Liens entre les métabolismes primaire et secondaire

PARTIE I : INTRODUCTION

IV. Influence des facteurs de l’environnement sur la biosynthèse et l’accumulation des

IV.2. Statut carboné ou stress oxydatif ?

IV.2.1. L’influence du statut carboné sur la concentration en caroténoïdes

IV.2.1.1. Liens entre les métabolismes primaire et secondaire

Les métabolites primaires (chlorophylles, acides aminés, nucléotides, carbohydrates,...) participent à la croissance et au développement de la plante via leurs rôles dans la photosynthèse, la respiration, ou le transport des solutés. Les métabolites secondaires sont impliqués dans la structure des plantes, dans les interactions avec les facteurs biotiques du milieu et en particulier dans la défense contre les agressions.

Figure 19: Théorie de l’équilibre entre les mécanismes de différenciation et de croissance. Représentation de l’évolution du taux net d’assimilation, du taux de croissance relatif et du taux de synthèse des métabolites secondaires en fonction de la disponibilité en nutriments d’après Glynn (2007).

Partie I : Introduction bibliographique

45 IV.2.1.1.1. Théories déterministes

L’idée centrale des théories déterministes est que les plantes doivent optimiser la répartition de leurs ressources entre le métabolisme primaire impliqué dans la croissance et le développement et le métabolisme secondaire orienté vers la défense contre les pathogènes, l’adaptation à l’environnement, la survie et la propagation de l’espèce. Les deux métabolismes, sont en compétition pour les ressources carbonées.

La répartition du carbone entre les métabolismes primaire et secondaire est étudiée depuis des dizaines d’années par les écologues. Plusieurs hypothèses complémentaires et parfois contradictoires ont été proposées pour expliquer cette distribution. La théorie de l’équilibre entre les mécanismes de différenciation et de croissance (Growth Differentiation Balance Hypothesis, GDBH), est la plus élaborée des hypothèses de défense des plantes (Stamp, 2003).

La théorie de l’équilibre entre les mécanismes de différenciation et de croissance a été formulée initialement par Loomis (1932, 1953) et complétée par la suite par Lorio (1986) et Herms et Mattson (1992) (Figure 19).

Elle prédit comment les plantes allouent leurs ressources entre les processus liés à la différenciation et les processus liés à la croissance dans différentes conditions environnementales. Cette théorie prédit que I) les plantes soumises à de faibles disponibilités en ressources présentent une faible croissance et une faible production en métabolites secondaires ; II) l’allocation pour la production de métabolites secondaires est plus faible chez les plantes croissant avec des ressources élevées (Herms et Mattson, 1992) ; III) les plantes soumises à des disponibilités en ressources intermédiaires ont la plus grande concentration en métabolites secondaires tandis que l’accumulation de la biomasse est intermédiaire (Loomis, 1932, 1953; Luxmoore, 1991) (Figure 19).

Les concentrations en métabolites secondaires suivent une courbe en cloche et présentent un maximum pour de niveaux de ressources intermédiaires.

Figure 20: Réseau de signalisation impliquant les interactions entre les hormones et les espèces réactives de l’oxygène d’après Fujita et al. (2006).

Partie I : Introduction bibliographique

47 IV.2.1.1.2. Théories mécanistes

Les physiologistes ont émis l’hypothèse que les carbohydrates ont un rôle modulateur sur la biogénèse des métabolites secondaires. Chez les agrumes, le saccharose favorise le changement de couleur d’une manière dépendante de l’éthylène (Iglesias et al., 2001). La limitation en saccharose, due à la répression du gène Psy1, retarde et réduit l’accumulation de lycopène et de phytoène sur les disques de péricarpe (Telef et al., 2006). Ces observations suggèrent que le saccharose agit comme une molécule stimulante qui accroît l'accumulation des caroténoïdes après l'induction de leur synthèse. Dans les feuilles, l’accumulation des sucres solubles régule négativement l’expression des gènes de la photosynthèse et conduit à une perte de chlorophylles (Koch, 1996; Krapp et al., 1991;

Rolland et al., 2002; Rolland et al., 2001). En admettant que les synthèses des chlorophylles et des caroténoïdes sont coordonnées, il faut s’attendre à ce que les sucres répriment la synthèse des caroténoïdes. Mortain-Bertrand et al. (2008) ont observé que l’accumulation des sucres dans les feuilles de tomate réprime les gènes codant pour les enzymes de la voie de biosynthèse des caroténoïdes (Psy, Pds, Lcy-β) aussi bien que ceux de la voie du méthylérythritol phosphate (Dxps) (Mortain-Bertrand et al., 2008).

