L’effet de fortes intensités lumineuses sur les différentes formes d’ascorbate et sur

Le traitement correspondant à une intensité lumineuse élevée a induit de faibles effets sur la concentration en ascorbate réduit (AA), en déshydroascorbate (DHA) et en ascorbate total (Tableau 15).Une diminution des concentrations en ascorbate réduit (-12,9%) et en ascorbate total (-14,8%) est observée au temps t=27h par rapport au témoin. Quant à la concentration en déshydroascorbate, elle est plus faible de 61%, au temps t=51h, par rapport au témoin.

En plus, de la diminution de la concentration en ascorbate réduit (AA) et en déshydroascorbate (DHA), les résultats sur les activités enzymatiques de détoxication des ROS ont montré une augmentation de l’activité de la monodéshydroascorbate réductase (MDHAR) et dans une moindre mesure de la déshydroascorbate réductase (DHAR) dans des conditions de stress oxydatif élevé. En effet, tout au long du stress photooxydatif, l’activité de la MDHAR est plus élevée de 388% pour le traitement correspondant à une intensité

Partie III : Résultats et discussion

119 lumineuse élevée et de 172% pour le traitement correspondant à une intensité lumineuse moyenne par rapport au témoin. L’activité de la DHAR est plus élevée, à t=3h, de 30% pour le traitement correspondant à une intensité lumineuse élevée. Ces observations sont cohérentes avec l’hypothèse de Jimenez et al. (2002) qui interprète les variations de la concentration en AA et DHA dans les fruits par des variations dans la synthèse de l’AA ou dans la régénération de ce dernier par le DHA, et donc des modifications dans l’activité des enzymes MDHAR et DHAR.

Le traitement correspondant à une intensité lumineuse élevée a un effet plus marqué sur le statut redox de l’ascorbate (AA/DHA) (Figure 39). Le statut redox dans le traitement correspondant à une intensité lumineuse élevée, à t=51h, est plus élevé d’environ 42% par rapport au témoin. Tout au long de l’expérimentation, aucune différence significative n’a été observée entre le traitement correspondant à une intensité lumineuse moyenne et le témoin.

Nos résultats montrent qu’un stress photooxydatif appliqué sur les feuilles induit une modification du statut redox de l’ascorbate dans la pulpe du fruit.

Figure 39: Evolution du statut rédox de l’ascorbate dans la pulpe des fruits, au cours du stress photooxydatif, en fonction de l’intensité lumineuse : élevée ( ), moyenne ( ) par rapport au témoin (intensité lumineuse faible) ( ). Les points correspondent aux moyennes et les barres aux erreurs standard. Les lettres a, b indiquent des différences significatives entre les traitements d’intensité lumineuse différente pour chacune des dates considérées et les lettres A, B, indiquent des

120 t=99h après l’application du stress photooxydatif, en fonction de l’intensité lumineuse : élevée ( ), moyenne ( ) et faible ( ). Les données représentées sont des moyennes et les barres correspondent aux erreurs standard. Les lettres a, b, c indiquent des différences significatives parmi les traitements (α=5%).

Partie III : Résultats et discussion

121 II.4. L’effet de fortes intensités lumineuses sur les critères de qualité du

fruit

A t=99h, alors que la concentration en sucres totaux n’est pas affectée par le traitement correspondant à une intensité lumineuse élevée, les concentrations en acides organiques totaux et en caroténoïdes totaux apparaissent supérieures de 13,2% et de 25,7%, respectivement par rapport au témoin (Figure 40).

Même si la concentration en sucres totaux n’est pas touchée, le traitement correspondant à une intensité lumineuse élevée induit une augmentation de la concentration en saccharose (+16,2%) et une diminution des concentrations en glucose (-10,5%) et en fructose (-13,2%) par rapport au témoin pour chacun des composés (Figure 40A). De la même façon, par comparaison au témoin, l’augmentation à la concentration en acides organiques totaux est en partie due à l’augmentation de la concentration en acide succinique (+25,6%) (Figure 40B). En ce qui concerne l’augmentation de la concentration en caroténoïdes, elle est en grande partie due à l’augmentation de la cis-violaxanthine (+38%), de la zéaxanthine (28,9%) et de β-cryptoxanthine (24,7%) (Figure 39C). D’autres xanthophylles, telles que la cis-β-cryptoxanthine et la zéinoxanthine suivent le même profil.

