruits d’agrumes contiennent plusieurs groupes de métabolites secondaires, dont les caroténoïdes. Les fortes concentrations et la diversité des caroténoïdes présents dans les fruits d’agrumes sont des caractéristiques importantes pour la qualité nutritionnelle des fruits. Différentes études ont montré qu’il était possible d’augmenter substantiellement la concentration en caroténoïdes chez la carotte (+120%), l’épinard (30%) et la tomate (50%) (Abushita et al., 2000; Kidmose et al., 2000), à travers des approches purement agronomiques. Le levier environnemental peut être utilisé pour augmenter considérablement la concentration en caroténoïdes d’une large gamme de fruits et de légumes (Poiroux-Gonord et al., 2010). Parmi les approches utilisées, deux facteurs semblent prédominants : le statut carboné et le statut redox. Il est en effet généralement admis que le statut carboné influence la biosynthèse des métabolites secondaires, notamment par la disponibilité des précurseurs essentiels à leur biogénèse. Les théories déterministes, élaborées par les écologues, essayent de prédire comment les plantes allouent les ressources alors que les théories mécanistes élaborées par les physiologistes sont basées sur le rôle modulateur et signal des sucres. De la même façon, tous les stress induisent un stress oxydatif et une production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui jouent un rôle dans la régulation de la voie de biosynthèse des caroténoïdes. Par exemple, les caroténoïdes sont de forts antioxydants et sont utilisés à des fins de détoxication. Ils jouent un rôle important dans la dissipation de l’énergie absorbée en excès par les tissus photosynthétiques à travers le cycle des xanthophylles.

Partie I : Introduction bibliographique

65 Dans le but de produire des fruits d’agrumes à teneurs augmentées ou garanties en caroténoïdes, ces deux hypothèses ont été étudiées dans le cadre de ce travail de thèse.

Le premier objectif a été de déterminer l’impact de l’alimentation en sucres sur les critères de qualité organoleptiques (calibre, maturité, sucres et acides organiques) et sur les critères de qualité nutritionnels (caroténoïdes). Cette étude s’est déroulée en deux étapes successives. Dans un premier temps, nous avons appliqué différentes charges en fruits dans le but de modifier l’alimentation carbonée à un stade de développement unique, juste après la chute physiologique afin d’observer les variations dans les critères de qualité, et notamment dans la concentration en caroténoïdes de la pulpe du fruit à différents stades de maturité. Dans un deuxième temps, nous avons mis en place ces différentes charges en fruits, par défoliation ou ombrage des feuilles de façon à tester l’effet du stade d’application du traitement : après la chute physiologique des fruits, au changement de couleur, et au stade de maturité. Les effets ont été étudiés à une date précise correspondant à la maturité pour les fruits témoins. Cette expérimentation a plusieurs intérêts. Premièrement, elle avait pour but de déterminer à quel stade de développement du fruit, une forte charge en fruit est plus propice à l’amélioration de certains critères de qualité tels que la concentration en caroténoïdes, tout en maintenant le calibre et la cinétique de maturité du fruit.

Deuxièmement, cette étude avait pour but de définir si la durée d’application du traitement est un élément déterminant dans l’amélioration de la concentration en caroténoïdes.

Le deuxième objectif a été d’étudier un effet éventuel d’un stress photooxydatif appliqué sur des feuilles, à l’aide de différentes ombrières, sur les paramètres photosynthétiques des feuilles. Puis, nous avons observé les effets que ce stress photooxydatif pouvait produire dans la pulpe du fruit et notamment sur le métabolisme antioxydant, d’une part, et sur la concentration en caroténoïdes, d’autre part.