En résumé, l’accumulation des sucres stimule la synthèse des caroténoïdes dans les fruits alors que c’est l’effet inverse dans les feuilles.

IV.2.2. L’influence du stress oxydatif sur la concentration en caroténoïdes

Les végétaux sont exposés à de multiples stress biotiques et abiotiques dans leur environnement naturel. Pour survivre, les plantes possèdent des mécanismes évolués qui impliquent une signalisation par les hormones (acide salicylique, acide jasmonique, éthylène, acide abscissique) et les espèces réactives de l’oxygène (ROS). La perception des signaux extérieurs induit des réponses adaptées telles que l’acclimatation par l’augmentation de la capacité de détoxication des ROS (Foyer et Noctor, 2003; Fujita et al., 2006). Les phytohormones et les espèces réactives de l’oxygène jouent un rôle essentiel dans la signalisation des réponses aux stress biotiques et abiotiques (Figure 20) (Foyer et Noctor, 2003; Fujita et al., 2006). Les voies de réponses des phytohormones et des espèces réactives

Figure 21: Déséquilibre de la balance entre les espèces réactives de l'oxygène (ROS) et les antioxydants d'après Scandalios (2005).

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49 de l’oxygène interagissent pour contrôler à la fois la tolérance aux stress et la résistance aux maladies. Le monoxyde d’azote (NO) jouerait également un rôle dans les réponses aux stress des plantes. En effet, il régulerait les réponses des plantes aux stress abiotiques (sécheresse, températures basses et élevées, salinité, métaux lourds et stress oxydatif) et serait impliqué dans la signalisation des réponses de défense au cours des interactions plantes-pathogènes (Arasimowicz et Floryszak-Wieczorek, 2007).

En absence de stress, les ROS sont produits par de nombreuses réactions métaboliques. L’homéostasie des ROS est maintenue grâce à leur détoxication mais ils peuvent toutefois agir comme des molécules de signalisation (Foyer et Noctor, 2005b, 2003).

Cependant, lors de stress plus intenses, la production de ROS peut augmenter rapidement et les systèmes antioxydants qu’ils soient enzymatiques (le cycle ascorbate-glutathion, la catalase, les superoxydes dismutases, les péroxydases) ou non-enzymatiques (les caroténoïdes, la vitamine C, …) peuvent alors être dépassés. Il en résulte un stress oxydatif, et donc l’accumulation de ROS (Laloi et al., 2004). Il est probable que le stress oxydatif soit impliqué dans la régulation de la biosynthèse des composés impliqués dans la détoxication des ROS, tels que les caroténoïdes.

IV.2.2.1. Le stress oxydatif et les espèces réactives de l’oxygène

Le stress oxydatif se définit comme le résultat d’un déséquilibre entre les espèces réactives de l’oxygène et les systèmes de détoxication, conduisant à l’apparition de lésions, de dysfonctionnements physiologiques (dommages au niveau des membranes, réduction de l’efficacité métabolique, mutations, réduction de la fixation du carbone, perte de fonction des organites…) pouvant conduire à la mort cellulaire des plantes (Scandalios, 2005) (Figure 21).

Les plantes supérieures, comme les autres organismes aérobies, nécessitent de l’oxygène pour la production efficace d’énergie. Les espèces réactives de l’oxygène sont des dérivés partiellement réduit de l’oxygène moléculaire, O2 (Figure 22).

50 La formation de l’oxygène singulet (¹O2) est induite par l’excitation de molécules d’oxygène tandis que les autres espèces réactives de l’oxygène tels que l’anion superoxyde (O2•-), et les radicaux hydroxyles (OH^•) sont formés par transfert d’un ou plusieurs électrons à la molécule d’oxygène (Apel et Hirt, 2004). Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) n’est pas une espèce réactive de l’oxygène stricto sensu mais participe à la formation de radicaux libres.