Puisque le statut redox dans la pulpe des fruits d’orange a été fortement affecté par le stress photooxydatif, l’interprétation de l’effet d’un stress photoinhibiteur appliqué aux feuilles sur les caroténoïdes dans la pulpe des fruits pourrait être réalisée en fonction de nos connaissances sur l’effet des variations du statut redox sur la voie de biosynthèse des caroténoïdes. L’idée dominante est que les enzymes clefs de la voie de biosynthèse des caroténoïdes en entier est sous le contrôle du statut redox (Steinbrenner et Linden, 2003).

C’est le cas de la phytoène synthase (PSY) et de la phytoène désaturase (PDS), qui sont les deux enzymes exerçant le plus grand contrôle sur la voie de biosynthèse des caroténoïdes (Fraser et al., 2007; Fraser et al., 2002). Les gènes Psy sont connus pour répondre fortement aux facteurs environnementaux, tels que les fortes intensités lumineuses, la salinité, la sécheresse, la température et la photopériode (Cazzonelli et Pogson, 2010). Il a été suggéré que les plantes s’adapteraient à leur environnement à travers des variations du statut redox (Buchanan et Balmer, 2005). La désaturation du phytoène par la PDS, de même que la désaturation de la ζ-carotène par la ζ-carotène désaturase (ZDS), est une réaction complexe

122 qui requièrt un rapport PQH2/PQ élevé. (Barr et al., 2004; Carol et Kuntz, 2001; Joet et al., 2002; Josse et al., 2000; Scolnik et al., 1987). PQH2, la forme réduite de PQ, peut être réoxydée par le photosystème I (PSI) ou la plastoquinone terminale oxydase plastidiale (PTOX) (Joet et al., 2002; Josse et al., 2000). Les facteurs contrôlant le gène Ptox n’ont pas été identifiés, mais il est suggéré que le statut redox des plastoquinones jouerait un rôle clef, si l’on considère que l’état redox des plastoquinones est connu pour contrôler la transcription de plusieurs gènes (Pfannschmidt et al., 1999). Par ailleurs, les gènes situés en aval de la voie de biosynthèse, tels que le gène β-carotène hydroxylase (Hy-β), qui catalyse la conversion de la zéaxanthine en β-carotène, et le gène zéaxanthine époxydase qui convertit la zéaxanthine en violaxanthine, sont contrôlés également par le statut redox des (Buchanan et Balmer, 2005) Nous proposons le monoxyde d’azote (NO) comme un candidat potentiel pour nos études futures. En effet, le NO est connu pour être produit après un stress et il a un potentiel pour interagir avec les composés ayant un rôle dans la régulation redox, incluant la MDHAR (Navrot et al., 2011).

II.5. Conclusion

Nos résultats montrent qu’un stress photooxydatif appliqué sur les feuilles peut engendrer une réponse dans la pulpe des fruits situés à proximité. En effet, le stress photooxydatif a induit une activation des systèmes enzymatiques de recyclage et de détoxication des espèces réactives de l’oxygène, des variations dans le statut redox de l’ascorbate et des critères de qualité organoleptiques (sucres et acides organiques) et des critères de qualité nutritionnels (caroténoïdes). Ces observations suggèrent que des signaux sont transmis des feuilles aux fruits dans des conditions de stress environnementaux tels que de l’exposition de fortes intensités lumineuses.

Partie IV : Conclusion et

perspectives

124 Les fruits et légumes représentent une part importante de l’alimentation humaine et une source majeure de substances biologiquement actives telles que les vitamines et les métabolites secondaires. La consommation de fruits et légumes, de nos jours, reste globalement insuffisante, c’est pourquoi elle doit être encouragée, et il serait intéressant de proposer des fruits et légumes avec une concentration augmentée en vitamines et en métabolites secondaires. Il y a deux façons d’atteindre cet objectif : l’approche génétique et la manipulation de l’environnement. Nos observations sur fruits de clémentine et d’orange confirment ce qui a déjà été vu par exemple chez la tomate, l’épinard et la carotte, à savoir qu’il est possible d’agir fortement sur la concentration en caroténoïdes des fruits et légumes par la seule action sur l’alimentation en sucres ou par l’application de conditions stressantes.

Effet de l’alimentation carbonée sur la biosynthèse des caroténoïdes

Notre premier objectif a été de déterminer l’effet de l’alimentation en sucres sur les critères de qualité des agrumes et notamment la concentration en caroténoïdes.