Partie II : Matériels et

méthodes

Partie II : Matériels et méthodes

67 I. Le matériel végétal

Les expérimentations ont été réalisées sur des clémentiniers âgés de 18 ans et des orangers ‘Navelate’ âgés de 15 ans. Les arbres sont issus d’un verger expérimental sur le domaine INRA-CIRAD de San Giuliano en Corse (42°18’55’’ N, 9°29’29’’ E ; 51m a.s.l.). Les clémentiniers (Citrus clementina Hort. Ex Tan.) sont greffés sur le porte-greffe Citrange-Carrizo et les orangers (Citrus sinensis (L.) Osbeck) sur le porte-greffe Poncirus trifoliata (L.) Raf. Les arbres ont une hauteur d’environ 2,5 m et sont espacés de 4 m dans un même rang et de 6 m entre les rangs. Les expérimentations ont été réalisées sur des arbres irrigués, indemnes de maladies et soumis aux mêmes conditions culturales (fertilisation et traitements phytosanitaires).

II. Les dispositifs expérimentaux

II.1. Effet de l’alimentation en sucres sur les critères de qualité des fruits d’agrumes

II.1.1. Première étude : en fonction du stade de maturité des fruits

27 rameaux composés de pousses âgées de moins d’un an ont été sélectionnés sur la face est des clémentiniers et à hauteur d’hommes (environ 1,50 m). Les rameaux sont répartis sur 10 arbres, ont un diamètre équivalent (environ 1 cm) et sont exposés de manière similaire. La pleine floraison a été observée à la mi-avril et les rameaux ont été

« annelés » après la chute physiologique des fruits, à la mi-juillet. L’annélation a consisté à enlever un morceau de l’écorce large de 10 à 15 mm au milieu de la tige principale de chaque rameau afin d’empêcher tout transport des assimilats depuis les rameaux vers le reste de l’arbre, ou inversement. Seules les connexions phloémiennes ont été supprimées.

Les traitements ont été appliqués aléatoirement, à raison de 2 ou 3 rameaux fructifères par arbre. Chaque rameau possède un seul fruit. Pour le témoin, les rameaux ont été annelés à 30 feuilles. Ce traitement correspond à une charge en fruit faible par rapport au nombre de feuilles. Ce rapport élevé (30 feuilles par fruit) ou cette faible charge en fruits, a été choisi en fonction d’études précédentes, et il garantit un approvisionnement en sucres non-limitant

68 pour le développement et la croissance du fruit. Pour le second traitement, 15 feuilles par rameaux ont été conservées (charge en fruits moyenne). Et pour le troisième traitement, 5 feuilles par rameaux ont été gardées. Ce dernier traitement correspond à une charge en fruits élevée. Aucune chute de fruits n’a été observée durant l’expérimentation.

Durant l’expérimentation, les données climatiques ont été enregistrées : température, pluviométrie et rayonnement global (Tableau 5).

Tableau 5: Données climatiques du mois de juillet 2007 au mois de janvier 2008 à San Giuliano.

T min (°C)* T max (°C)* T moy (°C)* Pluviométrie

journalière ; T moy : température mensuelle moyenne.

3 fruits par traitement ont été récoltés, pour chacune des trois dates de récolte choisies: 25 octobre 2007 (date I), 22 novembre 2007 (date II), et 9 janvier 2008 (date III). La maturité des fruits a été estimée en utilisant des indicateurs de maturité tels que l’extrait sec soluble (ESS), l’acidité titrable (AT) et l’indice de maturité (ESS/AT).

II.1.2. Deuxième étude : en fonction des différents stades de développement du fruit

75 rameaux composés de pousses âgées de moins d’un an ont été sélectionnés sur la face est des clémentiniers et à hauteur d’homme (environ 1,50 m). Les rameaux sont répartis sur 3 arbres, ont un diamètre équivalent (environ 1 cm) et sont exposés de la même manière. L’annélation a été appliquée sur les rameaux possédant 40 feuilles le 23 juillet 2008 après la chute physiologique des fruits. Au moment de l’annélation, tous les fruits

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Figure 26: Dispositif expérimental utilisé pour étudier l’effet sur les critères de qualité du fruit d’une réduction réversible ou non de l’alimentation en sucres en fonction du stade de développement. Les deux traitements, défoliation et ombrage, ont été appliqués à deux stades de développement du fruit (le 24 juillet et le 15 septembre). Durant la phase de maturation, seule un traitement défoliation a été réalisé (le 17 novembre). Le témoin correspond à la faible charge en fruits (30 feuilles par fruit).