L’oxygène singulet (¹O2), est très réactif et instable du fait de son état excité. Il réagit facilement avec les molécules voisines en les oxydant (Halliwell et Gutteridge, 2007). Il peut être formé par un excès d’énergie (radiations UV ou photo-inhibition) lors des réactions de transfert des électrons au niveau du photosystème II (Nyathi et Baker, 2006). Il est éliminé par l’α-tocophérol et les caroténoïdes dans la membrane des thylakoïdes à proximité des pigments (Asada, 2006).

L’anion superoxyde (O2•-) n’est pas aussi réactif que les autres espèces réactives de l’oxygène car il ne réagit pas avec la plupart des molécules biologiques, contrairement au radical hydroxyle (Halliwell et Gutteridge, 2007). Il est formé au cours de différentes réactions enzymatiques et par l’auto-oxydation de composés tels que les quinones, les ferrédoxines et les thiols. Il est également produit au cours de la réaction de Mehler, qui permet de réguler le flux d’électrons dans la photosynthèse, et au cours de la respiration dans les mitochondries (Baker et al., 2006). Il est impliqué dans la peroxydation des lipides et des brins d’ADN. Il est responsable de l’inactivation de la catalase, de la glutathion peroxydase et de l’oxydation du NADPH (Halliwell et Gutteridge, 2007).

Figure 22: Formation des différentes espèces réactives de l'oxygène d’après Apel et Hirt (2004).

Tableau 4 : Production des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans une cellule végétale d’après Ramel (2009).

-Mitochondries O2•- Transfert des électrons de la respiration

O2•- Détoxication cellulaire Oxydation, hydroxylation, désamination, déhalogénation, et désaturation

Fd : ferrédoxine ; PQ : plastoquinone.

52 Le radical hydroxyle (OH^•) est considéré comme le plus réactif des oxydants dans les cellules végétales. Il peut se combiner avec presque tous les composants cellulaire par échange d’électrons, addition de doubles liaisons ou attachement d’un atome d’hydrogène (Halliwell et Gutteridge, 2007). Il est formé par la réaction de l’anion superoxyde avec le peroxyde d’hydrogène (la réaction de Haber-Weiss), et par la réaction d’ions fer ou cuivre ou de métaux lourds (plomb, cadmium) avec le peroxyde d’hydrogène (la réaction de Fenton) (Baker et al., 2006). Il peut initier des réactions en chaine avec de nombreuses molécules organiques, conduisant à la peroxydation des lipides, à l’inactivation d’enzymes, et à la dégradation des acides nucléiques (Young et al., 2002). Il est éliminé par l’α-tocophérol et l’ascorbate (Asada, 2006).

Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) est un faible agent oxydant ou réducteur et est généralement peu réactif en l’absence de métaux (Halliwell et Gutteridge, 2007). Il est formé au cours de la photorespiration (Nyathi et Baker, 2006). Il est responsable de l’inhibition des enzymes du cycle de Calvin et de certaines enzymes par oxydation des liaisons S-H (Baker et al., 2006). Il est éliminé par la catalase dans les peroxysomes et par l’ascorbate peroxydase dans les chloroplastes (Asada, 2006).

IV.2.2.2. La formation des espèces réactives de l’oxygène

Chez les plantes, les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont produites dans les chloroplastes, les mitochondries, les peroxysomes, la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique (Tableau 4).

Les cellules chlorophylliennes sont particulièrement exposées à la génération de ROS.

Le chloroplaste est souvent considéré comme étant la principale source de ROS (peroxyde d’hydrogène, anion superoxyde, oxygène singulet et radicaux hydroxyles) chez les organismes photosynthétiques (Asada, 2006; Edreva, 2005; Foyer et Noctor, 2003). La mitochondrie et la respiration sont une source de production d’anion superoxyde et de peroxyde d’hydrogène lors de la détoxication de ce dernier. Les peroxysomes sont le siège d’une forte activité.