Dans un premier essai, nous avons étudié l’effet de l’alimentation en sucres en testant les conséquences de différentes charges en fruits appliquées après la chute physiologique.

Cette première étude nous permet d’affirmer que le statut carboné n’agit probablement pas sur la biosynthèse des caroténoïdes en influençant positivement la biodisponibilité des précurseurs. En effet, dans le traitement correspondant à une alimentation en sucres élevée, les caroténoïdes présents en amont de la voie de biosynthèse (phytoène, phytofluène, ζ-carotène) ont augmenté à la fois en termes de concentration absolue et de manière relative (par rapport aux caroténoïdes totaux), alors que la concentration totale en caroténoïdes a diminué. Nos observations n’ont cependant pas permis de déterminer à quel niveau le statut carboné a influencé la voie de biosynthèse des caroténoïdes.

Dans un deuxième temps, nous avons testé l’effet de la charge en fruits sur les critères de qualité du fruit récolté à maturité en fonction du stade de développement. Cette deuxième étude nous a permis de déterminer que l’augmentation de la charge en fruits induit une augmentation de la concentration en caroténoïdes dans la pulpe du fruit lorsque celle-ci est appliquée après la chute physiologique. Ce stade de développement serait donc

Partie IV : Conclusion et perspectives

125 le plus propice à l’amélioration des critères de qualité nutritionnelle des fruits. De plus, au même stade de développement, la diminution de l’alimentation carbonée sur une courte période de 15 jours a un effet moindre en ce qui concerne l’augmentation de la concentration en caroténoïdes.

Les théories déterministes, et spécifiquement la théorie de l’équilibre entre la différenciation et la croissance ne permettent pas d’expliquer nos résultats. Deux hypothèses relatives aux rôles direct ou indirect de l’alimentation carbonée sur la voie de biosynthèse des caroténoïdes mériteraient d’être étudiées de manière plus approfondie.

La première de ces hypothèses est fondée sur l’idée que les sucres pourraient jouer un rôle modulateur de la voie de biosynthèse des caroténoïdes (effet direct). Il serait intéressant d’étudier l’effet des sucres sur les facteurs de transcriptions et les gènes impliqués dans la voie du MEP et dans la voie de biosynthèse des caroténoïdes. En effet, il a été montré que les sucres ont occupé une place centrale dans le contrôle du métabolisme des plantes, de leur croissance et de leur développement. Il a été montré de surcroît l’existence d’interactions des sucres avec la lumière, le stress et les hormones (Rolland et al., 2002). La diminution des sucres dans les feuilles augmente l’expression des gènes impliqués dans la photosynthèse, la remobilisation, et l’exportation des sucres tandis qu’elle induit une diminution de l’expression des gènes impliqués dans leur stockage (Koch, 1996). Au niveau des feuilles, la régulation des gènes par les sucres, tels que les gènes impliqués dans la photosynthèse, la réponse au stress ou le métabolisme secondaire, s’exercerait au niveau transcriptionnel (Rolland et al., 2002). Les études menées sur le maïs et les promoteurs des gènes de la photosynthèse suggèrent l’implication de facteurs de transcriptions (Sheen et al., 1999). Toutes les études évoquées concernent la photosynthèse, la remobilisation et l’exportation des sucres dans les feuilles. Fort peu de choses sont connues concernant les organes autres que les feuilles et le métabolisme secondaire. Tout au plus peut-on évoquer les études menées sur pétunia par Tsukaya et al. (Tsukaya et al., 1991). Celles-ci avaient montré qu’une augmentation des sucres entraînait une augmentation de l’expression de la chalcone synthase.

126 La deuxième hypothèse est que les sucres agiraient de manière indirecte sur la voie de biosynthèse des caroténoïdes, en influençant la division et la croissance des chloroplastes.