70 ont un diamètre compris entre 23 et 27 mm. Aucune chute de fruits n’a été observée durant toute la durée de l’expérimentation. Tous les rameaux fructifères possèdent 40 feuilles au début de l’expérimentation. Avant chaque traitement, tous les rameaux ont été défoliés à 30 feuilles afin qu’ils soient dans les mêmes conditions. Ils ont tous été soumis au stress que peut provoquer une défoliation. La défoliation et l’ombrage des feuilles ont été utilisés pour obtenir trois niveaux de charge en fruits : élevée (5 feuilles par fruit), moyenne (15 feuilles par fruit), et faible (30 feuilles par fruit) (Figure 26). La défoliation (traitement permanent) et l’ombrage (traitement réversible) ont été réalisés sur 15 rameaux (5 rameaux par traitement x 3 niveaux de charge en fruits) le 24 juillet 2008, précocement après la chute physiologique des fruits, et le 15 septembre 2008, à un stade intermédiaire au moment du changement de couleur. Au stade de maturité correspondant à un stade tardif, seule une défoliation a été appliquée (le 17 novembre 2008). L’ombrage des feuilles a été réalisé en utilisant un filet d’ombrage totalement opaque, pour obtenir soit 5 ou 15 feuilles par fruit. Après 15 jours, les ombrages ont été retirés.

Durant l’expérimentation, les données climatiques ont été enregistrées : température, pluviométrie et rayonnement global (Tableau 6).

Tableau 6 : Données climatiques du mois de juillet 2008 au mois de décembre 2008 à San Giuliano.

T min (°C)* T max (°C)* T moy (°C)* Pluviométrie

journalière ; T moy : température mensuelle moyenne.

Tous les fruits ont été récoltés le 1^er décembre 2008. La maturité des fruits a été estimée en utilisant les indicateurs de maturité habituels : l’extrait sec soluble (ESS), l’acidité titrable (AT) et l’indice de maturité (ESS/AT).

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Figure 27: Spectre de caractérisation de la transmission de l’énergie lumineuse pour les deux ombrières utilisées : l’ombrière transmettant 81,78% de la lumière source (A) et celle transmettant 9,15% de la lumière source (B). La lumière source correspondant au soleil est représenté par un trait plein de couleur bleu et la source agrémentée d’un filtre par un trait en pointillée de couleur rose.

72 II.2. Troisième étude : effet d’un stress photooxydatif imposé au niveau des

feuilles sur la concentration en caroténoïdes des fruits proches

Dans cette expérimentation, nous avons choisi de travailler sur des oranges et non sur des clémentines pour différentes raisons techniques. Pour cet essai, il était nécessaire de travailler sur des arbres bien orientés pour recevoir le plus de lumière naturelle possible.

Donc nous avons choisi des arbres bien exposés, n’étant ombrés ni par des rangs de bordure ni par des haies brise-vent. De plus, afin de pouvoir réaliser toutes les analyses souhaitées pour notre étude, une plus grande quantité de matière était nécessaire. Les oranges

« Navelate » possédaient toutes ses caractéristiques.

48 rameaux composés de pousses âgées de moins d’un an ont été sélectionnés parmi 4 orangers de façon à avoir la même exposition à la lumière, et le même diamètre initial (environ 1 cm). Tous les rameaux ont la même orientation à l’est et sont à la même hauteur (environ 1,5 m du sol). Les rameaux ont été annelés à 40 feuilles avant le début de l’expérimentation le 3 février 2009 durant la phase III du développement du fruit, c’est-à-dire lorsque le fruit est en cours de maturation. Les traitements ont été répartis aléatoirement sur les arbres sélectionnés.