Figure 23 : Formation d'espèces réactives de l'oxygène dans les chloroplastes, induite par la fermeture des stomates (1), un blocage de la translocation du saccharose au niveau du phloème (2), déficit en ATP (3), et l'inhibition de la chaine de transport (4). Fd, ferrédoxine ; FNR, ferrédoxine-NADP-réductase; PQ, plastoquinone ; PSI, photosystème I ; PSII, photosystème II d’après Grassmann (2002).

3 ADP

NADP+

ADP

O₂ O₂^•- H₂O₂

3O₂

1O₂

Chloroplaste

Phloème Epiderme de la feuille

Cycle de Calvin 1/2O₂+2e

-H₂O 4

54 métabolique centrée sur le métabolisme oxydatif (Corpas et al., 2001; Nyathi et Baker, 2006). Ils possèdent de nombreux systèmes antioxydants et prooxydants. Le peroxyde d’hydrogène est formé à la suite de plusieurs réactions dans les peroxysomes, la β-oxydation des acides gras, la photorespiration, le métabolisme de l’urée et lors de la détoxication de l’anion superoxyde par la superoxyde dismutase. L’anion superoxyde est quant à lui formé lors de la réaction de la xanthine avec l’oxygène et dans la chaine de transfert des électrons.

Les plantes possèdent plusieurs enzymes ou complexes enzymatiques, telles que les NAPDH-oxydases, les peroxydases végétales, les oxalates-NAPDH-oxydases, les amines-oxydases ou les oxydases péroxysomales, qui sont responsables de la production de ROS. La fonction de détoxication des cellules présente dans le réticulum endoplasmique fait intervenir de nombreux processus oxydants, tels que des oxydations, des hydroxylations, des désalkylations, des désaminations, des déshalogénations et des désaturations. Les réactions d’oxydation, catalysées par les cytochromes P450 mono-oxygénases (Coleman et al., 1997), génèrent des ROS et plus particulièrement de l’anion superoxyde.

IV.2.2.2.1. La production d’espèces réactives de l’oxygène au cours la photosynthèse

Les principales sources de ROS se situent au niveau des photosystèmes I (PSI) et II (PSII) dans les chloroplastes (Asada, 2006; Zhang et al., 2003). En conditions normales, le flux d’électrons provenant du centre réactionnel du PSI est dirigé vers le NADP⁺, qui une fois réduit, participe à la réduction du CO2 au niveau du cycle de Calvin.

Dans les tissus photosynthétiques (Figure 23), la fixation du CO2 est limitée par de nombreux stress abiotiques (Long et al., 1994; Murata et al., 2007). Les faibles et les fortes températures, la sécheresse, ainsi que de fortes salinités, limitent fortement la fixation du CO2. Cette limitation entraîne une diminution du transport des électrons dans la chaine photosynthétique. La limitation du cycle de Calvin diminue l’utilisation du NADPH et conduit à la diminution du NADP⁺, le principal accepteur d’électron au niveau du PSI. Les photosystèmes I et II sont maintenus dans un état réduit, ce qui se traduit par l’inactivation du PSII par inhibition et donc une diminution de la photolyse de l’eau en O2 et H⁺ (Demmig-adams et Adams, 1993; Krause, 1988; Murata et al., 2007; Powles, 1984). Mais surtout les

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55 électrons qui sont transférés vers l’oxygène moléculaire conduisant à la formation d’O2

puis d’H2O par dismutation (Asada, 1999). Lorsque l’énergie lumineuse est en excès, les plastoquinones sont dans un état réduit. Il y a formation de chlorophylle sous forme triplet, et par transfert d’énergie, formation d’oxygène singulet (¹O2) (Hideg et al., 2002). Les fortes intensités lumineuses peuvent donc endommager directement le PSII en produisant des ROS (Nishiyama et al., 2006; Takahashi et Murata, 2008). Une production d’O2

est également possible au niveau du PSII lors de la réduction de l’oxygène moléculaire par les plastoquinones (Cleland et Grace, 1999; Navari-Izzo et al., 1999; Zhang et al., 2003). En résumé, tout stress provoquant la fermeture des stomates, ou une diminution de la translocation du saccharose, est susceptible d’entrainer une augmentation de la production de ROS.

La superoxyde dismutase (SOD) est la première ligne de défense des plantes contre le stress oxydatif. Elle catalyse la dismutation de deux anions superoxydes formés, par exemple lors de la photosynthèse, en dioxygène et en peroxyde d’hydrogène.