Ces derniers sont destinés à se transformer en chromoplastes au cours du développement du fruit, et sont les organites de stockage des caroténoïdes. Li et al. (2001) ont montré, par l’étude de mutants, que la différenciation des plastes est un mécanisme fortement impliqué dans le contrôle de l’accumulation des caroténoïdes chez le chou-fleur. De plus, chez la tomate, il a été montré que augmentation de la concentration en caroténoïdes était corrélée à l’augmentation du nombre de cellules dans le fruit, à l’augmentation du nombre de chloroplastes par cellule et à la taille de chloroplastes (Bino et al., 2005). Si quelques études ont montré l’existence d’un lien entre la concentration en caroténoïdes avec le nombre et la taille des plastes, il n’existe en revanche aucune étude de l’effet de l’alimentation en sucres sur la biogénèse ou la division des plastes. En revanche, on sait que les chloroplastes ont une capacité de division supérieure à celle des chromoplastes (Kuroiwa et al., 1998). Or nos essais ont justement montré qu’une augmentation de la concentration en caroténoïdes était observable uniquement lorsque l’alimentation en sucres était diminuée précocement, c’est-à-dire avant la transformation des chromoplastes en chloroplastes. Il serait donc intéressant d’étudier : I) les liens entre l’alimentation en sucres et la taille et le nombre de plastes et ; II) les liens entre la taille et le nombre de plastes, d’une part, et la concentration en caroténoïdes dans la pulpe du fruit, d’autre part. Pour cela, il serait nécessaire de développer des approches histologiques conjointement à des études de l’expression des gènes impliqués dans la division des plastes et de la biosynthèse des précurseurs des caroténoïdes et de la voie de biosynthèse des caroténoïdes.

Effet du stress oxydatif et du statut rédox sur la biosynthèse des caroténoïdes

Notre deuxième objectif a été d’étudier l’effet d’un stress photooxydatif appliqué sur les feuilles, à l’aide de différentes ombrières sur les paramètres photosynthétiques des feuilles, sur le métabolisme antioxydant et sur la concentration en caroténoïdes dans la pulpe du fruit. Les premiers résultats obtenus montrent qu’un stress photooxydatif appliqué sur les feuilles peut engendrer une réponse dans la pulpe du fruit. Le stress photooxydatif a stimulé les systèmes enzymatiques de recyclage et de détoxication des espèces réactives de l’oxygène, et plus particulière la superoxyde dismutase, la déshydroascrobate réductase, la

Partie IV : Conclusion et perspectives

127 monodéshydroascorbate réductase et l’ascorbate peroxydase. Il a aussi augmenté le statut redox de l’ascorbate (rapport ascorbate réduit/déshydroascrobate), la concentration en peroxyde d’hydrogène, en acides organiques et en caroténoïdes. Enfin, il a été à l’origine d’une diminution de la concentration en sucres des fruits. Ces résultats suggèrent fortement que des signaux peuvent être transmis des feuilles vers le fruit. Ils suggèrent aussi que le stress photooxydatif peut impacter de façon positive la concentration en caroténoïdes dans la pulpe du fruit.

Ces résultats ouvrent de nombreuses perspectives scientifiques et appliquées. Nous allons envisager ici quelques pistes de manière ouverte, sans trop nous préoccuper à ce stade des questions de faisabilité.

La question de l’implication du stress oxydant et des variations de statut redox qui lui sont associées dans le contrôle de la synthèse des caroténoïdes nous paraît l’une des plus importantes à traiter. L’hypothèse selon laquelle le stress photooxydatif agirait sur la biosynthèse des caroténoïdes par le biais du statut rédox pourrait être vérifiée d’abord en appliquant des molécules exacerbant la production d’espèces réactives de l’oxygène dans le fruit. Les effets sur le statut rédox pourraient être suivis via le dosage des différentes formes d’ascorbate, de glutathion et du NADP, et l’analyse de l’expression des gènes impliqués dans leur métabolisme. Il est rappelé que les réactions catalysées par la ZEP et la LCY-β nécessitent du NADPH (Mialoundama et al., 2010; Yu et al., 2010). Il serait certainement intéressant d’inclure la plastoquinone dans ces études. En effet, la PDS, la ZDS, la ZEP et la HY-β sont contrôlées par le statut rédox des plastoquinones et requièrent un rapport PQ/PQH2 élevé (Barr et al., 2004; Woitsch et Romer, 2003). Les études envisagées devraient impliquer une caractérisation du statut oxydant global, par exemple par des études de résonance spectrométrique paramagnétique (EPR). En ce qui concerne les étapes sensibles, nous pensons qu’il faudrait en premier lieu nous concentrer sur la PSY et la PDS, qui sont les deux enzymes exerçant le plus grand contrôle sur la voie de biosynthèse des caroténoïdes (Steinbrenner et Linden, 2003).