Nous avons utilisé deux types de filet d’ombrage permettant de diminuer l’énergie de la lumière transmise. Leurs spectres de transmissions ont été comparés à une lumière source, qui est le soleil et ont été caractérisées par spectrométrie Li-Cor-Li-1800. L’énergie (300-1100 nm) transmise par le soleil est de 693,30 W/m² tandis que celle transmise lorsque la lumière du soleil est additionnée d’un filtre est de 564,22 W/m² pour le filet d’ombrage de couleur verte et de 63,46 W/m² pour le filet d’ombrage de couleur noir. Nos deux filets d’ombrages permettent donc la transmission de 9,15% (filet d’ombrage de couleur noir bloquant la transmission de 91,75% de l’énergie lumineuse) et de 81,78% (filet d’ombrage de couleur noir bloquant la transmission de 18,22% de l’énergie lumineuse). La quantité de lumière a été modifiée à l’aide de ces ombrages mais pas la qualité. En effet, aucune longueur d’onde n’a été filtrée spécifiquement (Figure 27).

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Figure 28: Dispositif expérimental utilisé pour étudier l’effet sur les fruits d’un stress photooxydatif appliqué au niveau des feuilles proches.

74 Sur chacun des rameaux, les 10 feuilles les plus proches du fruit, en position terminale, et les plus exposées à la lumière, ont été ombrées individuellement à l’aide du filet d’ombrage 91,75% (Figure 28).

Après 6 jours d’adaptation à une faible quantité de lumière, un stress photooxydatif a été testé, le 9 février 2009. 16 rameaux, correspondant au témoin (T), ont conservé leurs filets d’ombrage à 91,75% jusqu’à la fin de l’expérimentation. 16 rameaux, correspondant au traitement d’intensité lumineuse élevé, ont été soumis brutalement à une forte intensité lumineuse par l’élimination des filets d’ombrage des feuilles. Pour finir, 16 rameaux, correspondant au traitement d’intensité lumineuse moyenne, ont reçu une intensité lumineuse intermédiaire : les filets d’ombrage à 91,75% ont été remplacés par des filets d’ombrage à 18,22%. Les feuilles ont reçu ainsi 81,78% de l’intensité lumineuse.

Pendant l’expérience, de mesures écophysiologiques ont été réalisées sur une quinzaine de feuilles afin de déterminer si les feuilles ont été exposées à un stress photooxydatif.

Les paramètres mesurés sur ces feuilles sont le rendement quantique maximum du photosystème II (Fv/Fm), le rendement minimal de la fluorescence (Fo), le rendement maximal de la fluorescence (Fm), la variation de la fluorescence (Fv), et l’indice de performance (PI) en utilisant le système portable handyPEA (Hansateck, Norfalk, Angleterre).

L’indice de performance est composé de trois composantes indépendantes contribuant à la photosynthèse : RC/ABS , Fv/Fo et (1-Vj)/Vj. Les trois composantes représentent respectivement la contribution au PI de la densité des centres réactionnels actifs, des réactions lumineuses pour la photochimie primaire et les réactions de la phase sombre.

Pour chacun des rameaux fructifères traités, quatre récoltes ont été effectuées : I) le 9 février, 3 heures après l’application du stress ; II) le 10 février, 27 heures après ; III) le 11 février, 51 heures après ; et IV) le 13 février, 99 heures après. Les récoltes ont porté sur 4 fruits par traitement.

Partie II : Matériels et méthodes

75 Tableau 7: Données climatiques du 3 au 13 février 2009 à San Giuliano.

Tmin (°c)* Tmax (°C)* Tmoyenne

journalière ; T moy : température mensuelle moyenne.

Durant l’expérimentation, les données climatiques ont été enregistrées : température, pluviométrie et rayonnement global (Tableau 7).

III. Conservation des échantillons

Après la récolte, les fruits ont été pelés et l’échantillon de pulpe du fruit a été broyé en une fine poudre à l’aide d’azote liquide. Cette dernière a été placé dans un contenant en verre ambré sous atmosphère d’azote et conservée au congélateur à -80°C. Une partie de cette poudre a été pesée puis lyophilisée afin d’obtenir la matière sèche et la matière de départ pour le dosage des sucres et des acides organiques. Les feuilles récoltées ont été plongées dans un bain d’azote liquide puis placées directement au congélateur à -80°C.