2 O2

+ 2H⁺ O2 + H2O2

Le H2O2 formé est éliminé via le cycle ascorbate-glutathion et la catalase (Asada, 2006;

Dat et al., 2000; Scandalios, 2005).

AA : ascorbate réduit ; APX : ascorbate peroxydase ; DHA : déshydroascorbate ; DHAR : déshydroascorbate réductase ; GSSG : glutathion disulfide ; GSH : glutathion réduit ; GR : glutathion réductase ; H2O2 : peroxyde d’hydrogène ; MDHAR : monodéshydroascorbate réductase.

Figure 24: Formation de peroxyde d'hydrogène lors de la photorespiration d'après Foyer et al.

(2009). GO : glycolate oxydase ; PGP : phosphoglycolate phosphatase

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57 Le cycle de l’ascorbate-glutathion comprend quatre enzymes : l’ascorbate peroxydase (APX), la monodéshydroascorbate réductase (MDHAR), la déshydroascorbate réductase (DHAR) et la glutathion réductase (GR). Il est localisé au niveau des chloroplastes et permet d’éliminer le peroxyde d’hydrogène en excès généré au cours de la photosynthèse. La première enzyme du cycle ascorbate-glutathion est l’ascorbate péroxydase (APX). Elle catalyse la réduction de l’H2O2 en H2O en utilisant l’ascorbate comme donneur d’électrons pour former du monodéshydroascorbate et de l’eau. Dans les chloroplastes, au niveau du PSI, l’association des réactions catalysées par la SOD et l’APX constituent la réaction de Mehler, également connue sous le nom de cycle eau-eau. Le monodéshydroascorbate est réduit en présence de NADH par la monodéshydroascorbate réductase (MDHAR) en ascorbate. Le monodéshydroascorbate peut également être dismuté de manière non enzymatique en ascorbate et déshydroascorbate. Le déshydroascorbate (DHAR) est convertit en ascorbate et en glutathion oxydé (GSSG) par la déshydroascorbate réductase en utilisant le glutathion réduit comme donneur d’électron (GSH). La glutathion réductase (GR) permet de convertir le glutathion oxydé en présence de NADPH en glutathion réduit (Drew et al., 2007).

Le peroxyde d’hydrogène produit par la chaine de transfert des électrons, la β-oxydation peroxysomale et la photorespiration est éliminée par la catalase. C’est une enzyme majoritairement peroxysomale qui catalyse la dismutation de deux molécules de peroxyde d’hydrogène, en eau et en oxygène (Smirnoff, 1998).

2 H2O2 O2 + 2 H2O

IV.2.2.2.2. La production d’espèces réactives de l’oxygène au cours de la photorespiration

Lors de la photorespiration, la Rubisco, en présence de ribulose-1,5-bisphosphate, peut réagir avec l’O2 présent dans les chloroplastes pour produire du 2-phosphoglycolate. La phosphoglycolate phosphate le transforme en glycolate, qui est ensuite exporté dans le peroxysome (Foyer et al., 2009). La réaction d’oxydation du glycolate conduit à la formation

58 de glyoxylate et de péroxyde d’hydrogène (Figure 24) (Foyer et al., 2009; Nyathi et Baker, 2006). Ce dernier est éliminé par la catalase.

IV.2.2.2.3. La production d’espèces réactives de l’oxygène au cours de la respiration

Dans les cellules photosynthétiques, et en conditions de lumière, la production de ROS d’origine mitochondriale ne représente qu’une faible proportion de la production totale de ROS. Au contraire, à l’obscurité ou dans les tissus non photosynthétiques, les mitochondries peuvent devenir la source la plus importante de ROS (Rhoads et al., 2006). En effet, une partie de l’oxygène consommé par les cellules est convertie en ion superoxyde. Chez les plantes, 1% de l’oxygène absorbé est transformé en ROS et le reste est consommé par la respiration et réduit en eau (Moller, 2001).