La deuxième grande question porte sur la nature de la signalisation mise en évidence et des mécanismes qui lui sont associés. Plusieurs hormones et espèces réactives de l’oxygène ou de l’azote sont de bons candidats pour ce rôle. Les observations réalisées par

128 Rossel et al. (2007) à propos de l’acclimatation systémique acquise (SAA) suggèrent que ni l’acide abscissique, ni l’acide salicylique, ni le méthyl jasmonate, ni le peroxyde d’hydrogène sont impliqués dans la signalisation. Le monoxyde d’azote (NO) nous semble être le meilleur des candidats pour de futures études. Le monoxyde d’azote est connu pour agir comme une molécule signale modulant les réponses aux stress biotiques et abiotiques des plantes (Wendehenne et al., 2005; Wilson et al., 2008). Plusieurs études ont également suggéré que le NO jouerait un rôle dans la protection des plantes contre le stress oxydatif. Chez le blé, l’application de molécule favorisant la production de NO confère à la plante, dans des conditions de sécheresse, une augmentation de la tolérance en induisant notamment la fermeture des stomates (Garcia-Mata et al., 2001). De même, chez le haricot, l’application de molécule favorisant la production de NO protège les plantes des dommages pouvant être causés par les UV-B probablement par l’intermédiaire de l’activation des enzymes antioxydantes (SODt, APX, CAT) (Shi et al., 2005).

Le rôle du NO pourrait être testé en appliquant des molécules générant du NO à des fruits détachés, puis en mesurant à différents pas de temps les activités enzymatiques et

Il serait enfin également intéressant de chercher à préciser de quelle manière le signal en provenance des feuilles est perçu par les fruits, ainsi que son influence sur le métabolisme antioxydant et sur la synthèse des caroténoïdes. Si l’on admet que la stimulation du métabolisme antioxydant et celle de la synthèse des caroténoïdes dans le fruit résultent d’une augmentation de la concentration en espèces réactives de l’oxygène ou des variations de statut redox qui lui sont associées, il conviendrait d’étudier comment le signal en provenance des feuilles impacte la production d’espèces réactives de l’oxygène. Il a été observé que NO justement avait la capacité de stimuler la production d’O2

en favorisant la réduction des cytochromes de la chaine de transport des électrons mitochondriale de cellules animales endothéliales (Palacios-Callender et al., 2004). Il est intéressant de noter que, dans le même essai, il avait été observé que la production d’O2

initiait l’activation du facteur de transcription NF-kB impliqué dans la réponse des cellules animales au stress.

Partie IV : Conclusion et perspectives

129 Dans un but plus appliqué, il serait certainement utile de vérifier que l’augmentation de la concentration en caroténoïdes dans la pulpe du fruit induite par un stress photooxydatif sur une courte période se retrouve dans le fruit à maturité. En cas d’effet positif démontré, il faudra déterminer à quel stade de développement du fruit l’application du stress photooxydatif est la plus efficace pour induire une augmentation de la concentration en caroténoïdes dans la pulpe. Une expérimentation a déjà été réalisée dans cette perspective. Deux stades de développement du fruit ont été choisis dans un premier temps : le stade de grossissement cellulaire et la maturation du fruit. Pour ces deux stades, des rameaux ont été sélectionnés, annelés et soumis à un stress photooxydatif. Des fruits one été récoltés selon une cinétique allant de 3h après l’application de stress photooxydatif jusqu’au stade de maturité du fruit. Ces échantillons n’ont toutefois pu être analysés pour le moment.

A plus long terme, ces résultats pourraient nous permettre de réaliser des comparaisons avec d’autres stress, tels que la sécheresse, connus pour favoriser l’augmentation de la concentration en caroténoïdes, afin de proposer à la filière des itinéraires culturaux pour produire des fruits ayant une teneur enrichie en caroténoïdes tout en maintenant les autres critères de qualité que sont la teneur en acides, la maturité et le calibre du fruit.

Références bibliographiques

Références bibliographiques

131

A

Abushita AA, Daood HG, Biacs PA. 2000. Change in carotenoids and antioxidant vitamins in tomato as a function of varietal and technological factors. Journal of Agricultural and Food Chemistry 48, 2075-2081.

Adams WW, Zarter CR, Mueh KE, Amiard Ve, Demmig-Adams B. 2006. Energy Dissipation

Adams WW, Zarter CR, Mueh KE, Amiard Ve, Demmig-Adams B. 2006. Energy Dissipation