IV. Mesure de l’indice de maturité

La mesure de l’acidité titrable a été déterminée par titrage de la soude (0.1 mol.L^-1, pH=8.2) grâce à un titrateur automatique Mettler, DL 25 (Mettler-Toledo, France). Elle a

76 neutralisé les protons libres à l’aide d’une base forte et a été exprimée en milliéquivalent d’acide citrique/g de matière fraîche (Boland, 1990). Les mesures d’extrait sec soluble (°

Bricks) contenu dans la pulpe ont été réalisées à l’aide d’un réfractomètre (modèle Atago, 0-32%, VWR). Les degrés Brix ont été exprimés en pourcentage (Bassene et al., 2009). L’indice de maturité a été déterminé en utilisant le rapport ESS (Extrait Sec Soluble) / AT (Acidité titrable). Pour les fruits de clémentines mûrs, l’indice de maturité est situé aux alentours de 12.

V. Les analyses biochimiques

V.1. Dosage des sucres et des acides organiques

V.1.1. Préparation des échantillons

V.1.1.1. Extraction des sucres

Les sucres ont été extraits selon la méthode décrite par Gomez et al. (2002) : 100 mg de poudre lyophilisées de pulpe d’agrumes ont été homogénéisées dans 10 mL d’un mélange méthanol/eau (50:50, v:v, VWR (West Chester, USA)) et 5 mL de chloroforme (VWR). Cette suspension a été agitée pendant 30 min puis centrifugée à 5500 g pendant 15 min. Le surnageant a été séché pendant une nuit à l’aide d’un évaporateur rotatif à température ambiante puis dissous dans un mélange de 3 mL d’eau et de 1 mL de polyvinyle pirrolidone (PVP) à 5% (Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne). Après agitation, le mélange a été placé 30 min à température ambiante avant de le centrifuger à 5500 g pendant 10 min.

Le surnageant a été filtré sur une membrane d’acétate de cellulose de diamètre 25 mm et de porosité 22 µm (VWR) puis placé dans un flacon pour l’analyse par HPLC.

V.1.1.2. Extraction des acides organiques

Les acides organiques ont été extraits selon la méthode décrite par Albertini et al.

(2006). 100 mg de poudre ont été lyophilisés, puis solubilisés dans 5 mL d’eau bi-distillée, et homogénéisées au vortex puis au Dounce pendant 1 min. La suspension a été centrifugée à

Partie II : Matériels et méthodes

77 4000 g pendant 10 min à température ambiante. Le surnageant a été filtré sur une membrane d’acétate de cellulose de diamètre 25 mm et de porosité 22 µm (VWR), puis placé dans un flacon pour l’analyse par HPLC.

V.1.2. Analyse des sucres par HPLC

Les sucres ont été analysés par HPLC en utilisant un réfractomètre (Perkin-Elmer, série 200, Waltham, USA). Les sucres ont été séparés par une colonne en C16 de silice avec des groupements amines (High Performance Carbohydrates, 250 x 4,6 mm, d. 4 µm (Waters, Mulfort, USA)) selon la méthode décrite par Albertini et al. (2006). Les phases mobiles sont l’acétonitrile (VWR) comme éluant A et l’eau bi-distillée comme éluant B. Le débit a été fixé à 1 mL.min^-1, la température de la colonne est à 35°C et le volume d’injection est de 10 µL.

L’élution des sucres a été réalisée en mode isocratique en plusieurs étapes : I) l’étape d’équilibrage, 0-15 min, 70%A 30%B ; II) l’étape d’élution, 15-25 min, 70%A 30%B ; III) l’étape de rinçage, 25-27 min, 100% A.

V.1.3. Analyse des acides organiques par HPLC

Les acides organiques ont été analysés par HPLC en utilisant un détecteur UV (Perkin-Elmer, série 200, Waltham, USA) selon la méthode décrite par Albertini et al. (2006). Les acides organiques ont été séparés en phase interne par une colonne en C18, échangeuse de cations (Sphéri-5 RP 18, 220 x 4,6 mm, d. 5 µm, Perkin-Elmer). Les phases mobiles sont le tampon phosphate 25 mM à pH 2,4 (VWR) comme éluant A, l’acétonitrile (VWR) comme éluant B, et l’eau comme éluant C. Le débit a été fixé à 1 mL.min^-1, la température de la colonne est de 20°C et le volume d’injection est de 20 µL. L’élution des acides organiques a été réalisée en mode isocratique en plusieurs étapes : I) l’étape d’équilibrage, 0-15 min, 100%A ; II) l’étape d’élution, 15-30 min, 100%A ; III) l’étape de rinçage, 30-31 min, 30%B 70%C. Les acides organiques ont été détectés à une longueur d’onde de 210 nm.