La production de ROS dans les mitochondries est causée par la fuite d’électrons inhérente au fonctionnement même de la chaine respiratoire et à la fixation des électrons sur l’oxygène moléculaire, qui conduit à la réduction incomplète de l’O2 et à la formation de ROS (Figure 25) (Brookes, 2005). Cette fuite se fait au niveau de la NADH déshydrogénase Figure 25: Production d’anion superoxyde dans la chaine de transport des électrons de la membrane mitochondriale interne d’après Taiz Et Zeiger (2006).

AOX : oxydase alternative ; c : cytochrome c ; Complexe I : NADH déshydrogénase ; complexe II : succinate déshydrogénase ; complexe III : cytochrome bc1 ; complexe IV : cytochrome c oxydase ; complexe V : ATPase ; E1 et E2 : NAD(P)H déshydrogénase externe ; I1 : NADH déshydrogénase ; Q : pool d’ubiquinone.

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59 appartenant au complexe I (Turrens et Boveris, 1980) ainsi qu’au niveau du cytochrome bc1 du complexe III (Rich et Bonner, 1978). Bien que les principales sources de ROS soient les complexes I et III, les flavoprotéines du complexe II pourraient également contribuer à la formation d’ion superoxyde (Young et al., 2002). Cette production de ROS est indissociable du processus respiratoire et fortement modulée par les conditions environnementales (Moller, 2001). La production de ROS augmente chaque fois que le flux d’électrons traité par la cytochrome c oxydase est ralenti, et chaque fois que le flux d’électrons entrant dans la chaine de transport augmente au-delà de la capacité de la voie respiratoire, ce qui conduit à la formation d’un pool d’ubiquinone (Q) réduit (Rhoads et al., 2006). Le superoxyde formé sera ensuite transformé en H2O2 par dismutation spontanée ou par action de la superoxyde dismutase (Boveris et Chance, 1973).

IV.2.2.3. Le statut redox cellulaire

Le potentiel redox intracellulaire, ou statut redox, est la résultante de l’état redox des couples oxydo-réducteurs présents dans la cellule. Les réactions redox sont des processus métaboliques fondamentaux par lesquels les cellules convertissent et distribuent l’énergie qui est nécessaire au fonctionnement de la cellule (Noctor, 2006). Les cellules des plantes ont acquis des composants sensibles au statut redox qui agissent comme des baromètres sensibles aux changements environnementaux. Elles ont développé des mécanismes qui peuvent déclencher des changements redox pour altérer l’expression des gènes et les fonctions cellulaires (Noctor, 2006). Les conditions redox régnant dans les cellules sont évaluées par le rapport des concentrations sous des formes oxydées et réduites des couples redox (Noctor, 2006). Les couples redox GSH/GSSG et AA/DHA sont prépondérants du fait de leurs concentrations dans les cellules mais d’autres couples tels que NAD(P)/NAD(P)H TRXox/TRXred, Fdox/Fdred ou encore PQ/PQH2 (plastoquinone oxydée/réduite) sont également importants (Foyer et Noctor, 2005b).

Beaucoup d’enzymes de la voie de biosynthèse des caroténoïdes sont sensibles au statut redox. En effet, certaines enzymes telles que la 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate réductoisomérase, la phytoène désaturase, la ζ-carotène désaturase et la zéaxanthine

60 époxydase nécessitent du NADPH ou des rapports élevés en PQ/PQH2 pour fonctionner (Steinbrenner et Linden, 2003).

Il existe une interaction entre les ROS et le statut redox. L’augmentation du niveau de ROS provoque une oxydation partielle ou complète des composants cellulaires induisant de ce fait une modification du statut redox de la cellule (Mittler et al., 2004). Par exemple, le GSH et l’ascorbate sont capables de réduire directement l’O2

et le H2O2 et servent également de co-substrat aux enzymes antioxydantes ayant pour rôle de détoxifier les ROS.

Ainsi, par leur potentiel oxydant et par le biais de leur interaction avec les couples redox majoritaires, les ROS contribuent à l’établissement de potentiels redox intracellulaires. Le potentiel redox cellulaire détermine les proportions relatives des espèces oxydées ou réduites de chaque couple redox. Ces proportions dépendent du potentiel redox de ces couples. Cette fonction du potentiel redox cellulaire est particulièrement importante car l’activité de nombreuses protéines, et, en particulier de nombreux facteurs de transcription,

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