78 V.1.4. Identification et quantification des sucres et des acides organiques

Les sucres ont été identifiés par leur indice de réfraction et leur temps de rétention en comparaison avec l’injection de trois standards : glucose, fructose et saccharose (Sigma Aldrich). Les acides organiques ont été identifiés par leur temps de rétention en comparaison avec l’injection de cinq standards : acide oxalique, acide malique, acide ascorbique, acide citrique et acide succinique (Sigma Aldrich).

Les données ont été collectées, stockées et intégrées en utilisant le logiciel TotalChrom^TM version 6,2 (Perkin-Elmer).

Les sucres et les acides organiques ont été quantifiés en utilisant des courbes de calibrage pour les différents composés identifiés. Les concentrations ont été exprimées en mg.g^-1 de matière sèche. Les concentrations totales de sucres et d’acides organiques ont été calculées par addition des concentrations de tous les composés identifiés.

V.2. Dosage des caroténoïdes

V.2.1. Préparation des standards

Les concentrations des solutions standard ont été calculées par des mesures au spectrophotomètre en les dissolvant dans un solvant approprié dans un bain à ultrasons, et en utilisant leur coefficient d’extinction molaire (ε) (Tableau 8).

Tableau 8: Préparation des solutions standards.

Standard Solvant de dissolution Coefficient d’extinction (L.mol^-1.cm^-1)

lutéine Ethanol 144 800

zéaxanthine Ethanol 140 900

β-cryptoxanthine Dichlorométhane 135 700

β-carotène Dichlorométhane 138 900

lycopène Dichlorométhane 184 900

Partie II : Matériels et méthodes

79 La solution de lycopène servant de standard interne a été diluée afin d’obtenir une concentration finale de 120 mg.L^-1.

V.2.2. Extraction et saponification des caroténoïdes

Les caroténoïdes ont été extraits selon la méthode décrite par Fanciullino et al. (2006).

Les caroténoïdes étant des molécules sensibles à la lumière et à l’oxygène, toutes les étapes ont été conduites en lumière inactinique et les extraits transférés dans des flacons de verre ambré sous atmosphère d’azote.

Les caroténoïdes de la pulpe des agrumes ont été extraits à partir de 2,5 g de matière fraîche broyée en une fine poudre à laquelle ont été ajoutés 120 mg d’hydroxyde de carbonate de magnésium (MgCO3, Sigma-Aldrich) et 35 mL du mélange d’extraction (éthanol/hexane (VWR), 4:3, v:v, contenant 0,1% de ter-butylhydroxytoluène (BHT, Sigma-Aldrich)). 300 µL, équivalents à 30 µg d’une solution de lycopène ont été ajoutés comme standard interne. Le mélange a été agité pendant 5 min. Les résidus ont été séparés de la phase liquide par filtration avec un entonnoir filtrant de porosité n°2, puis ré-extraits avec 35 mL d’éthanol/hexane (4:3, v:v). Les résidus ont ensuite été rincés avec successivement 30 mL d’éthanol et 30 mL d’hexane jusqu’à leur décoloration. Les phases organiques ont été transférées dans une ampoule à décanter et lavées successivement avec 2 X 50 mL de chlorure de sodium à 10% (NaCl, VWR) et 3 X 50 mL d’eau bi-distillée. La phase aqueuse a été éliminée. La phase hexanique a été séchée à l’aide du sulfate de sodium anhydre (NaSO4, VWR), filtrée et évaporée à 40°C dans un évaporateur rotatif.

L’extrait sec a ensuite été dissout dans 20 mL d’hexane puis placé dans un flacon

L’extrait sec a ensuite été dissout dans 20 mL d’hexane puis placé dans un flacon